אנו מודים אן דודסון, סטפני היינריך עצה כיצד למטב את פרוטוקול smFISH, אקסבייר Darzacq בשביל לעזור עם פלטפורמת ניתוח, Haiyan הואנג לקבלת הצעות על ניתוח סטטיסטי. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות של המשפחה (5-FY15-99), הספסל צדקה סומך (00027344), קרן מחקר הסרטן של דיימון ראניון (35-15) וקרן גלן EÜ, של ה-NSF בוגר מחקר מלגת מענק מס DGE-1106400 לשם פורשים.

הערה: כל המאגרים ואמצעי התקשורת בשימוש פרוטוקול זה מפורטים בטבלה1. פרטי הספק של ריאגנטים רשום את הטבלה של חומרים.
יום 1/יום 1-2:
הערה: עבור תרבות וגטטיבי, לגדול תאים יתר600 של 0.4-0.6 במדיום המועדפת. תרבות meiotic, לגרום לתאים עוברים מיוזה בשיטה המועדפת (בדרך כלל culturing ב יתר600 של 1.85).
1. לטעום קיבוע ועיכול
<ol><li>לתקן את סך של ~3.5 OD600 של תאים ב- 3% פורמלדהיד.<ol>
<li>לתרבות וגטטיבי, להוסיף 5.52 מ"ל של תרבות µL 480 של 37% פורמלדהיד צינורות חרוט 15-mL.</li>
		<li>תרבות meiotic, להוסיף 1840 µL התרבות µL 160 פורמלין 37% 2-mL microcentrifuge צינורות. היפוך ~ 5 פעמים כדי לערבב. התראה: פורמלדהיד הוא רעיל. לטפל ולחסל לפי תקנות מוסדיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>במקום צינורות על תוף רולר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. עבור דגימות meiotic, לאחר תיקון בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות, להמשיך לתקן בן לילה הלעפה תרוטרפמט 4, סיבוב. הערה: הקיבעון לילה מגבירה את הפארמצבטית ואיכות הנתונים smFISH השיג עבור דגימות meiotic. צריך להיות מותאם זמן קיבעון.</li>
	<li>בעוד הדגימות מטפלים, להפשיר 200 מ"מ Vanadyl Ribonucleoside תסביכים (VRC)-65 הלעפה תרוטרפמט לפחות 10 דקות.</li>
	<li>להכין מיקס מאסטר עיכול בשפופרת 15-מ ל: עבור מדגם 1, מערבבים µL 425 מ B מאגר עם 40 µL של 200 מ מ VRC (התחמם עד 65 הלעפה תרוטרפמט); לקבלת דוגמאות 5, מערבבים 2125 µL של B מאגר עם µL 200 מ מ 200 VRC (התחמם עד 65 הלעפה תרוטרפמט). מערבולת ~ 5 s כדי באופן מלא resuspend את VRC לפני הוספת לתערובת הראשית, אשר תופיע ירוק חום בהיר לאחר VRC תוספת. הערה: תוספת של VRC במהלך עיכול משפר מרקם של תוצאות smFISH, פוטנציאל על ידי עיכוב את הזיהום נוקלאז שהציג את התערובת zymolyase, אשר מטוהר מכל תמצית גולמי. צריך להיות מותאם כמות VRC נדרש בשלב זה.</li>
	<li>לקבלת דוגמאות וגטטיבי, centrifuge הצינורות ב g x ~ 1057 למשך 3 דקות. לקבלת דוגמאות meiotic (לאחר קיבוע לילה), צנטריפוגה-21,000 g x עבור 1.5 מינימלית Decant או תשאף את תגובת שיקוע פורמלדהיד לטמיון. הערה: כל השלבים צנטריפוגה מבוצעות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>Resuspend התאים ב- 1.5 מ ל B מאגר קר על-ידי pipetting למעלה ולמטה או היפוך הצינורות, כקבוצה – עלים לערבב. העברת דגימות צמח צינורות 2-mL לאחר resuspension.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 21,000 x g עבור 1.5 מינימלית להסיר את עיקר הנוזל על ידי השאיפה ואקום או pipetting, משאיר מאחור ~ 100 µL.</li>
	<li>Resuspend התאים 1.5 מ ב מאגר קר</li>
	<li>צנטריפוגה ב 21,000 x g עבור 1.5 מינימלית להסיר את עיקר הנוזל על ידי השאיפה ואקום או pipetting, משאיר מאחור ~ 100 µL.</li>
	<li>Resuspend התאים ב- 1.5 מיליליטר קר מאגר ב צנטריפוגה ב 21,000 x g עבור 1.5 מינימלית וביופסיה הנוזל לחלוטין על ידי ואקום או pipetting.</li>
	<li>Resuspend תאים µL 425 מיקס מאסטר עיכול, בקצרה מערבולת כדי resuspend. להוסיף 5 µL של zymolyase 10 מ"ג/מ"ל 100T כל שפופרת. הערה: מערבולת zymolyase בכל פעם לפני הוספת הצינורות. להוסיף zymolyase כל שפופרת בנפרד, במקום להוסיף לתערובת הראשית. שני צעדים לעזור לשמור על מערכת העיכול עקביות בין צינורות כי zymolyase ארגונייט שוקע במהירות.</li>
	<li>מערבולת 2-3 s לערבב. מקם את הצינורות על תוף רולר ולאחר לעכל-30 הלעפה תרוטרפמט למשך 15-30 דקות. תאי צמח, meiotic בשלבים המוקדמים, זה בדרך כלל לוקח ~ 15 דקות, meiotic prophase, meiotic חטיבות, זה בדרך כלל לוקח ~ 30 דקות. הערה: לבדוק במיקרוסקופ כל 5 דקות אחרי 15 דקות, ולהפסיק את העיכול כאשר ~ 80% של תאים מופיעות שאינם שקופים-השבירה. מנקודה זו ואילך, התאים הם מאוד שבירים. להתמודד עם תאים בעדינות וכדי להימנע משימוש השאיפה ואקום או vortexing.
</li>
	<li>Centrifuge הצינורות ב g x ~ 376 במשך 3 דקות להסיר את הנוזל לחלוטין על-ידי pipetting.</li>
	<li>בעדינות resuspend תאים עם 1 מ"ל של מאגר B על ידי pipetting 1 - 2 פעמים למעלה ולמטה כדי לערבב.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות ב g ~ 376 x עבור 3 מינימלית נוזל B מאגר להסיר על-ידי pipetting. Resuspend בעדינות תאים 1 מ"ל אתנול 70% (מדולל עם מים ללא RNase).</li>
	<li>דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3.5-4 שעות.</li>
</ol>2. הכלאה
<ol><li>להביא formamide בטמפרטורת החדר (עבור aliquot 50-mL, זה לוקח ~ 30 דקות באמבט מים). הערה: אל תפתח את הבקבוק formamide עד הבקבוק מגיע לטמפרטורת החדר כדי למנוע חמצון של formamide. התראה: Formamide הוא רעיל. לטפל ולחסל לפי תקנות מוסדיים.</li>
	<li>הכינו 10% formamide שטיפת מאגר צינור חרוטי 15-mL.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות ב g x ~ 376 במשך 3 דקות 500 להסיר µL של 70% אתנול על-ידי pipetting. בעדינות pipet למעלה ולמטה כדי resuspend התאים הנותרים ולאחר מכן להעביר את התאים נמוך-אדהזיה צינורות. הערה: באמצעות צינורות אדהזיה נמוך מאוד מפחית איבוד תאים במהלך שוטף עוקבות.</li>
	<li>Centrifuge צינורות שוב ב g ~ 376 x עבור 3 מינימלית הסר כל האתנול על-ידי pipetting.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של 10% formamide שטיפת מאגר, ובעדינות pipet למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים כדי resuspend את התאים.</li>
	<li>לאפשר את התאים לשבת בטמפרטורת החדר למשך ~ 20 דקות בעת הכנת הפתרון הכלאה. עבור מדגם 1, מערבבים 50 µL הכלאה מאגר (חדר הזמנית), 5 µL של 200 מ מ VRC (התחמם עד 65 הלעפה תרוטרפמט) ו- µL 1 של כל בדיקה (200 ננומטר הסופי). לקבלת דוגמאות 5, מערבבים 250 µL הכלאה מאגר (חדר הזמנית), µL 25 מ מ 200 VRC (התחמם עד 65 הלעפה תרוטרפמט) ו- 5 µL של כל בדיקה (200 ננומטר הסופי).<ol>
<li>הפשרת הכלאה מאגר (קפוא ב-20 הלעפה תרוטרפמט) לטמפרטורת החדר לפני פתיחת צינור כדי למנוע חמצון formamide.</li>
		<li>לאחר הוספת את 200 מ"מ VRC, מערבולת עבור 5-10 s לפני הוספת את הגששים, אשר תוכנן, שנרכשו באופן מסחרי, מחדש בהתאם להוראות היצרן.</li>
		<li>אם שני רגשים שיתוף incubated, להוסיף 1 µL של ה-1:10 לדילול המניות בדיקה #1, כמו גם µL 1 של ה-1:10 דילול של המניה בדיקה #2, כדי לגרום לדילול הסופית ~ שבערך עבור בדיקה או. הריכוז הדרוש עבור יחס אות לרעש בצורה הטובה ביותר צריך להיות מותאם (ראה דיון לפרטים).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuge הדגימות-g x ~ 376 עבור 3 מינימלית הסר את תגובת שיקוע לתוך. פסולת מסוכנת על-ידי pipetting.</li>
	<li>הוסף לפחות 50 µL של הכלאה פתרון כל שפופרת. קפיצי הצינורות לערבב.</li>
	<li>תקופת דגירה-30 הלעפה תרוטרפמט על תוף רולר לפחות 16 שעות בחושך.</li>
</ol>יום 2/יום 3
3. שטיפת והדמיה
<ol><li>להביא formamide בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הכינו 10% formamide שטיפת מאגר (FWB) צינור חרוטי 15-mL.</li>
	<li>להסיר את הצינורות רולר התוף ולמקם אותם לתוך תיבת מכוסה בנייר כסף כדי להגן מפני אור.</li>
	<li>Centrifuge הדגימות-g x ~ 376 עבור 3 מינימלית הסר את תגובת שיקוע לתוך. פסולת מסוכנת על-ידי pipetting.</li>
	<li>Resuspend ב 1 מ"ל של 10% FWB מאת בעדינות pipetting למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים.</li>
	<li>דגירה-30 הלעפה תרוטרפמט במשך 30 דקות (לא סיבוב) בתיבת מכוסה בנייר כסף.</li>
	<li>Centrifuge את הדגימות ב g x ~ 376 במשך 3 דקות להסיר את תגובת שיקוע על פסולת מסוכנת על-ידי pipetting, µL ~ 50 תעזוב.</li>
	<li>. בינתיים, מכינים דאפי/FWB צינור חרוטי 15-מ ל: עבור מדגם 1, מערבבים 1000 µL 10% formamide שטיפת מאגר עם µL 1 של 5 מ"ג/מ"ל דאפי. לקבלת דוגמאות 10, מערבבים 10 מ ל 10% formamide שטיפת מאגר עם 10 µL של 5 מ"ג/מ"ל דאפי. Resuspend ב 1 מ"ל של דאפי/FWB מאת בעדינות pipetting למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים.</li>
	<li>דגירה-30 הלעפה תרוטרפמט במשך 30 דקות (לא סיבוב) בתיבת מכוסה בנייר כסף.</li>
	<li>הפשרת אקונומיקה נגד ריאגנטים על קרח.</li>
	<li>Centrifuge הדגימות-g x ~ 376 עבור 3 מינימלית הסר את תגובת שיקוע לחלוטין על-ידי pipetting. אם יש צורך, צנטריפוגה שוב כדי להסיר כל תגובת שיקוע.</li>
	<li>לקבלת דוגמאות זה לא תמונה מיד, resuspend בגדר ב- 50 µL של מאגר GLOX ללא אנזימים. Pipet למעלה ולמטה 3 - 4 פעמים כדי לערבב.<ol>
<li>לשמור כל הדגימות unimaged בתיבת מכוסה בנייר כסף-הלעפה תרוטרפמט 4 עד מוכן לתמונה. כאשר מוכנים תמונה, centrifuge את הדגימות ב g x ~ 376 למשך 2 דקות, להסיר את תגובת שיקוע לחלוטין על-ידי pipetting. Resuspend ב GLOX עם אנזימים כמפורט להלן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקבלת דוגמאות להיות עם תמונה באופן מיידי, להוסיף 15-20 µL GLOX מאגר עם אנזימים. בעדינות pipet למעלה ולמטה כדי לערבב. הערה: אמצעי האחסון הוסיף יכול להשתנות בהתאם לגודל בגדר התא. אנו ממליצים resuspending בגדר ב µL 15 GLOX מאגר עם אנזימים, לבדוק את צפיפות התאים במיקרוסקופ. אם תאים צפופים מדי (תאים clumping אחד מעל השני), להוסיף מאגר נוסף GLOX עם אנזימים. אם תאים דליל מדי, centrifuge את הדגימה ולהסיר ~ 5 µL של המאגר.</li>
	<li>Pipet 5 µL אל coverslip (18 מ מ x 18 מ מ, מס ' 1), ולשים coverslip בשקופית.</li>
	<li>לשים מחיקה מעבדה על גבי השקופית איפה מניחים את coverslip. לחץ בעדינות על המחיקה מעבדה כדי להגדיר שקופיות (צריך לראות נוזלי יורד מכל ארבעה קצוות coverslip).</li>
	<li>להעביר את השקופית לחדר מיקרוסקופ בתוך קופסה מכוסה על ידי רדיד אלומיניום.</li>
	<li>תמונה באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב זריחה עם הגדלה גבוהה (60-100 X) מפתח נומרי גבוהה. הערה: כדי לאסוף את המספר המקסימלי של הפוטונים הנפלטים על ידי הגששים smFISH, מיקרוסקופ קונפוקלי אינם מומלצים, כפי שהם להגביל באופן משמעותי את כמות האור להיות שנאספו. כאן, נאספו הנתונים על מיקרוסקופ מצויד 100 X, המטרה נה 1.4, באמצעות מסננים CY5 (EX632/22, EM679/34) עם תמונה-1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; ודאפי (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, ט 32-50% כדאי גם לרכוש תמונת ייחוס בהיר-שדה. לרכוש 15-25 פרוסות עם גודל צעד של 0.1-0.2 µm, מ לחלוטין מתחת המוקד של שדה הראייה כדי לחלוטין לעיל, על מנת להבטיח כי כל המקומות RNA התפקדו.</li>
</ol>4. תמונות ניתוח
<ol><li>לנתח את הנתונים smFISH עם כלי ניתוח smFISH שפורסמו כגון דגים-חשבים17 ו- StarSearch2, או עם תוכניות בהזמנה אישית, בהתאם לדרישות המדויקות של הניסוי. הערה: צינור ניתוח טוב צריך לאפשר למשתמשים לקבוע סף כדי להפריד בין המקומות RNA נכון מהרקע, פלט נתונים סטטיסטיים כגון הקואורדינטות X, Y ו- Z (אופציונלי), את העוצמה של כל מקום, מספר המקומות בכל תא , והתאמת ואולי פרמטרים כדרך לסנן גילויים שווא.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Rahman, S., Zenklusen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH)+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).</li><li>Gaspar, I., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+in+numbers:+quantitative+single-molecule+RNA+detection+assays.">Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).</li><li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing.">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li><li>Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+variability+of+alternative+RNA+splicing.">Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing.</a> Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li><li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts.">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li><li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells.">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li><li>Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ.">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li><li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant.">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li><li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA.">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li><li>Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+analysis+method+to+quantify+mRNA+localization+reveals+its+correlation+with+cell+motility.">An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility.</a> Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).</li><li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORSEN,+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements:+mRNA-mitochondria+distance,+from+single-cell+to+population+analyses.">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+inactivation+by+expression+of+a+repressive+mRNA.">Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA.</a> eLife. 6, e27417 (2017).</li><li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH-quant:+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images.">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li><li>Brar, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+view+of+the+yeast+meiotic+program+revealed+by+ribosome+profiling.">High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling.</a> Science. 335 (6068), 552-557 (2012).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007 (2015).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li><li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast.">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li></ol>

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

פרוטוקול המובאת כאן נגזרת אחרים שפורסמו smFISH פרוטוקולים2,3,21,22,23, במיוחד ממוטב עבור רקע המתח שמרים SK1. הפרמטרים ממוטב כללו את מספר הטלפון הנייד, קיבוע משך, מהירות צנטריפוגה, משך, משך העיכול, מאגר עיכול, בדיקה לריכוז מאגר הכלאה. לא עברו אופטימציה פרמטרים אחרים כגון הכלאה טמפרטורה ומשך. בחלק זה, אנו חולקים כמה הערות שיעזרו לך להתאים את פרוטוקול זה איזשהו רקע המתח שמרים, את תנאי הגידול של עניין.
דופן התא של ניצני שמרים היא אחד האתגרים הגדולים נגד קבלת תמונות באיכות גבוהה smFISH ניצני שמרים כי קיר התא מונעת חדירה בדיקה. העיכול לא שלם של דופן התא על-ידי zymolyase מוביל הכלאה לא יעיל של המחקרים וכל השתנות גבוהה-לתא אות. אולם, עיכול יתר יכול להפוך את התאים שברירית מדי, המוביל משמעותית תא הפסד במהלך השלבים כביסה ותא מתפוצץ במהלך הכנת שקופית עבור הדמיה. לפיכך, אופטימיזציה של משך הזמן של מערכת העיכול היא קריטית. אנו ממליצים על ביצוע ניסוי smFISH טייס על ידי באותה דגימת זרע עבור כמויות שונות של זמן. במקרה שלנו, השגנו את הנתונים smFISH הטוב ביותר אם עצרנו העיכול כאשר ~ 80% של תאים הפך ללא-השבירה. בדרך כלל, עבור הצמיחה באותו המצב, זנים מוטציה גנטית יכול להיות מתעכל בתזמון דומה. עם זאת, משך הזמן של מערכת העיכול שונה בהשוואה בין תנאי גידול שונים, בשלבים שונים של מיוזה בניצני שמרים. ברגע התזמון נקבע, האיכות של smFISH הוא לשחזור. הערה כי עבור זנים מוטציה עם סינתזת דופן התא פגום ו/או הרכב, מערכת העיכול ועלול להסתיים בתוך פחות מ 15 דקות השימוש של קבוצות שונות של zymolyase עשויים גם מעט לשנות את התזמון לעיכול.
ריכוז אופטימלי בדיקה יש צורך להשיג יחס אות לרעש גבוה. אנחנו תוכנן ורכש מסחרית הגששים smFISH שלנו. הגששים טוב (לעיתים קרובות 20-מרס) צריך להיות אחוז של GC הנע בין 35% ל-45%, מרווח מינימלי של 2 זוגות בסיס בין הגששים, אשיג נמוכה. השתמשנו מעצב מבוסס-אינטרנט בדיקה מהיצרן כדי ליצור רשימה של הגששים, אם היו מספיק הגששים לבחירה, נשתמש האלגוריתם הפיצוץ במסד הנתונים של הגנום Saccharomyces לחסל את הגששים עם יותר מ 17 בסיסי זוגות חפפו עם אזורים אחרים גנומית. בחרנו את יותר photostable הפלורסנט (CAL עבור חיל הים 590) עבור ערכת בדיקה anneals לאזור ייחודי של NDC80luti (CF 590) כי בקבוצה זו, המספר של הגששים זה מרוצה כל הקריטריונים לעיל (20 הגששים) היה נמוך יותר מאשר המספר המינימלי המומלץ על ידי היצרן (~ 25 הגששים). לאחר לשחזר את הפתרון בדיקה בעקבות הוראות היצרן, עשינו 1:10 דילול של הפתרון מניות ומאוחסנת הפתרון מדולל 5-µL aliquots ב-20 הלעפה תרוטרפמט. כל aliquot היה בשימוש פעם אחת בלבד. עבור אופטימיזציה, לעשות סידורי דילולים מ ה-1:10 מדולל פתרון ובדיקה הריכוז אשר מניב את יחס אות לרעש הטוב ביותר. אנו ממליצים על ביצוע סדרת דילול 1:250, שבערך, 1:1000, 1:2000 מן המלאי המקורי. במקרה שלנו, גורם לדילול שבערך הביא יחס אות לרעש הטוב ביותר, עבור ערכות בדיקה CF 590 והן Q 670.
הזמן האופטימלי קיבוע חיוני גם עבור smFISH מוצלחת בניצני שמרים. אנחנו נמצא באותו קיבעון לילה-הלעפה תרוטרפמט 4, במקום תיקון בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות, לשפר באופן משמעותי את אחידות ואיכות התוצאות smFISH עבור דגימות meiotic. למרות שלא בדקנו איך לילה קיבוע העלולים להשפיע דגימות צמח, קיבוע בטמפרטורת החדר פעלה היטב את מצב גידול זה. לפיכך, כדי למטב את פרוטוקול smFISH עבור זנים חדשים או תנאי הגידול, מומלץ החל זמן קצר קיבוע בטמפרטורת החדר והגברת הזמן קיבוע אם השתנות גבוהה של האות הוא נתקל.
לעומת אחרים שפורסמו פרוטוקולים3,22,23, פרוטוקול שלנו משתמש החומר המדכא RNase VRC במהלך לעיכול, ריכוז גבוה יותר של VRC במהלך הכלאה. תוספת של VRC בשני שלבים אלה לשפר את העקביות של תוצאות smFISH, אולי על ידי יותר שמירה על מולקולות RNA נגד נוקלאז פעילות, אשר עשוי להיות מוצג על ידי שילוב zymolyase (האנזים מטוהר מכל תמציות גולמי, עשויים להכיל RNase מזהמים). לפיכך, אנו ממליצים להשתמש כמות VRC כפי שמפורט ב פרוטוקול או אפילו גבוה יותר ריכוזי VRC למיטוב שלנו.
חלק ניכר של התאים ייתכן שיאבדו במהלך השלבים כביסה B מאגר והן המאגר לשטוף formamide. כדי לצמצם את איבוד תאים, אחד יכול להגביר את מהירות צנטריפוגה. במקרה שלנו, באמצעות במהירות גבוהה (21,000 x g) הצניפה הדגימות שלנו במהלך B מאגר שוטף איבוד תאים מופחתת באופן משמעותי. עם זאת, תאים להפוך שברירי לאחר עיכול zymolyase, אז מהירות צנטריפוגה שינוי אינו מומלץ. במקום זאת, אנו מציעים שימוש השפופרות נמוך-הידבקות של מדעי בארה ב, אשר במידה רבה לעזור הצניפה התאים במהלך שוטף במאגר לשטוף formamide. בסך הכל, פרוטוקול שלנו בעקביות ליצור של טפט של תאים צפוף מספיק עבור הדמיה יעיל. בדרך כלל, 7 שדות ראייה אמור להניב > מתאים כימות 130 תאים.
לבסוף, חשוב לקבוע פרמטרים אופטימליים עבור ואת התוצרים לצורך, על סמך ניתוח תמונות. כדי לזהות כתמים smFISH, תוכניות שפורסמו ניתוח נפוץ לסנן את תמונות raw באמצעות גאוסיאנית הקרנל כדי להסיר רקע אות ובקש למשתמשים לקבוע את יחס אות לרעש לשימוש עבור כל קבוצה של תמונות2,17. למרבה הצער, אין כיום סטנדרט יחיד שבו נקבעים הפרמטרים הנכון, אז כמה בדיקות אמפירי של הגדרות שונות אלה יש צורך. כדי להגדיר את הפרמטרים הדרושים עבור כל אחד מהצעדים הללו, אחד צריך iteratively קלט סטים שונים של פרמטרים לבדוק עד כמה התוצאות המתקבלות מכל ערכה תואם את זה של ספירה ידנית בתאים נציג כמה. ברגע אחד קבוצת הפרמטרים נמצא, זה יכול לשמש עבור רוב הדימויים שהושג למרות תנאי גידול שונים ורקעים גנטי.
בנוסף, אחד יכול לבדוק אם הקרנה בעוצמה מקסימלית של תמונות smFISH יכולה להתבצע לפני כימות22. שלב זה מפשט את אלגוריתם זיהוי ספוט, מפחיתה באופן משמעותי את הזמן דימות, אף במחיר של מידע שעשוי להיות שימושי על נקודות בודדות, כגון לוקליזציה subcellular שלהם. במקרה שלנו, מספר מולקולות mRNA המיוצר על ידי הגן NDC80 היה נמוך מספיק המקומות היו מופרדים היטב לאחר העיבוד הזה (לא נדיר עבור תעתיקים של ניצני שמרים3,7). במקרים בהם colocalization ניתוח ביקורתי, הצינור ניתוח צריך לקבוע את המיקום של כל נקודה smFISH בכל אחד מהערוצים להעריך colocalization. תלוי השאלות הספציפיות הנשאלת, פרטים אחרים כגון העוצמה של כל מקום ייתכן גם צריך להיות מופק הצינור לצורך ניתוח נוסף. אופטימיזציה של המפתח צעדים בפרוטוקול, הצינור ניתוח התמונה מכריע בהשגת באיכות גבוהה של נתונים smFISH ללמוד את סוגיית הריבית.

דינמי בקרת גנים כוננים הפיתוח של אורגניזם, כמו גם את תגובתה עקה, זיהום, שינויים בחילוף החומרים. מחקרים המתמקדים תקנה תעתיק להסתמך על טכנולוגיות המודדים RNA שפע. שיטה אחת כזו, כינה פלורסצנטיות הכלאה בחיי עיר מולקולה בודדת (smFISH), משמשת לצורך זיהוי של מולקולות RNA בודדים תאים בודדים1,2. שיטה זו מאפשרת מדידה של מידת ההשתנות לתא בביטוי הגנים והנחישות של לוקליזציה RNA תאיים.
בשיטה smFISH הנפוצות ביותר, דורש זיהוי מולקולת ה-RNA בודדים מרובים קצר DNA רגשים (לעיתים קרובות ~ 48 20-מר הגששים) כי הם משלימים אל המטרה RNA הם מצומדת כדי לצבוע פלורסנט באותו. איגוד של בדיקה ניאון יחיד התוצאה היא האות חלש, אך האות מהאנסמבל של כל את הגששים חזקים. תכונה זו משפר באופן משמעותי את יחס אות לרעש, כי אף-על-פי בדיקה אחת בנוסח מחייב את המטרה, אות כזה צפוי להיות חלש מאוד לעומת זו של יעד מולקולת רנ א3. בתוך שגיאה של זיהוי, מספר מולקולות RNA יכול להיות נספרים, בהשוואה על פני תנאי הגידול השונות ובקרב מוטציות שונות.
מאז פיתוח הראשון, smFISH הותאם ללמוד היבטים שונים של ג'ין הביטוי4, כגון שעתוק התארכות1,2, החדרת5,6, תעתיק מתפוצץ7 , 8 , 9, תאיים ביטוי allelic10,11,12, ו- RNA לוקליזציה13,14,15. לאחרונה, אנחנו השתמשו בשיטה זו כדי ללמוד את הביטוי של שתי התמליל איזופורמים של אותו גן, שבו התעתיק קצר isoform (NDC80ORF) יש רצף כולו שלו שיתף את isoform ארוך (NDC80luti )16. כדי לזהות באופן ייחודי את איזופורמים mRNA שני, היינו שתי ערכות בדיקה: קבוצה אחת היא ספציפית רצף ייחודי של NDC80luti, ומאגד הסט השני, מצומדת כדי עוד הפלורסנט, לאזור משותף שני איזופורמים. NDC80luti RNA מזוהה כמו כתם colocalized עם שני אותות פלואורסצנט, ואילו NDC80ORF RNA היא זו מכילה רק את האות מ ערכת בדיקה. מאז המספר NDC80ORF תעתיקים מחושבת באמצעות שיטת "חיסור", יעילות גבוהה של בדיקה הכלאה, יחס אות לרעש גבוה יש צורך בביטחון לזהות כתמים smFISH ולהפחית את השגיאה הפצת.
מאמר זה מתאר פרוטוקול ממוטבים לביצוע smFISH של שמרים ניצני האפייה. ב פרוטוקול זה, מספר הטלפון הנייד, קיבוע זמן, זמן עיכול, מערכת העיכול מאגר, בדיקה לריכוז הכלאה מאגר המשמש את הניסויים smFISH אופטימציה להצגה SK1 זן הרקע של cerevisiae ס שעברו וגטטיבי צמיחה או מיוזה. עם זאת, אנחנו גם לציין בכתב יד זה: (1) השיטה כדי לבדוק את איכות הנתונים smFISH לאחר ייבוא תמונות, ושלבים (2) בפרוטוקול שיחייבו נוספים מיטוב עבור רקעים זן שונה, תנאי הגידול.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:881px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM2616</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Catalase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">C3515</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C for short-term. Vortex before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">D9564</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C after reconstitution in water. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">50% Dextran Sulfate</td>
			<td style="width:99px;">Milli Pore</td>
			<td style="width:87px;">S4030</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">E. coli tRNA</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">R4251</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Ethanol (100%, 200 proof)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Flammable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Fisher</td>
			<td>F79-500</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Formamide</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9342</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C after dissolving in nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose oxidase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">G2133</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9932</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Probe library, diluted in TE, pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Biosearch Technologies</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots (5 &#181;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Sorbitol</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">20X SSC</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9763</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:205px;">TE, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9849</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:205px;">1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9856</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:205px;">Trolox</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">238813</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td>
			<td style="width:99px;">NEB</td>
			<td style="width:87px;">S1402S</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:205px;">Zymolyase 100T</td>
			<td style="width:99px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:87px;">08320932</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Low-adhesion tubes</td>
			<td style="width:99px;">USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

קרינה פלואורסצנטית הכלאה בחיי עיר מולקולה בודדת (smFISH) היא טכניקה חזקה ללמוד ביטוי גנים בתאים יחיד בשל יכולתה לזהות ולספור מולקולות RNA בודדים. משלימה לשיטות המבוססת על רצף עמוק, smFISH מספק מידע על וריאציית לתא בשפע התעתיק ולוקליזציה subcellular של RNA נתון. לאחרונה, השתמשנו smFISH ללמוד את הביטוי של הגן NDC80 במהלך המיוזה בניצני שמרים, בתעתיק שני אילו איזופורמים קיים ויש isoform קצר תעתיק רצף כולו שלו שיתף את isoform ארוך. בביטחון לזהות כל isoform התעתיק, אנחנו ממוטב smFISH הידוע הפרוטוקולים והשיג בעקביות גבוהה ואיכות smFISH נתונים על הדגימות שנרכש במהלך ניצני שמרים מיוזה. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול ממוטבת, הקריטריונים שבהם אנו משתמשים כדי לקבוע אם מתקבל באיכות גבוהה של נתונים smFISH ולאחר כמה טיפים ליישום פרוטוקול זה זני שמרים ותנאי גידול אחרים.

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת בחיי עיר הכלאה הפרוטוקול ממוטבת כדי לכמת את מספר מולקולות RNA בניצני שמרים במהלך גידול וגטטיבי, מיוזה.

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

single-molecule-fluorescence-situ-hybridization-smfish-analysis

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

19.1K Views.  University of California, Berkeley. קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת בחיי עיר הכלאה הפרוטוקול ממוטבת כדי לכמת את מספר מולקולות RNA בניצני שמרים במהלך גידול וגטטיבי, מיוזה.

Video: Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (mFISH) ו ספקטרלית Karyotyping (SKY) בעכברים מוקרנים

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

ממוקד<em&gt; באתרו</em&gt; גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

ניתוח מולקולה בודדת של מותאמת לשפה לייזר Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

ויזואליזציה של Microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

MiRNA רקמות ספציפיות ביטוי פרופיל בהלב העכבר באמצעות סעיפים באתרו של הכלאה

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

אפיון שינויים Post-translational שינוי היסטון במודלים ניווניות Proteinopathy שמרים

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.