הסכם NCNPR-USDA-ARS המדעי המספר 58-6408-2-0009; פרס CDMRP מענק # W81XWH-09-2-0093 על ידי הצבא האמריקאי למחקר רפואי ואמצעי פיקוד.

1. לשמור ותת תרבות תאים THP1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור THP1 תאים ב- 1640 RPMI בינוני (עם 10% FBS ו-pH 7.4) על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 חממה 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים תת פעמים בשבוע כדי למנוע חריגה מספירת תאי 1x10 6 תאים / מ&quot;ל. זה חשוב כדי לשמור על יכולת השינוי שלהם. </li></ol> 2. לשמור ותת ישמניה donovani Promastigotes תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על L. donovani promastigotes (S1, מתח סודאן) בRPMI-1640 בינוני (ללא סודיום ביקרבונט ופירובט נתרן) עם 10% FBS ב26 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל &#39;תת תרבות donovani promastigotes פעמים בשבוע, עם ריכוז הגבוה ביותר תאים בטווח של 20-25x10 6 / promastigotes ml.Caution: כל אמצעי התקשורת והפתרונים יש להביא לטמפרטורת החדר לפני השימוש. </li></ol> 3. זריעה והתמיינות של התאים בTHP1 9Microplate 6-היטב ושקופיות תרבות זכוכית 16-קאמריות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן THP1 תרבות מדוללת עם ספירת תאים של 2.5x10 5 תאים / מ&quot;ל מתרבית תאים של ארבעה ימים בן (ספירת תאים לא תעלה על 10 6 תאים / מ&quot;ל) בRPMI-1640 עם FBS 10% חום מומת. הכין 20 מ&quot;ל של תרבות לכל צלחת 96 היטב ו4 מ&quot;ל של תרבות לכל שקופית קאמרית 16-כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף phorbol 12-13-myristate יצטט (PMA) (לבידול של THP1) להשעית תרבית תאים בדילול מלאה (10 מ&quot;ל μl/20 תרבות מהמניות של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בDMSO) (PMA ריכוז סופי בתרבות תאים צריך להיות מדוללת 25 ng / ml). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשוות את תמונת הניתוח-ספירת Assay-Digital---הישיר והטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay, להגדיר את המבחנים בו זמנית בצלחת ברורה, שטוחה תחתונה, 96-16-וגם קאמריים, זכוכית, שקופית התרבות מיקרוסקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 200 μl של תאי THP1-PMA-טופלו לכל באר או קאמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת עמ &#39;96-היטבlates ושקופיות קאמריות 16-גם ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 חממת הלילה כדי לאפשר בידול כמעט מוחלט של התאים. </li></ol> הערה: THP1 התאים, אשר בדרך כלל גדלים בהשעיה, הם מובחנים למקרופאגים חסיד. 4. זיהום של תאי THP1 השתנו עם Promastigotes donovani ישמניה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזיהום של תרבית תאים מובחנות THP1 עם promastigotes donovani ישמניה, רוב הטפילים צריכים להיות בשלב metacyclic תולעת (צורות גליליות ארוכות, ~ יום 5-6 תרבות הישנה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> THP1 תא 1:10 ליחס הטפיל הוא אופטימלי לזיהום הוא ב- Assay הדיגיטלי-ישיר-ספירת Image-ניתוח וPromastigote-Rescue-טרנספורמציה-Assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרבות מדוללת ל &#39; donovani promastigotes עם ספירה טפילה של טפיל 2.5x10 6 / מ&quot;ל (לTHP1 תאים: יחס טפילים = 1:10) מתרבות 5-6 בגיל יום ב- 1640 RPMI בינוני עם 2% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהשלב 3.5 (לאחר התמיינות הלילה של תרבית תאים THP1) להוציא את הצלחות ושקופיות קאמריות, להסיר את המדיום ולשטוף את תרביות תאי פעם עם 1640 RPMI בינוני סרום ללא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה קפדנית של PMA-טופל THP1 תאים עם סרום נטול חמים RPMI-1640 (~ 37 ° C) בינוני,, החלף את מדיום סרום ללא עם 200 μl של התרבות המדוללת ל &#39; promastigotes donovani (2.5x10 6 טפילים / מ&quot;ל) מצעד 4.3. הגדר את בארות הבקרה של THP1 תאים ללא טפיל והטפיל בלי THP1 תאים בכל צלחת ושקופיות קאמריות 16-כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הוספת הטפיל לתרבית תאי THP1, דגירת הצלחת ושקופיות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות כדי לאפשר את הטפילים להדביק את THP1 תאים המובחנים. </li></ol> 5. טיפול בהמקרופאגים נגועים בסמי בדיקה / תרכובות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחןAmphotericin B, Pentamidine וMiltefosine כתרופות נוגדות leishmanial סטנדרטיות להקרנה. הכן פתרוני מניות של התרופות / תרכובות בדיקה במים או DMSO כאמורים בטבלה מגיבה. בדוק כל מתחם סמים בגיל 6 ריכוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרתי לדלל (1:5) את התרופות הרגילות ותרכובות בדיקה בצלחת טריה 96 היטב או 2 צינורות מ&quot;ל (עבור שקופיות קאמריות) עם 1640 RPMI בינוני עם 2% FBS. התרופות / הריכוז מתחם בדיקה בצלחת זה הן 2X של ריכוזים סופיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את כלי התרבות והשקופיות קאמריות נגועים בL. promastigotes donovani (מצעד 4.5) לפחות 5 פעמים עם, בינוני סרום ללא RPMI-1640. הוסף מדיום התרבות μl 100 (RPMI-1640 עם 2% FBS) לכל באר / קאמרי. את הכביסות המרובות נחוצות כדי להבטיח הסרה מלאה של promastigotes שאינו מופנם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני μl 100 מסמי סדרה מדוללים תקניים אנטי leishmanial או תרכובות בדיקה לכל באר או קאמרי. הגדרת infecתאי THP1 טד שולטים ללא תרופות בו זמנית בכל שקופית צלחת / קאמרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלחות והשקופיות קאמריות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל48 שעות. </li></ol> 6. כתמי שקופיות קאמריות, הדמית פלורסנט מיקרוסקופ וניתוח תמונה לכימות זיהום והשפעה של טיפול תרופתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירת שעה 48, לשטוף השקופית הקאמרית 3 פעמים ב- 1640 RPMI בינוני סרום ללא. לקלף את תאי פלסטיק מהשקופיות ולתקן את התאים על ידי טבילת השקופיות במתנול למשך 30 שניות. השאר את השקופיות ביו ברדס מתחת לזרימת אוויר לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הירוק פתרון מכתים SYBR (5X) על ידי דילול (1:2,000) המניות (10,000 X) עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכתים את השקופיות בתנאים חשוכים עם גרין SYBR המדולל אני כתם פתרון במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר, לשטוף פעם אחת עם מים ולהשאיר את השקופיות תחת זרימת האוויר לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח coverslip כוס מלאה מעל staiשקופית נד בעזרת מדיום גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללכוד את התמונות הדיגיטליות של THP1 תאים: ללא זיהום (ריק), עם זיהום (שליטה), תאים נגועים טופלו בתרופות שונות סטנדרטיות או תרכובות בדיקה בדילולים שונים (3 איור, 5 ו 6)) באמצעות מיקרוסקופ ניקון אקליפס 90i ניאון ליווי על ידי תוכנת 3.2 אלמנט AR ש&quot;ח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את גרעיני מקרופאג (גדול) וגרעינים הטפילים (קטן עם kinetoplast) באמצעות ImageJ (איור 7), שהיא תכנית בפומבי זמינה, מבוססת ג&#39;אווה עיבוד תמונה שפותחה במכון הלאומי לבריאות <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">(http://rsb. info.nih.gov / ij / download.html).</a> בטא את הנתונים כמספר amastigotes כל 100 הפך THP1 תאים. </li></ol> 7. הטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay: תמוגה מבוקרת של L. המקרופאגים donovani Amastigotes נגועים<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף microplate 96-היטב מצעד 5.5 3 פעמים עם התרבות בינונית סרום ללא RPMI-1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין חומרי ניקוי שונים שנבדקו בריכוזים שונים, 0.05% טיפול SDS למשך 30 שניות הן אופטימליות עבור תמוגה מבוקרת (תמוגה תא מרבית עם אובדן מינימאלי של הכדאיות הציל &#39;טפילים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום סרום ללא מכל באר אחרי השטיפה האחרונה ולהוסיף 20 μl של RPMI-1640 (עם 0.05% SDS) לכל באר. נער את הצלחת למשך 30 שניות ולהוסיף 180 מלאים μl RPMI-1640 (עם 10% FBS) לכל באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלחות ב 26 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לטרנספורמציה של amastigotes חולץ לpromastigotes. </li></ol> 8. ניתוח הכמות של Promastigote שינה (alamarBlue assay) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירת 48 שעות ב 26 ° C, כל amastigotes החיות חולצה הופכים לpromastigotes (1D איור). הוסף 10 μl של alamarBlue לכל באר בעמ &#39;96-היטבlates. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלחות ב 26 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירת הלילה, לקרוא את הצלחות לפלואורסצנטי הסטנדרטי בFluostar גלקסי fluorimeter (טכנולוגיות מעבדת BMG) בעירור ננומטר 544, פליטת 590nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את עקומות תגובה במינון (צמיחת אחוזים לעומת ריכוז של מתחם תרופה או בדיקה) עם ExcelFit (תרשימים 7-9) והמחשוב IC 50/90 ערכי IC מהעקומות האלה (טבלה 1). </li></ol> 9. תקינה של תאי THP1 יחס טפילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחידויות בTHP1 תאים ליחס טפילים כדי לקבוע רגישות של assay. הערה: זיהום נמוך / גבוה מספרי טפילים / עלול לפגוע ברגישות ובהסלקטיביות של ההקרנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחידויות בTHP1 תאים ליחס טפילים על ידי ביצוע הפרוטוקול שתואר לעיל עבור זריעת THP1 תאים וזיהום promastigote ישמניה (סעיף 3 ו 4) מלבד שימוש הבדליחסי erent של THP1 תאים לטפילים כמו 1:1.25, 1:2.5, 01:05 ו1:10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את הניסוי בשתי שקופיות 16-קאמריים (לניתוח תמונה) וצלחת 96-היטב (עבור assay טפיל הצלה) פורמטים להשוואת הצלת הטפיל ומבחני ניתוח תמונה. </li></ol> 10. סטנדרטיזציה של חומרי ניקוי שונים לתמוגה תא מבוקרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המטרה העיקרית של ניסוי זה היא לייעל את הפרוטוקול לתמוגה מבוקרת של תאי THP1 להשיג THP1 תמוגה תאים מרביות / שלמה מבלי להשפיע על הכדאיות של טפילי amastigote חולצו באופן משמעותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את חומרי ניקוי שונים כגון 20 Tween, Tween 80, טריטון X-100, NP-40 וSDS בריכוזים שונים ומשך זמן שונה של טיפול (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> THP1 תאים ליחס טפילים הם 1:10 ותנאים אחרים הם דומים כמו 1-8 סעיפים לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק 0.05% SDS טיפול נוסף לזמן טיפול שונהs כדי לבצע אופטימיזציה נוספת תמוגה התא המבוקרת. </li></ol>

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis. Xii, 22-26 (2010).</li><li>Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+scenario+of+drug+development+for+leishmaniasis.">Current scenario of drug development for leishmaniasis.</a> Indian J. Med. Res. 123 (3), 399-410 (2006).</li><li>Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Resistance+in+Leishmaniasis.">Drug Resistance in Leishmaniasis.</a> Clinical Microbiology reviews. 19 (1), 111-126 (2006).</li><li>Mikus, J., Steverding, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+colorimetric+method+to+screen+drug+cytotoxicity+against+Leishmania+using+the+dye+AlamarBlue.">A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye AlamarBlue.</a> Parasitology International. 48 (3), 265-269 (2000).</li><li>Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Axenic+Amastigote+System+for+Drug+Screening.">An Axenic Amastigote System for Drug Screening.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 41 (4), 818-822 (1997).</li><li>Seifert, K., Escobar, P., Croft, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+anti-leishmanial+drugs+against+Leishmania+donovani+is+host+cell+dependent.">In vitro activity of anti-leishmanial drugs against Leishmania donovani is host cell dependent.</a> J. Antimicrob. Chemother. 65 (3), 508-511 (2010).</li><li>Kolodziej, H., Kiderlen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antileishmanial+activity+and+immune+modulatory+effects+of+tannins+and+related+compounds+on+Leishmania+parasitized+RAW+264.7+cells.">Antileishmanial activity and immune modulatory effects of tannins and related compounds on Leishmania parasitized RAW 264.7 cells.</a> Phytochemistry. 66 (17), 2056-2071 (2005).</li><li>Maia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+five+different+types+of+macrophages+by+Leishmania+infantum.">Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum.</a> Acta Tropica. 103 (2), 150-155 (2007).</li><li>Neal, R. A., Croft, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+for+determining+the+activity+of+compounds+against+the+intracellular+amastigote+form+of+Leishmania+donovani.">An in vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani.</a> J. Antimicrob. Chemother. 14, 463-475 (1984).</li><li>Abdullah, S. M., Flath, B., Presber, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+staining+procedures+for+the+flow+cytometric+analysis+of+U-937+cells+infected+with+different+Leishmania-species.">Comparison of different staining procedures for the flow cytometric analysis of U-937 cells infected with different Leishmania-species.</a> J. Microbiol Methods. 37 (2), 123-138 (1999).</li><li>Giorgio, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Detection+of+Leishmania+Parasites+in+Human+Monocyte-Derived+Macrophages:+Application+to+Antileishmanial-Drug+Testing.">Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (11), 3074-3078 (2000).</li><li>Mandal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+of+Leishmania+donovani+clinical+isolates+against+drug+using+a+colorimetric+&#946;+Lactamase+assay.">High throughput screening of Leishmania donovani clinical isolates against drug using a colorimetric &#946; Lactamase assay.</a> Indian J. Exp. Biol. 47 (6), 475-479 (2009).</li><li>Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+assay+for+Leishmania+amazonensis+promastigotes+expressing+multimeric+green+fluorescent+protein.">Microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein.</a> Parasitol. Res. 89 (4), 266-271 (2003).</li><li>Buckner, F. S., Wilson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+screening+compounds+against+Leishmania+Amastigote+Grown+in+macrophages.">Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania Amastigote Grown in macrophages.</a> Am. J. Trop. Med. 72 (5), 600-605 (2005).</li><li>Sereno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+perspectives+in+Leishmania+cell+based+drug-screening+procedures.">Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures.</a> Parasitol. Int. 56 (1), 3-7 (2007).</li><li>Gupta, S., Nishi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visceral+leishmaniasis:+experimental+models+for+drug+discovery.">Visceral leishmaniasis: experimental models for drug discovery.</a> Indian J. Med. Res. 133, 27-39 (2011).</li><li>Roy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episomal+and+stable+expression+of+the+luciferase+reporter+gene+for+quantifying+Leishmania+spp.+Infections+in+macrophages+and+in+animal+models.">Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. Infections in macrophages and in animal models.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 110 (2), 195-206 (2000).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

ישנן מספר שיטות זמינות לסריקת תרופות אנטי leishmanial מבוססת על מודלי macrophage-amastigote. מבחנים ניתן לעשות עם מקרופאגים שנאספו מחיות מארחות תאים כלומר הצפק exudate (PEC), תאי דם היקפיים (monocyte PBMC) 6 או עצם מקרופאגים מח נגזרות (BMM) או בשורות תאי monocytic כגון עכבר (J774 וRAW264.7 ) 7 ואנושיים (THP1, U937, HL-60) 8 תאי monocytic. המבחנים, המשתמשים בחלוקת תאי מארח, חייבים לוודא שהתופעות המבלבלות של פעילות תרופה בטפיל והן מספר תאי מארח נחשבות. המקרופאגים העיקריים הבדיל שנאספו ממקורות שונים כגון עכברים וחולדות שאינם מפרידים-בטבע, אבל הכנות התאים האלה לא יכולות להיות אוכלוסיות תאים הומוגניים. שורות תאי Monocytic תאים שמקורם-הן הומוגני בטבע והנם מודל טוב יותר להקרנה macrophage-amastigote המבוססת. מתוך שורות תאים monocytic שונות, diffeTHP1 תאי rentiated (קו אנושי חריף monocytic וקמיה של תאים) יכולים להיוצר monolayer הלא חלוקה, ומציעים חלופה אטרקטיבית למקרופאגים מבודדים ראשוניים. הקרנת macrophage-amastigote מבוססת ניתן לעשות זאת בכמה דרכים. הערכה מיקרוסקופית קלסית המבוססת על תא וטפיל ישיר לספור 9 היא עבודה אינטנסיבית. העדר האוטומציה מגביל את התועלת של בדיקה זו. ספירת התאים היא זמן רב ועשויה לתת קביעה מדויקת של 50 ערכי IC מאז קביעת כדאיות טפיל באמצעות הליך הכתמה קשה. צבעי ניאון רבים ונוגדנים חד שבטיים יכולים להיות מועסקים למבחני זרימת cytometric 10, 11, אבל המבחנים האלה הם גם מוגבלים בגלל רגישות והגבלה של פחות מרווח הזמן של תרופה לטיפול ליום אחד בלבד. ישנם מספר מבחני גן הכתב זמין לכימות הצמיחה של amastigotes התאי 12,13,14. אוטומטהקרנת אד עשויה להיות אפשרית באמצעות גנים מדווחים, אבל המבחנים הללו יש גם חסרונות מסוימים. ראשית, רוב המבחנים אלה מחייבים בחירת תרופה לשמירה על ביטוי episomal של הגנים המדווחים, שלא יכול להיות אידיאלי לניסוי הקרנת סמים. הדרך שבה גן הכתב הוא הציג יכול גם להשפיע על התכונות הפיזיולוגיות של הטפיל ולהשפיע על ההקרנה. אם גן הכתב הוא חלק מפלסמיד episomal, התפוקה היחסית של כתב יכולה להיות תלויה במספר העותק של פלסמיד transfected (אשר משתנה מתא לתא) ולא בפעילות של התרופה 14. חלק מטפילי הכתב אשר הפכו טפילים לא צריכים ללחץ ברירה כדי לשמור על גן הכתב, אולם יכול להיות שיש השלכות ביולוגיות או על ידי שיבוש הארכיטקטורה הגנטית או רק על ידי הנוכחות של חלבוני הכתב הזר 15. בחלק ממבחנים מבוססי גן כתב, ישסוגיות של פעילות רגישות ורקע 16. והכי חשובים, רבים ממבחני כתב ביטוי הגנים, במיוחד אחד עם GFP כתב gene15, לא יכולים להבדיל בין amastigotes תאי החיים והמתים. מבחנים מבוססים על גן הכתב לוציפראז יכולים להבחין בין חיים והמתים amastigotes התאי, אבל מצע וחיץ תמוגה תא למבחנים אלה הם יקרים להקרנה בקנה מידה גדולה 17. כדי להתגבר על חסרונות ומגבלות של מבחני מיון קודמים macrophage-amastigote מבוסס אלה, פתחו ואופטימיזציה assay טפיל ההצלה והשינוי הזה. בדיקה זו מבוססת על THP1 תאים, אשר יש הומוגניות טובה והם אינם מפרידים-בטבע, כמו תאי מארח. Assay הטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay המתואר כאן הוא להשוות את assay המבוסס על ספירת תמונה דיגיטלית-ניתוח ישיר של amastigotes התאי. מיקרוסקופיה פלורסנט ודסק&quot;ש, דיגיטלי ולדמייןניתוחי דואר על ידי ImageJ לספירת הפרש של גרעיני מקרופאג וגרעיני הטפיל שפרו את assay הספירה המיקרוסקופית נוספים. לכידת התמונות תחת מסנני אור ניאון וניגודיות פער התערבות (DIC) מסננים שפרה את איכות התמונה הדיגיטלית לספירה מדויקת יותר של טפילים תוך תאיים. תמונות שניהם ניאון ודסק&quot;ש ניתן התמזגה כדי להשיג את התמונות הדיגיטליות בקווי מתאר ברורים macrophage סלולריים וגרעינים תאיים ניאון. גרעיני מקרופאג וגרעיני הטפיל יכולים להיות מוכרים באופן דיפרנציאלי עם ImageJ. לכן, שניהם---ספירה-Assay תמונה דיגיטלי-ניתוח ישיר וטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay יש פוטנציאל לאוטומציה ויישום להקרנה בקנה מידה גדולה. השלבים הקריטיים בטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay הם: (א) כביסות חוזרות ונשנות של THP1 תרביות תאים לאחר חשיפה לpromastigotes ישמניה, כדי להבטיח הסרה מוחלטת כמעט שאינם מתמחהpromastigotes alized ו( ב) תמוגה מבוקרת של התאים הנגועים THP1 עם SDS. שני הצעדים עלולים גם להיות נשלטו עם אוטומציה ולא צריך להתפשר עם תפוקה של assay. השלב השני של כביסות, לאחר חשיפה של ישמניה THP1 התאים הנגועים לבדיקת הסמים / התרכובות מסיר את הטפילים הנותרים אינם מופנמים, אם בכלל. הטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay מציע יתרונות משמעותיים על פני, גן קיים מיקרוסקופי כתב ומבחני ניתוח תמונה. הבדיקה היא פשוטה, חזקה, ושחזור, יכולה להיות אוטומטית להקרנה בקנה מידה גדולה, ולכן צריך להיות יישום חשוב בהקרנה של ספריות תרכובות גדולות לגילוי סמים אנטי leishmanial חדש. יתר על כן, הבדיקה יכולה להיות מיושמת גם להערכת infectivity של קליני, כמו גם, שבודדה במעבדה של ישמניה במבחנה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Phorbol 12-13-Myristate יצטט (PMA) </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> P1585 </td><td> דרוש להתמיינות של תאי THP1. </td></tr><tr><td> RPMI-1640 בינוניים </td><td> Invitrogen </td><td> 23400021 </td><td></td></tr><tr><td> מערכת שקופיות הקאמרית Lab-TEK (16 קאמריים) </td><td> Thermo Scientific Nunc </td><td> 178599 </td><td></td></tr><tr><td> , שטוחת תחתית, צלחות ברור 96-Well </td><td> BD פלקון </td><td> 353075 </td><td> צלחות לבצע בדיקת צלחת 96-היטב </td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> A4888 </td><td> תרופה סטנדרטית נוגדת leishmanial מתמוססת בDMSO (2 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> Pentamidine Isothionate שאLT </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> P 0547 </td><td> תרופה סטנדרטית נוגדת leishmanial מתמוססת בDMSO (2 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> Miltefosine </td><td> EMD Biosciences ארה&quot;ב </td><td> 475841 </td><td> תרופה סטנדרטית נוגדת leishmanial מתמוססת ב- 1640 RPMI בינוני סרום חינם (להכין טרי) (2 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> Stibogluconate נתרן </td><td> EMD Biosciences ארה&quot;ב </td><td> 567565 </td><td> תרופה סטנדרטית נוגדת leishmanial להכין בRPMI-1640 עם 4% FBS. (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> סולפט נתרן Dodecyl </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> L 5750 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי </td><td> NIKON </td><td> ECLIPSE 90i </td><td></td></tr><tr><td> פלואורסצנטי Microplate Reader </td><td> BMG </td><td> פולאר סטאר גלקסי </td><td></td></tr><tr><td> הרכבה בינונית </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> M 1289 </td><td></td></tr><tr><td>lamarBlue </td><td> עבד Serotec </td><td> BUF012 B </td><td></td></tr><tr><td> SYBR הירוק </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> S 9430 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט </td><td> הפישר Sci. </td><td> 523500 </td><td></td></tr><tr><td> פירובט נתרן </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> P2256 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> אטלנטה ביולוגית </td><td> S11050H </td><td></td></tr><tr><td> 20 Tween </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> P6474 </td><td></td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> NP-40 </td><td> Calbiochem </tד&gt; <td> 492016 </td><td></td></tr></tbody></table>

a parasite rescue and transformation assay for antileishmanial screening against intracellular leishmania donovani amastigotes in thp1 human acute monocytic leukemia cell line

Leishmaniasis הוא אחת המחלות המוזנחות ביותר בעולם, במידה רבה, המשפיע על העניים שבעניים, בעיקר במדינות מתפתחות. מעל 350 מיליון בני אדם נחשבים בסיכון להידבקות leishmaniasis, וכ 2 מיליון מקרים חדשים מתרחשים 1 שנתי. ישמניה donovani הוא הסוכן סיבתי לleishmaniasis הקרבי (VL), הצורה הקטלנית ביותר של המחלה. הבחירה של תרופות זמינות לטיפול בleishmaniasis מוגבלת 2; טיפולים שוטפים לספק יעילות מוגבלת ורבים מהם רעילים במינונים טיפוליים. בנוסף, רוב התרופות לטיפול הקו הראשונות כבר אבד השירות שלהם בשל הגדלת עמידות לתרופות מרובה 3. הצינור הנוכחי של תרופות הנוגדות leishmanial גם כן מתרוקן בחומרה. מאמצים מתמשכים יש צורך להעשיר את צנרת גילוי חדשה נגד leishmanial סמים, ומאמץ זה מסתמך על הזמינות של דגמים מתאימים בהקרנה חוץ גופייה. ילדה = &quot;jove_content&quot;&gt; בpromastigotes המבחנה 4 מבחני amastigotes axenic 5 משמשים בעיקר לסריקת תרופות אנטי leishmanial עם זאת, ייתכן שאינו מתאים בשל הבדלים משמעותיים סלולריים, פיסיולוגיים, ביוכימי ומולקולרי בהשוואה לamastigotes התאי. מבחנים עם מודלי macrophage-amastigotes נחשבים קרוב ביותר לתנאי pathophysiological של leishmaniasis, ולכן הם המתאימים ביותר להקרנה חוץ גופייה. תאים מובחנים, בלתי מתחלק, אדם חריפים monocytic וקמיה (THP1) (להפוך אטרקטיביים) חלופה למקרופאגים העיקריים המבודדים וניתן להשתמש בו לפעילות אנטי assaying leishmanial של תרכובות שונות נגד amastigotes התאי. כאן, אנו מציגים assay טפיל הצלה והמהפך עם THP1 תאים מובחנים נגועים במבחנה עם ישמניה donovani לסינון תרכובות טהורות ולדרבן טבעייםתמציות ucts וקביעת היעילות נגד amastigotes ישמניה התאית. הבדיקה כוללת את השלבים הבאים: (1) בידול של THP1 תאי המקרופאגים לבלתי מתחלק-, (2) דלקת של מקרופאגים עם ל &#39; donovani metacyclic promastigotes, (3) טיפול בתאים נגועים בסמי בדיקה, (4) תמוגה מבוקרת של מקרופאגים נגועים, (5) שחרור / הצלת amastigotes ו( 6) טרנספורמציה של amastigotes החי לpromastigotes. Assay היה מותאם באמצעות טיפול חומר ניקוי לתמוגה מבוקרת של תאים THP1 ישמניה נגועים כדי להשיג הצלה כמעט מוחלטת של amastigotes התאי קיימא עם השפעה מינימאלית על היכולת שלהם להפוך לpromastigotes. מקרופאג השונה: יחסי promastigotes נבדקו להשיג זיהום מרבי. כימות הזיהום בוצעו באמצעות הפיכתה של חיה, הציל ישמניה amastigotes לpromastigotes והערכה של הצמיחה שלהם על ידי עלאםassay fluorometric arBlue בmicroplates 96-כן. בדיקה זו היא להשוות בשימוש כיום גן המיקרוסקופי, המהונדס כתב ומבחני ניתוח דיגיטליים של תמונות. בדיקה זו היא איתנה ומודדת את amastigotes תאי החיות בהשוואה לגן הכתב ומבחני ניתוח תמונה, שלא יכול להבדיל בין חיים והמתים amastigotes בלבד. כמו כן, הבדיקה אומתה עם פנל נוכחי של תרופות הנוגדות leishmanial ויושמה בהצלחה להקרנה בקנה מידה הגדולה של תרכובות טהורות וספרייה של שברי מוצרים טבעיים (Tekwani et al. לא פורסם).

Watch this Scientific Journal Video about A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic L

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

טפיל הצלה והמהפך assay עם THP1 תאים הנגועים<em&gt; במבחנה</em&gt; עם<em&gt; ישמניה donovani</em&gt; כבר מותאם לסריקת תרופות אנטי leishmanial. הבדיקה כרוכה בהתמיינות של תאי THP1, זיהום עם promastigotes, טיפול עם תרופות בדיקה, תמוגה מבוקרת של מקרופאגים הנגועים, חילוץ amastigotes, שינוי ולצמיחת promastigotes promastigote ניטור והתרבות עם assay fluorometric.

Assay הצלה וטרנספורמציה טפילה להקרנת Antileishmanial נגד תאי<em&gt; ישמניה donovani</em&gt; Amastigotes בקו THP1 אדם חריף Monocytic וקמיה של תאים

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

a-parasite-rescue-transformation-assay-for-antileishmanial-screening

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

22.1K Views.  University of Mississippi. טפיל הצלה והמהפך assay עם THP1 תאים הנגועים במבחנה עם ישמניה donovani כבר מותאם לסריקת תרופות אנטי leishmanial. הבדיקה כרוכה בהתמיינות של תאי THP1, זיהום עם promastigotes, טיפול עם תרופות בדיקה, תמוגה מבוקרת של מקרופאגים הנגועים, חילוץ amastigotes, שינוי ולצמיחת promastigotes promasti...

Video: A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of lesion size is a hard procedure and animals show difficulty to eat, breathe and move because of the lesion. In order to optimize the hamster model for cutaneous leishmaniasis, young adult male and female golden hamsters (Mesocricetus auratus) were injected intradermally at the dorsal skin with 1 to 1.5 x l07 promastigotes of Leishmania species and progression of subsequent lesions were evaluated for up to 16 weeks post infection. The golden hamster was selected because it is considered the adequate bio-model to evaluate drugs against Leishmania as they are susceptible to infection by different species. Cutaneous infection of hamsters results in chronic but controlled lesions, and a clinical evolution with signs similar to those observed in humans. Therefore, the establishment of the extent of infection by measuring the size of the lesion according to the area of indurations and ulcers is feasible. This approach has proven its versatility and easy management during inoculation, follow up and characterization of typical lesions (ulcers), application of treatments through different ways and obtaining of clinical samples after different treatments. By using this method the quality of animal life regarding locomotion, search for food and water, play and social activities is also preserved.

Optimization of the experimental hamster model for cutaneous leishmaniasis by intradermal injection of Leishmania promastigotes at the dorsal skin. This approach is useful during inoculation, follow-up, characterization of lesions, application of treatments and obtaining of clinical samples. Locomotion, search for food and water, play and social activities are preserved.

Leishmaniasis עורית בעור הגב של אוגרים: מודל שימושי להקרנה של תרופות Antileishmanial

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to efflux the DNA-binding dye Hoechst 33342. This "side population" of cells can be identified using flow cytometric methods after the Hoechst 33342 dye is excited by an ultraviolet (UV) laser. The side population of many cell types contains stem- or progenitor-like cells. However, not all cell types have an identifiable side population. Danio rerio, zebrafish, have a robust in vivo model of T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL), but whether these zebrafish T-ALLs have a side population is unknown. The method described here outlines how to isolate the side population cells in zebrafish T-ALL. To begin, the T-ALL in zebrafish is generated via the microinjection of tol2 plasmids into one-cell stage embryos. Once the tumors have grown to a stage at which they expand into more than half of the animal's body, the T-ALL cells can be harvested. The cells are then stained with Hoechst 33342 and examined by flow cytometry for side population cells. This method has broad applications in zebrafish T-ALL research. While there are no known cell surface markers in zebrafish that confirm whether these side population cells are cancer stem cell-like, in vivo functional transplantation assays are possible. Furthermore, single-cell transcriptomics could be applied to identify the genetic features of these side population cells.

Here, we describe a technique to isolate the side population cells from a zebrafish model of myc-induced T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). This side population assay is highly sensitive and is described for zebrafish T-ALL, but it may be applicable to other malignant and non-malignant zebrafish cell types.

בידוד של האוכלוסייה בצד Myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה דג הזברה

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate hosts, respectively. While pathogenic symptoms of leishmaniasis can vary widely, from benign cutaneous lesions to highly fatal visceral disease forms depending on the infective species, all Leishmania species reside inside host macrophages during the vertebrate stage of their lifecycle. Leishmania infectivity is therefore directly related to its ability to invade, survive and replicate within parasitophorous vacuoles (PVs) inside macrophages. Thus, assessing the parasite&#39;s ability to replicate intracellularly serves as a dependable method for determining virulence. Studying leishmaniasis development using animal models is time-consuming, tedious and often difficult, particularly with the pathogenically important visceral forms. We describe here a methodology to follow the intracellular development of Leishmania in bone marrow-derived macrophages (BMMs). Intracellular parasite numbers are determined at 24 h intervals for 72 - 96 h following infection. This method allows for a reliable determination of the effects of various genetic factors on Leishmania virulence. As an example, we show how a single allele deletion of the Leishmania Mitochondrial Iron Transporter gene (LMIT1) impairs the ability of the Leishmania amazonensis mutant strain LMIT1/&#916;Lmit1 to grow inside BMMs, reflecting a drastic reduction in virulence compared to wild-type. This assay also allows precise control of experimental conditions, which can be individually manipulated to analyze the influence of various factors (nutrients, reactive oxygen species, etc.) on the host-pathogen interaction. Therefore, the appropriate execution and quantification of BMM infection studies provide a non-invasive, rapid, economical, safe and reliable alternative to conventional animal model studies.

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

All pathogenic Leishmania species reside and replicate inside macrophages of their vertebrate hosts. Here, we present a protocol to infect murine bone marrow-derived macrophages in culture with Leishmania, followed by precise quantification of intracellular growth kinetics. This method is useful for studying individual factors influencing host-pathogen interaction and Leishmania virulence.

כימות של צמיחה תאיים בתוך המקרופאגים הוא מהיר, שיטה אמינה להערכת של התקפה אלימה של טפילים לישמניה

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

פרוטוקול שלפוחית היניקה לימודים אדם T-cell האחזור תגובות In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and maintained in culture, provides an exciting opportunity to facilitate the modeling of the epithelial response to enteric infections. In vivo, intestinal epithelial cells (IECs) play a key role in regulating intestinal homeostasis and may directly inhibit pathogens, although the mechanisms by which this occurs are not fully elucidated. The cytokine interleukin-22 (IL-22) has been shown to play a role in the maintenance and defense of the gut epithelial barrier, including inducing a release of antimicrobial peptides and chemokines in response to infection.
We describe the differentiation of healthy control hiPSCs into iHOs via the addition of specific cytokine combinations to their culture medium before embedding them into a basement membrane matrix-based prointestinal culture system. Once embedded, the iHOs are grown in media supplemented with Noggin, R-spondin-1, epidermal growth factor (EGF), CHIR99021, prostaglandin E2, and Y-27632 dihydrochloride monohydrate. Weekly passages by manual disruption of the iHO ultrastructure lead to the formation of budded iHOs, with some exhibiting a crypt/villus structure. All iHOs demonstrate a differentiated epithelium consisting of goblet cells, enteroendocrine cells, Paneth cells, and polarized enterocytes, which can be confirmed via immunostaining for specific markers of each cell subset, transmission electron microscopy (TEM), and quantitative PCR (qPCR). To model infection, Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 are microinjected into the lumen of the iHOs and incubated for 90 min at 37 &#176;C, and a modified gentamicin protection assay is performed to identify the levels of intracellular bacterial invasion. Some iHOs are also pretreated with recombinant human IL-22 (rhIL-22) prior to infection to establish whether this cytokine is protective against Salmonella infection.

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived intestinal organoids offer exciting opportunities to model enteric diseases in vitro. We demonstrate the differentiation of hiPSCs into intestinal organoids (iHOs), the stimulation of these iHOs with cytokines, and the microinjection of Salmonella Typhimurium into the iHO lumen, enabling the study of an epithelial invasion by this pathogen.

באמצעות תא גזע המושרה האדם Pluriפוטנטי-המעי הנגזר אורגנואידים ללמוד ולשנות את התא אפיתל הגנה מפני סלמונלה ופתוגנים אחרים

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

הצלה של וירוס רקומביננטי Zika מתוך כרומוזום מלאכותי בקטריאלי cDNA שיבוט

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to visceral lesions. Currently, 12 million people are estimated to be infected with Leishmania worldwide and over 1 billion people live at the risk of infection. Leishmania amazonensis is endemic in Central and South America and usually leads to the cutaneous form of the disease, which can be directly visualized in an animal model. Therefore, L. amazonensis strains are good models for cutaneous leishmaniasis studies because they are also easily cultivated in vitro. C57BL/6 mice mimic the L. amazonensis-driven disease progression observed in humans and are considered one of the best mice strains model for cutaneous leishmaniasis. In the vertebrate host, these parasites inhabit macrophages despite the defense mechanisms of these cells. Several studies use in vitro macrophage infection assays to evaluate the parasite infectivity under different conditions. However, the in vitro approach is limited to an isolated cell system that disregards the organism&#39;s response. Here, we compile an in vivo murine infection method that provides a systemic physiological overview of the host-parasite interaction. The detailed protocol for the in vivo infection of C57BL/6 mice with L. amazonensis comprises parasite differentiation into infective amastigotes, mice footpad cutaneous inoculation, lesion development, and parasite load determination. We propose this well-established method as the most adequate method for physiological studies of the host immune and metabolic responses to cutaneous leishmaniasis.

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Here, we present a compiled protocol to evaluate the cutaneous infection of mice with Leishmania amazonensis. This is a reliable method for studying parasite virulence, allowing a systemic view of the vertebrate host response to the infection.

ב Vivo זיהום עם לישמניה מלכותית כדי להעריך טפיל התקפה אלימה בעכברים

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...