המחברים מבקשים להודות למיכאל Alifrangis ואולה Abildtrup לgenotyping של טפילים וכריסטינה הולמת לסיוע טכני מעולה. עבודה זו מומנה על ידי הווארד יוז רפואי במכון (מענק 55005511), הקרן לונדבק (מענק R9-A840) ועל ידי נילס בוהר הקרן.

1. דור של אריתרוציטים הנגועים הנבחרים טרי עבור assay זה, את התוצאות הטובות ביותר מתקבלות בעת שימוש בתרבויות שנבחרו זה עתה לביטוי פני PfEMP1 חלבון. בניסוי המסוים הזה 3D7 פ שושלת falciparum נבחרה באמצעות נוגדנים ספציפיים כמתואר 1 בעבר. יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 μl הקציר של תאי דם ארוז מפ falciparum התרבות המכילה 2-5% אקספלורר שלב מאוחר על ידי צנטריפוגה XG ב 800 דקות ל8 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות גלולה בדם של 2 מ&quot;ל 37 ° C 0.75% פתרון חם ג&#39;לטין בצינור סטרילי 14 מ&quot;ל, ולצאת לדקות 15-20 על 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר IE אינו הנגוע וטבעת שלבים למשקעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את IE בשלב מאוחר, כלומר את השלב העליון, לתוך צינור חדש מ&quot;ל 14 ולשטוף פעמים עם 10 מ&quot;ל של 37 ° C התקשורתיים חם RBC-שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 50 μl של אנטי PfEMP הספציפי1 נוגדנים ב2 מ&quot;ל של 37 ° C תקשורת RBC-לשטוף ולסנן סטריליים החמימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את IE השטוף בשלב מאוחר עם נסיובי עוקר בדילול המלא בצינור סטרילי 14 מ&quot;ל ודגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה XG ב 800 דקות ל8 בטמפרטורת חדר, ולשטוף פעמים עם 10 מ&quot;ל של 37 ° C התקשורתיים חם RBC-שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף 50 μl של חלבון Dynabead השעיה פעמים עם תקשורת RBC-שטיפה באמצעות-15 DynaMaq מגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את Dynabeads ב300 תקשורת μl RBC-לשטוף ולהוסיף אותם לאקספלורר השטוף בשלב מאוחר. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הצינור למגנט DynaMaq-15. השאר למשך 1-2 דקות ולהסיר את כל הנוזלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את Dynabeads במיליליטר 4-5 המדיה RBC-שטיפה. העברת הצינור בחזרה אל המגנט ולהשאיר אותה במשך 1-2 דקות לפני ההסרה כל הנוזלים. חזור על שלב כביסת פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את החרוזים המכובסים לו 25 סנטימטרים 2 סטרילי תרבותלאסק מכיל 200 תאי דם μl ארוז טרי אדומים. הוסף 5-6 מ&quot;ל של Albumax תקשורת בתרבות. אחסן לילה בCO 5% 2 ב 37 ° C. </li></ol> יום 2 <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את Dynabeads מהתרבות כאשר IE שנבחר פלישה חוזרת של תאי הדם האדומים הטריים על ידי העברה כל התרבות לצינור סטרילי 14 מ&quot;ל. שים את הצינור אל-15 DynaMaq המגנט ולצאת ל1-2 דקות. לאחר מכן, שופך את כל הנוזל בחזרה לבקבוק התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות לכמה שפחות מחזורים ככל האפשר עד parasitemia של 5-10% וטפילים הן בringstage. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקספלורר צריך להיות מנותח על ידי FACS כדי לוודא שהפנוטיפ המשטח הנכון, ביטוי חלבון כלומר של או and/orPF11_0008 PFD1235w הושג 1. </li></ol> 2. הכנת הבדיקות בדיקות antisense RNA נוצרו מהאזורים המשתנים ביותר של PFD1235w וvar PF11_0008 &lt;/ Em&gt; גנים מפ הדנ&quot;א הגנומי 3D7 falciparum. דנ&quot;א הוגבר באמצעות PCR ומשובט לתוך וקטור pSPT18 או 19 לשעתוק, בהתאמה לפי התיאור של היצרן (רוש). הבדיקות (580 זוגות בסיסים (bp) ו590 BP באורך) תויגו עם Digoxigenin (DIG) או ביוטין באמצעות DIG-RNA תיוג קיט או מיקס תיוג ביוטין רנ&quot;א, בהתאמה. אנחנו אשרנו את הספציפיות של הבדיקות הן על ידי ניתוח כתם הצפון ועל ידי ניתוח יחיד, תווית דגי 1. 3. למרוח דקים וקיבוע של טפילים לפני הכלאה באתר יום 1 כל הצעדים נעשים בסביבת RNase-חופשיה וכל המגיבים הם RNase חינם או מראש טופל-עם diethyl pyrocarbonate (DEPC) או RNase Zap (Invitrogen). את השקופיות וחוטרי כיסוי יש לנקות עם אלכוהול כדי להסיר שומן ייצור שיורית. חשוב לבצע את הפרוטוקול ללא כל הפסקה בין צעדיםעל מנת למזער את הסיכון לזיהום nuclease. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות סרט דם דק בשיטת ההפצה הסטנדרטית 3. באמצעות העדשה אובייקטיבי שמן 100x של המיקרוסקופ, לספור את IE ולחשב את האחוז של IE בתרבות. בדקו ששלבי הטפיל הם בתיאום מקורב, בטבעת והשלבים מוקדמים של trophozoite מחזור IE. אלה הם mRNA הגן var להביע מראש שכפול, שלבים חד nucleate, ומתאים למבחנים בודדים סלולריים דגי שעתוק מסוג זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 50 μl של התרבות הטפילה, בparasitemia של 5-10%, לצינור 1.5 מ&quot;ל RNase ללא אפנדורף. צנטריפוגה לדקות 1 ב2000 סל&quot;ד בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה ולהוסיף pH 50 μl PBS 7.2 במי DEPC טופל. להתסיס את הצינור בעדינות. חזור על שלב שקיעת צנטריפוגלי פעמים כדי לשטוף את התאים חינם מתקשורת ופסולת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות ארבע מריחות דקות באיכות טובה. לכל כתם, כתם להפוך לאחד אל11 קוטר מ&quot;מ אחד הטוב של 4 שקופיות טובות, ארבע שקופיות זכוכית כלומר בסך הכל, במכסת מנוע RNase חינם (שלב קריטי). גל מחליק לרגע באוויר לייבוש. הפוך שלוש שקופיות נוספות לשקופית שלילית בקרות אחד להכתמת בדיקה אחת לכל גן רלוונטי אחר באמצעות בדיקה ספציפית, שקופית אחרת לטיפול RNase ושקופית המכילה 3 אקספלורר לא מבטא את הגן של עניין. השאר את השקופיות לייבוש על הספסל במשך 10-20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הסרטים הדקים על ידי הוספת 60 μl של פתרון קיבעון המכיל paraformaldehyde 4% וחומצה אצטית קרחונים 5% לבארות. השאר למשך 10 דקות על הספסל בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות ב2x SSPE חיץ למשך 5 דקות על ידי תסיסה עדינה בטמפרטורת חדר. בקצרה סילוק נוזלים עודפים על ידי נגיעה בבארות המכילות את התאים בעדינות במגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את השקופיות עם פפסין 0.01% ב0.01 M HCl עבור 2 דקות על 37 מעלות צלזיוס (צעד מאוד קריטי). שטוף את השקופיות ב2x SSPE למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תמיסת RNase לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל. לכסות על כתמי בקרה השליליות עם 60 μl של פתרון RNase. דגירה במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לשטוף את השקופיות ב2x SSPE למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנה מייד לצעד ההכלאה. </li></ol> 4. כלאה של בדיקות RNA על שקופיות קבועות יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קאמרי הכלאה, כגון ThermoStar 100 HC4 או תיבת קצה פיפטה ריקה לשים בתנור נקי, על ידי ריסוס עם RNase Zap ומנגב אותו נקי במגבת נייר. מלא את הערוצים של חדר ההכלאה או התחתון של התיבה עם מי DEPC טופל כדי לוודא שהשקופיות לא תתייבשנה במהלך הכלאה. סגור את החדר ומחמם עד 48 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את החקירות בפתרון ההכלאה לריכוז סופי של 12 ng / μl. לפגל פתרון החללית על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בבלוק חימום. מייד לצנן על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה אוויר תיבש את השקופיות אחרי כביסת SSPE 2x. מוציא בזהירות את הנוזל עודף סביב הבארות במגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תא ההכלאה ולמקם את השקופיות בבית הבליעה. תחול אחת או בשתי הבדיקות בהיקף כולל של 60 μl לטוב. זהירות לכסות טיפת הנוזל עם תלוש כיסוי RNase-חופשי באמצעות מלקחיים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את התא ולהכליא את השקופיות ב48 מעלות צלזיוס במשך לפחות 16 שעות במשך הלילה. </li></ol> 5. נטיית נוגדן והגברת קרינה יום 2 השלבים הבאים מבוססים על מערכת TSA פלוס פלטת קרינה מפרקין אלמר. כל הצעדים נעשים בטמפרטורת חדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות 3 פעמים בTNT חיץ למשך 5 דקות עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הבארות ב150 μl של חיץ TNB למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את נוגדן HRP-מצומדות α-DIG במאגר TNB ביחס של 1:100 ונוגדן HRP-מצומדות α-ביוטין במאגר TNB, ביחס של 1:500. הסר את כל חיץ TNB עודף מהשקופיות עם ממחטת נייר. כאשר גילוי 2 תעתיקים בו זמנית, שני הנוגדנים יכולים ללכת מייד. למרוח כמות כוללת של 100 μl של פתרון נוגדן לTNB היטב ולכסות בזהירות עם פתק כיסוי. דגירת השקופיות עבור 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התלושים לכסות בזהירות. שטוף את השקופיות בTNT חיץ 3 פעמים למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל את FITC-fluorophore בריאגנט ההגברה tyramide ביחס של 1:500 ולהחיל 100 μl של פתרון לכל באר. לכסות את הבארות עם תלושי כיסוי ודגירה במשך 12 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה מחליק בזהירות ולשטוף את השקופיות 3 פעמים למשך 5 דקות בחיץ TNT ידי תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל את Cyan3-fluorophore בריאגנט ההגברה tyramide ביחס של 1:500. הוסף לμl 100גם בפתרון זה. לכסות את הבארות עם תלושי כיסוי ודגירה במשך 12 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה מחליק בזהירות ולאחר מכן לשטוף את השקופיות במהירות על ידי טבילה בחיץ TNT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות 3 פעמים עם חיץ TNT למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות במהירות במי DEPC טופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את השקופיות לייבוש באוויר. הר את השקופיות עם ריאגנט אנטי לדעוך מכיל DAPI. לאטום את הפינות של תלושים לכסות עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את השקופיות מוכנות כעת למיקרוסקופיה. שמור את השקופיות מכוסות בנייר האלומיניום ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס, אם הניסוי הוא להסתיים ביום למחרת. איטום מלא של הצדדים של השקופיות יכול להתבצע 24 שעות לאחר ההחלה מגיבה נגד הדהייה. זה יאפשר את השקופיות שצלמו עד שבוע לאחר הפרוטוקול הושלם. </li></ol> 6. ויזואליזציה של בדיקות הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מיקרוסקופ. מיקרוסקופ immunofluorescence סטנדרטי הוא sufficient לסוג זה של ניסוי, אבל אם יש לך גישה למיקרוסקופ confocal אתה יכול גם להשתמש בזה לתמונות 3D או כדי לקבל קטעי וידאו של התאים המוכתמים שלך. אפשר מיקרוסקופ כדי להתחמם במשך 15-30 דקות. כבה את המחשב ואת התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את איכות הצביעה במיקרוסקופ immunofluorescence. בחר מקום המכיל כמה טפילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הרווח של כל ליזר באופן ידני. התאם פיקסל להתעכב כדי 4-6 מ &#39;-1 של -1 והצעדים ל512 x 512 פיקסלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונת בדיקה באמצעות המסגרת למבדה. להסתגל רווח הליזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח מינימום של 20 תמונות טובות של תאים בודדים ניאון. לפחות 2-5 תמונות של שדה המכיל 5-20 טפילים נדרשות על מנת לקבל סקירה הוגנת של אחוז הטפילים חיוביים. </li></ol>

<ol>
	<li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1.">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).</li><li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization.">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li><li>Cheeseborough, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> District Laboratory Practice in Tropical Countries. , (2006).</li><li>Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcription+of+duplicated+var2csa+gene+copies+in+individual+Plasmodium+falciparum+parasites.">Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites.</a> Genome Biol. 10, R117 (2009).</li><li>Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+associated+sense+and+antisense+noncoding+RNAs+are+transcribed+from+the+var+gene+family+of+virulence+genes+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> RNA. 15, 116-127 (2009).</li><li>Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+heterochromatin+propagation+and+histone+acetylation+control+mutually+exclusive+expression+of+antigenic+variation+genes+in+malaria+parasites.">Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites.</a> Cell. 121, 25-36 (2005).</li><li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections.">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).</li><li>Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+non-coding+RNA+are+transcribed+from+the+centromeres+of+Plasmodium+falciparum+and+are+associated+with+centromeric+chromatin.">Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin.</a> J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).</li><li>Thompson, J., Sinden, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+Pbs21+mRNA+during+sexual+development+of+Plasmodium+berghei.">In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).</li><li>Thompson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+RNA+in+blood-+and+mosquito-stage+malaria+parasites.">In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites.</a> Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).</li><li>Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+of+the+intra-erythrocytic+cell+cycle+of+Plasmodium+falciparum+and+the+role+of+the+centriolar+plaques+in+asynchronous+mitotic+division+during+schizogony.">The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony.</a> Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).</li><li>Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

ניתוח דגי רנ&quot;א, בניגוד לשיטות כמו סופג צפון וRT-PCR, מאפשר אפליה של תעתיקי mRNA ספציפיים ברמת התא הבודדה. זה מאפשר להבחין בין תאי תעתיק פעילים ולא פעילים, בדוגמה זו, פ falciparum הטפיל פרוטוזואה בתוך תאי דם אדומים אנושיים. תצפיות כאלה כל תא הן לעתים הכרחיות ויכולות לחשוף דפוסי תעתיק חשובים ורומן 1. למרות שיטות דגי RNA אחרות כבר תארו 4-10, יש כבר צורך בפיתוח פרוטוקול חדש ומעודן למחקר של שעתוק mRNA var סימולטני בפ falciparum. באמצעות בדיקות asRNA ככלים לזיהוי, את הדפוסים מיוחדים הזמניים של פעילות mRNA יכולים להיות מקומיים בקלות בתאים. בנוסף, בדיקות asRNA יכולות לשמש גם במערכות ניסיוניות אחרות שיתמכו בייחודם 1. מכה קריטית אחרתפרמטרי פורמאליות שחשובות בעת פיתוח פרוטוקול חדש כוללים קיבוע וpermeabilzation של התאים. צעדים אלה הוגדרו על ידי בדיקה אמפירית ריאגנטים כימיים שונים כפי שהוצע על ידי מחברים אחרים 5. אנחנו הגענו למסקנה שעל ידי שילוב paraformaldehyde המקשר האיטי פועל הצלב יחד עם החומצה אצטית מקבעת קרישה אנחנו יכולים להשיג שימור טוב של מורפולוגיה הרקמות. בנוסף, התבררנו לנו שמראש חוסם את התאים לפני שמוסיף את הבדיקות לא הייתה צורך בכך, בדומה לדגים אחרים תארו רנ&quot;א פרוטוקולים 5. יתר על כן, בפרוטוקול הנוכחי אנו משתמשים שטיפות עדינות, פרוטאז קל (פפסין) בסכומים נמוכים ותקופת דגירה קצרה כדי לאפשר לחללית ואת הנוגדנים כדי לפזר לתוך הגרעין ולהכליא עם mRNA המוצמד לחדר המיון, מזעור ניזק לקרומים סמוכים (איור 2a1-2a4). בנוסף, דגי RNA ואת התמונות ברזולוציה הגבוהה שנוצרו על ידי camerמצורף לconfocal מיקרוסקופ מגלה אם תא מסוים הוא חיובי או לא מכתים וגם נותן מידע רב ערך על היחסים מרחביים בין antisense RNA המוכתם והגרעין המוכתם DAPI. כפי שהוחלט בתמונות בדמות 2a4, mRNA מופיע שיש לצרף לצד הגרעין, כנראה בendoplasmic reticulum, ולא על גבי זה, כצפוי בדמות ה-DNA-FISH 11-12. מחקרים של תאים בודדים דורשים תצפיות של טפילים רבים ובנקודתי זמן שונים כדי לקבל תוצאה מובהקת סטטיסטי. לכן, ניתוח דגי RNA הוא טכניקה רבה ולא זמן שדורשת סבלנות וניסוי וטעייה, במידה ניכר כדי לכייל את הטכניקה. כמו דגי RNA הוא טכניקה של פרמטרים רבים מדריך בעיות ירי אל השלבים העיקריים של פרוטוקול זה מוצג בטבלת 1. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בעיה </td><td> Cau האפשריse </td><td> המלצה </td></tr><tr><td> אות חלשה או אין אות </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביטוי mRNA נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> mRNA שפלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חללית היא מושפלת, ביעילות מסומנת או נמוך מדי בריכוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמפרטורת הכלאה גבוהה מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול פפסין זמן רב מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים אינם permeabilized מספיק. </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את ביטוי החלבון על ידי FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבוד בתנאים חופשיים RNase ולהשתמש בפתרונות רק טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם בדיקת איכות של החללית מתויגת על ג&#39;ל ולהשוות לרנ&quot;א בקרה שכותרת. הפוך סדרת טיטרציה של ריכוז החללית בדגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיך את חום הכלאת שלבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפחית את אורך טיפול פפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאריך את גיד פפסיןאורך tment או לנסות חומר ניקוי אחר. </li></ul></td></tr><tr><td> עניים סלולריים שימור </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> parasitaemia גבוה מדי או טפילים לחוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרטים עבים מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקה קשות שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים על שקופיות deattached. </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תרבות טפילה בריאה על ידי שמירה על parasitemia תחת 10% ושינוי בתקשורת הסלולרית כל יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל את התרבות הטפילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את השקופיות עם אלכוהול ולחכות לפחות 10 דקות עבור שקופיות לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מוכן טרי-פורמלדהיד סעיף ו / או להגדיל את אורך דגירת paraformaldehyde. </li></ul></td></tr><tr><td> רקע גבוה </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חללית ריכוז גבוה מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטיפה מספקת שלטפילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתפוצץ shizonts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביסות הכלאת הודעה לא מספיקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ חסימה הוא מזוהם או לא יעיל. </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך סדרת טיטרציה של ריכוז החללית בדגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הטפילים פעמים לפני הכנת שכבות דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנכרן את התרבות בצורה הדוקה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיל את המספר ו / או אורך של כביסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ חסימה חדש. נסה אחר, מגיבים ריכוז חסימה או להאריך את תקופת החסימה </li></ul></td></tr><tr><td> RNase הביקורת שטופלה היא חיובית </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון RNase אינו פעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוז RNase נמוך מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגירה הייתה קצרה מדי. </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן RNase solu חדשtion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את הריכוז. הפוך סדרת טיטרציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאריך את תקופת טיפול RNAse. </li></ul></td></tr><tr><td> זיהוי חיובי כוזב של טפילי בקרה שליליים </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבדיקה אינה ספציפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפילים לא מבטאים את ה-mRNA זוהה על ידי החללית. </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את הספציפיות של הבדיקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו שטפיל הקו משמש הוא את האדם הנכון וטרי שנבחר. </li></ul></td></tr></tbody></table> טבלת 1. הדרכת Troobleshooting.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> סיגמא / אולדריץ </td><td> 338826-100 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> Albumax מדיה: 1640 פתרון גלוטמין RPMI </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 המ&quot;ל RPMI 1640 פתרון 5 מ&quot;ל גלוטמין </td></tr><tr><td> Albumax תקשורת: Gentamycin גופרת Albumax-פתרון </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2.5 מ&quot;ל gentamycin גופרה 50 מ&quot;ל Albumax-פתרון </td></tr><tr><td> Albumax-פתרון: Hypoxanthine </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> H9377 </td><td> 0,8 גרם Hypoxanthine </td></tr><tr><td> Albumax-פתרון: AlbuMAX השני </td><td> אניnvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200 גרם Albumax </td></tr><tr><td> Albumax-פתרון: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 4 הליטר RPMI 1640 ממס עם מגנט במקסימום. 50 ° C. סנן לעקר ולאחסן ב -20 ° C בaliquots. </td></tr><tr><td> Amberlite </td><td> סיגמא </td><td> A5710-110g </td><td> שרף לdeionize פוראמיד. </td></tr><tr><td> הצמוד peroxidase אנטי ביוטין עז PAB </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן אנטי Dig </td><td> נובוס ביולוגי </td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> ריאגנט אנטי לדעוך עם DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> תקשורת ההרכבה יש לרפא עבור 24 שעות לפני שהוא סגר את השקופית לחלוטין. </td></tr><tr><td> ביוטין רנ&quot;א תיוג מיקס </td><td&gt; רוש </td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td> מצלמה דיגיטלית </td><td> מראה דיגיטלי ניקון DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> מנזל-גלזר </td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td> 25 משטח תרבות בקבוק 2 סנטימטר Nunclon </td><td> Nunc </td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td> Fluka / סיגמא </td><td> 32490-100 מ&quot;ל </td><td> 1 המ&quot;ל DEPC במי 1000 מ&quot;ל deinonized. הוסף בר מערבבים ומערבבים במשך 12 שעות. חיטוי למשך 30 דקות. </td></tr><tr><td> מצלמה דיגיטלית </td><td> מראה דיגיטלי ניקון DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> חלבון Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> מגנט DynaMaq-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 123-01D </td><td></td></tr><tr><td> פוראמיד bioultra 99% </td><td> Fluka/ סיגמא </td><td> 47671-1l-F </td><td> פוראמיד deionized: 5 גרם של שרף חילוף יונים לכל 100 מ&quot;ל של פוראמיד. מערבב 30 דקות. לסנן דרך נייר Whatman. </td></tr><tr><td> . ג&#39;לטין 0 75% פתרון: ג&#39;לטין </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G2500 </td><td> 3.75 גר &#39;ג&#39;לטין 500 המ&quot;ל בRPMI 1640. חום עד 56 מעלות צלזיוס להמסה. סנן לעקר כאשר 56 ° C. חנות ב -20 ° C בaliquots. </td></tr><tr><td> . ג&#39;לטין 0 75% פתרון: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 3.75 גר &#39;ג&#39;לטין 500 המ&quot;ל בRPMI 1640. חום עד 56 מעלות צלזיוס להמסה. סנן לעקר כאשר 56 ° C. חנות ב -20 ° C בaliquots. </td></tr><tr><td> פתרון גלוטמין: L-glutamin </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G3126 </td><td> 14.6 גלוטמין גרם לליטר ב500 מ&quot;ל 0,9% NaCl. להתמוסס, מסנן שלterilize ולאחסן ב -20 ° C בaliquots. </td></tr><tr><td> פתרון גלוטמין: HCl </td><td> סיגמא </td><td> H1758 </td><td> 14.6 גלוטמין גרם לליטר ב500 מ&quot;ל 0,9% NaCl. להתמוסס, לסנן לעקר ולאחסן ב -20 ° C בaliquots. </td></tr><tr><td> פתרון הכלאה: פוראמיד ביו אולטרה 99% SSC 20x </td><td> Fluka / סיגמא </td><td> 47671-1l-F </td><td> סה&quot;כ 20 מ&quot;ל, לשמור קפוא ב -20 ° C בaliquots 10 פוראמיד deionized מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פתרון הכלאה: התרכיז של 50x Denhardt </td><td> סיגמא </td><td> D2532 </td><td> 20xSSC 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פתרון הכלאה: ריאגנט שמרים tRNARoche חסימה </td><td> סיגמא </td><td> R-6750 </td><td> 2 מ&quot;ל של 50x Denhardt 250 20 מ&quot;ג למ&quot;ל μl שמרי tRNA </td></tr><tr><td><sטרונג&gt; פתרון הכלאה: DNA זרע הסלמון </td><td> Fluka / סיגמא </td><td> 31149-106GF </td><td> 0.4g רוש חסימת מגיב 1 מ&quot;ל של 10 מ&quot;ג לכל דנ&quot;א זרע סלמון מ&quot;ל (קריטי: לפגל הסלמון spermDNA בגיל 96 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפני שמוסיף לפתרון ההכלאה) </td></tr><tr><td> מכליא ThermoStar 100 HC4 </td><td> Quantifoil המכשירים GmbH </td><td> 1004-0011 </td><td> יכול להיות מוחלף על ידי תאי הכלאה חופשיות RNase מרופדים במי DEPC תנור הכלאה ו. </td></tr><tr><td> טבילת שמן UV שקוף פלואורסצנטי חופשי </td><td> סיגמא </td><td> 10976-1EA </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ immunofluorescence או confocal </td><td> ניקון D-Eclipse TE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nailpolish </td><td> ניתן להשיג בכל בית מרקחת </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC deionized H 2 O </td><td></td><td></td><td> pH Ajust ל -7.4 160 גרם 4 גרם 23 גרם 4 גרם 1 הליטר </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde 4% </td><td> Fluka / chemika </td><td> 76240 </td><td> 4 גרם PFA ב80 המ&quot;ל PBS / DEPC. חום עד 65 מעלות צלזיוס עד שPFA נמס. הוסף 20 המ&quot;ל PBS, מאפשר הפתרון לצינון. התאם את ה-pH ל -7.4. לסנן. חנות בaliquots ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde 4% / חומצה אצטית 5% </td><td></td><td></td><td> 950 paraformaldhyde μl + 50 חומצה אצטית μl </td></tr><tr><td> עכלן </td><td> סיגמא / אולדריץ </td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td> מצומדות peroxidase אנטיביוטין </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC-לשטוף מדיה: 1640 פתרון גלוטמין RPMI </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 1640 פתרון מיליליטר RPMI 5 מ&quot;ל גלוטמין </td></tr><tr><td> RBC-לשטוף תקשורת: סולפט Gentamycin </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2.5 מ&quot;ל gentamycin גופרה </td></tr><tr><td> RNase </td><td> סיגמא / אולדריץ </td><td></td><td> הפוך פתרון מניית מ&quot;ל 10 מ&quot;ג /. </td></tr><tr><td> 1.5 צינור RNase החופשי מ&quot;ל </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNase Zap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> שקופיות 4 בארות 11mm </td><td> Thermo Scientific </td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20x: NaCl </td><td> סיגמא / אלהיידריך </td><td> S9625 </td><td> M 3 NaCl (175 גר &#39;/ ליטר) 0.3M Na 3 ציטראט x H 2 O (88 ג&#39;/ ליטר) התאם ל -7.0 pH עם 1M HCl </td></tr><tr><td> SSC 20x: מייבשי ציטראט נתרן </td><td> סיגמא / אולדריץ </td><td> W302600 </td><td> M 3 NaCl (175 גר &#39;/ ליטר) 0.3M Na 3 ציטראט x H 2 O (88 ג&#39;/ ליטר) התאם ל -7.0 pH עם 1M HCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaCl </td><td> סיגמא / אולדריץ </td><td> S9625 </td><td> 175.3 גרם NaCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: Nah 2 PO 4 </td><td> סיגמא / אולדריץ </td><td> S0751 </td><td> 27.6 גרם לאא 2 PO 4. </td></tr><tr><td> SSPE 20x: 4 EDTA אבקה </td><td></td><td></td><td> 9.4 גרם אבקת EDTA מוסיף מי DEPC, להתאים pH 7.4. אוטומטיClave ל20 דקות </td></tr><tr><td> TNB חיץ: TNT חיץ </td><td></td><td></td><td> 10 מ&quot;ל TNT חיץ </td></tr><tr><td> TNB חיץ: ריאגנט חסימה </td><td></td><td></td><td> מגיב חסימת 0.05g כדי לפזר את מגיב החסימה, מחמם את התמיסה ל 60 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת עם ערבוב. חנות ב -20 ° C. (נגזר פרקין אלמר TSA-הפרוטוקול). </td></tr><tr><td> TNT חיץ: טריס / HCl </td><td> סיגמא </td><td> T1503 </td><td> 1M טריס / HCl, 8.0 pH </td></tr><tr><td> TNT חיץ: NaCl </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> S9625 </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> TNT חיץ: Tween20 </td><td> סיגמא </td><td> 93773 </td><td> 5 M NaCl 30 מ&quot;ל 1 המ&quot;ל DEPC DH 2 O869 מ&quot;ל התאם pH ל -7.5 בטמפרטורת חדר. (נגזר פרקין אלמר TSA-הפרוטוקול). </td></tr><tr><td> TSA בתוספת מערכת Cyanine3 / fluorescein </td><td> פרקין אלמר </td><td> NEL753000IKT </td><td> קראו את הפרוטוקול מTSA פלוס מערכת פלטת פלואורסצנטי בקפידה לפני תחילת הניסוי. </td></tr><tr><td> צינורות 14 מיליליטר סטרילי </td><td> Almeco - Aps LAB CM </td><td> 91016 </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of single-cell gene transcription by rna fluorescent in situ hybridization (fish)

הידבקות של אריתרוציטים Plasmodium falciparum הנגועים (IE) לקולטנים אנדותל אדם במהלך זיהומי מלריה מתווכת על ידי ביטוי של PfEMP1 גרסות חלבונים המקודדות על ידי גני var. הפלואידים פ falciparum הגנום מטפח כ 60 גני var שונים אשר אחד בלבד כבר האמינו שעבד לכל תא בכל פעם בשלב הדם של הזיהום. איך רגולציה סותרת כזה של שעתוק הגנים var מושגת לא ברור, כפי שהוא זיהוי גני var בודדים או תת קבוצות של גנים הקשורים לvar קולטנים שונים והתוצאה של מחייב הפרש בתוצאה הקלינית של פ זיהומי falciparum. לאחרונה, הפרדיגמה שעתוק מוציאות כבר נקראה בספק על ידי מבחני שעתוק המבוססים על פ פרט זיהוי תמליל falciparum בinf אחתתאי האריתרוציטים ected באמצעות רנ&quot;א ניאון כלאה באתר (FISH) ניתוח של שעתוק הגנים var ידי הטפיל בגרעינים בודדים של פ falciparum 1-IE. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע המתודולוגיה RNA-FISH לניתוח של שעתוק הגנים var בגרעינים בודדים של פ falciparum נגוע אריתרוציטים אדם. השיטה מבוססת על השימוש בdigoxigenin וביוטין שכותרתו RNA באמצעות בדיקות antisense TSA פלוס מערכת פלואורסצנטי פלטת 2 (פרקין אלמר), ניתוחים מיקרוסקופים ונבחר טריים פ falciparum IE. בשיטת כלאה באתר ניתן להשתמש כדי לפקח על שעתוק ורגולציה של מגוון רחב של גנים הביע בשלבים השונים של פ מחזור חי falciparum וניתן להתאמה למינים אחרים מלריה טפיל ואורגניזמים אחרים וסוגי תאים.

איור 1 מדגים תרשים זרימה של השלבים העיקריים ומשך הזמן של המתודולוגיה דגי רנ&quot;א. סדרה של תמונות מייצגות של ניסויים וגם גרועים השתמרו מוכתמים mRNA דגים באמצעות פ אחת falciparum אקספלורר מוצגים באיור 2. protozoan התאי זו יש גרעין קטן (1-1.5 קוטר מיקרומטר) שהוכתם כחול עם DAPI. עשרים וארבע שעות לאחר פלישה כדורית אדומה בפ falciparum תהליך רביית השסע, חלוקה גרעינית כלומר, מתחיל. איתור דגים אופטימלי של שעתוק הגנים var מתרחש בסביבות 10-22 שעות למחזור הזה 48 שעתי תוך האריתרוציטים מוסס. בדיקות בדרך להכליא לmRNA מינים המופיעים בסמוך לגוף הגרעיני הראשי, במה שהוא כנראה reticulum endoplasmic מעטפה הקשורים גרעיני. את התמונות באיכות הטובה בשורת תכנית FITC-(ירוק) וCyan3-(אדום) בדיקות מתאימות לPFD1235w וP הכותרתF11_0008 גני var, בהתאמה, בפ בחר הכפול falciparum תת קו, 3D7 PFD1235w/PF11_0008. Co-לוקליזציה של הגנים היא גלויה, אך אינה מוחלטת. שורת B מציג הכלאה ירודה של שתי הבדיקות לטפילים שיש להם או מושפל או חדל במידה רבה לתעתוק mRNA var. בשורת C, הכלאת דגים טובה מתקבלת אך השימור הסלולרי הוא עני, כפי שמוצג על ידי התפשט קשים וצבירה של טפילים. <img src="/files/ftp_upload/4073/4073fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. תרשים זרימת ניסוי דגי רנ&quot;א. תרשים הזרימה ממחיש את הנקודות והעיתוי העיקריים של הליך הדגים. <img src="/files/ftp_upload/4073/4073fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. תמונות confocal של RNA-דגים בפ בחר כפול falciparum המציין simultanous מרשעתוק NA של שני גנים var השונים שכותרתו עם שני FITC (ירוק) או אות Cyan3 (אדום). מכתים DAPI (כחול) מציין את ה-DNA הגרעיני הטפיל. השורה האנכית A1, B1 ו C1 להראות את תמונות שידור של הטפילים. 5 מיקרומטר סרגל קנה מידה.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH at JoVE.com

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

פלואורני<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים) כדי לזהות תעתיקי mRNA בתאים בודדים מאפשרת ניתוח של פעילות polygenic כגון שעתוק סימולטני של חבר אחד או יותר של<em&gt; Var</em&gt; משפחת multigene ב<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; אריתרוציטים נגועים<sup&gt; 1</sup&gt;. הטכניקה ניתנת להתאמה, וניתן להשתמש בסוגים שונים של גנים, תאים ואורגניזמים.

ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

analysis-single-cell-gene-transcription-rna-fluorescent-situ

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

15.3K Views.  University of Copenhagen. פלואורני באתר הכלאה (דגים) כדי לזהות תעתיקי mRNA בתאים בודדים מאפשרת ניתוח של פעילות polygenic כגון שעתוק סימולטני של חבר אחד או יותר של Var משפחת multigene ב Plasmodium falciparum אריתרוציטים נגועים 1. הטכניקה ניתנת להתאמה, וניתן להשתמש בסוגים שונים ש...

Video: Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. Each of these features can be accomplished with in situ hybridization to mRNAs within cells. Here we present a radioactive in situ hybridization method modified from Clayton et al. (1988)1 that has been working successfully in our lab for many years, especially for adult vertebrate brains2-5. The long complementary RNA (cRNA) probes to the target sequence allows for detection of low abundance transcripts6,7. Incorporation of radioactive nucleotides into the cRNA probes allows for further detection sensitivity of low abundance transcripts and quantitative analyses, either by light sensitive x-ray film or emulsion coated over the tissue. These detection methods provide a long-term record of target gene expression. Compared with non-radioactive probe methods, such as DIG-labeling, the radioactive probe hybridization method does not require multiple amplification steps using HRP-antibodies and/or TSA kit to detect low abundance transcripts. Therefore, this method provides a linear relation between signal intensity and targeted mRNA amounts for quantitative analysis. It allows processing 100-200 slides simultaneously. It works well for different developmental stages of embryos. Most developmental studies of gene expression use whole embryos and non-radioactive approaches8,9, in part because embryonic tissue is more fragile than adult tissue, with less cohesion between cells, making it difficult to see boundaries between cell populations with tissue sections. In contrast, our radioactive approach, due to the larger range of sensitivity, is able to obtain higher contrast in resolution of gene expression between tissue regions, making it easier to see boundaries between populations. Using this method, researchers could reveal the possible significance of a newly identified gene, and further predict the function of the gene of interest.

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

This protocol is successfully used to quantitatively detect levels and spatial patterns of mRNA expression in multiple tissue types across vertebrate species. The method can detect low abundance transcripts and allows processing of hundreds of slides simultaneously. We present this protocol using expression profiling of avian embryonic brain formation as an example.

רדיואקטיבי באתרו הכלאה לזיהוי תבניות ביטוי מגוונות גנים רקמות

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...