אנו מודים ג&#39;סיקה ג&#39;ונס, אריקה קלארק, קונסטנס Ducar, דון סמית, רוי לואיס, לילי Apedaile, ג&#39;ואן ויזנר, דווין אדאמס, הקורים McBain וסטיבן Voght על עזר בפיתוח של שיטה, וכתב יד בסרטון זה. עבודה זו נתמכה על ידי קרן ביל ומלינדה גייטס CAVD מענק 38645 (MJM) ומכונים הלאומיים לבריאות מענקי UM1 ​​AI068618 וU01 AI069481 (MJM). EA-N. הוא נתמך על ידי NIH גרנט T32 AI007140. אנו מודים לקרן ג&#39;יימס ב &#39;פנדלטון צדקה לתרומת ציודם הנדיבה.

הערה: כדי להגן על נוגדני fluorophore-מצומדות מאור, לבצע את כל השלבים בארון בטיחות ביולוגית עם האור הכבוי. 1. הכנת לוח כתמי נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנל מכתים הנוגדן ניתן למצוא בטבלת 1. ריכוז נוגדנים צריך להיות מוגדר על ידי טיטרציה עם כל דם ושימוש באותו הציוד ונהלים שישמשו לרכישת דגימות phenotyping המוכתמות cytometry זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע titers הצביעה המתאימה נקבעים, לשלב את כל הנוגדנים לתערובת אחת בצינור מנעול בכובע מצחיה. הוסף חיץ לשטוף זרימה (PBS של Dulbecco עם סרום 2% חום מומת עוברים מבקרים) כדי להביא את הנפח הכולל עד 100 μl. הרחב את התערובת במשך מספר הדגימות שמוכתמות. תערובת זו ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שמונה שבועות. </li></ol> 2. הכתמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הדם שנאסף כדי לשמש למטרות אחרות במודעהdition לassay זה, קבע aliquot צד בעת שהליכים יותר רגישים לזמן מבוצעים על הדם שנותר. Aliquot ניתן לאחסן בטמפרטורת חדר עד 4 שעות לאחר venipuncture ללא אובדן תא משמעותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שיש שלמות חרוז גלולה בתחתית של התחתית ותווית Trucount הצינור לזהות המדגם שהוכתם. בניסויים קליניים HVTN, מערכת ניהול נתוני המעבדה (Frontier מדע וטכנולוגית קרן מחקר; אמהרסט, ניו יורק) משמשת לתייג ולעקוב אחר דגימות מוכתמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את מספרי מגרשים ותאריכי תפוגה של כל החומרים כימיים. רשום את מספר Trucount צינור חרוז הספירה מסופק על ידי היצרן על השקית של צינורות; לוודא שהמספר הרבה על השקית תואם למספר הרבה ברכבת התחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש להפוך pipetting במדויק פיפטה μl 100 מכל הדם לתוך צינור Trucount, ממש מעליו את מקדמת המתכת. הימנע ממריחת דם למטה בצד של הצינור. </li><li&gt; באמצעות טכניקה רגילה (קדימה) pipetting, 100 μl פיפטה של לוח מכתים הנוגדן המעורב (ראה טבלה 1) לתוך צינור Trucount. מכסה את הצינור ומערבולת במהירות נמוכה למשך כ 15 שניות כדי לערבב. חזותי לבדוק את הצינור כדי להבטיח שחרוז הגלולה נמסה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת צינור Trucount במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר (15-30 מעלות צלזיוס) בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך, מדלל aliquot של 10 × פתרון Lysing FACS ל1X באמצעות diH 2 O. הוסף 900 ​​μl 1 × פתרון Lysing FACS לצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הצינור ומערבולת ביסודיות במהירות נמוכה למשך כ 15 שניות כדי לערבב. דחוף את המכסה כלפי מטה בחוזקה לנעילת עמדה בצינור וחותם עם סרט מעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הצינור ב-65 ° C עד -95 ° C עד המדגם הוא מוכן למשלוח למעבדה המרכזית הניתוח או לניתוח בבית. דוגמאות הן יציבות בשלב זה לפחות ארבעה שבועות. אם משלוח או assaying immediately, צעד זה יכול להיות מושמט. </li></ol> 3. משלוח הערה: בהנחיות הבאות לנצל מערכת משלוח מבודד מSaf-T-פאק, Inc תוכננה במיוחד עבור קטגורית חומרים ביולוגיים פטורים B משלוח בהתאם לאוויר הבינלאומי ותחבורה אגודה (IATA) תקנות. אם מנתח את הדגימות באותו המיקום כמו הכתמים התרחשו, עבור לסעיף 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות ניתן להעבירה מייד לאחר צביעה או ברגע שהם קפאו ב-65 ° C עד -95 ° C. עוטף כל צינור לחלוטין בנייר הכסף ומניח בתיבת הדגימה המוכתמת. הנח את תיבת הדגימה המוכתמת בתוך שקית פולי leakproof עם חומר סופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את שקית פולי leakproof והתוכן לתוך שקית Tyvek וחותם עם כאוויר קטן ככל האפשר בתיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את חבילת הדגימה (דגימה בתוך אריזה משנית) בתוך קופסא החומה הפנימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את החום הפנימי בשור בתוך חזה הקלקר, לקבע אותו בכניסה כדי למנוע תזוזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא חזה הקלקר עם קרח יבש (כ 8 ק&quot;ג) ומניח את המכסה בחוזקה על החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאובטח קלטת תיבת המשלוח והספינה כחומר ביולוגי, הקטגוריה B (UN3373) עם הקרח היבש הנאות (UN1845) סימונים; לעקוב-650 PI הוראות IATA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הקבלה, דגימות נשמרות ב-65 ° C עד -95 ° C עד שהם נתחו. </li></ol> 4. מפשיר וניתוח זרימת cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הדגימה המוכתמת מהמקפיא להפשיר בטמפרטורת חדר בחושך לפני האיסוף על cytometer הזרימה. אם איסוף נתונים על מדגם אחד או יותר, סטנדרטיזציה של התהליך עבור כל הצינורות על ידי מדהים הפשרה כך שהצינורות לא יושבים בטמפרטורת חדר למשך יותר משעה 1 כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות יש רכשה באמצעות cytometer זרימת ליזר 4 מצויד במסננים מתאימים, כגון BD LSRהשני. השתמש כיול cytometer סטנדרטי ושיטות תגמול קרינה לנתוני גבייה 4. </li></ol> הערה: אין להגדיר סף פיזור פיזור או צד קדימה במהלך איסוף 5. חרוזי Trucount יכולים לרדת מתחת לסף הגדרה הנמוכה ביותר האפשרית עבור פרמטרים אלו גורמים לקבוצת משנה של חרוזים כדי לא תטופל בזמן הניתוח. אם נדרש על ידי המכשיר לקביעת סף, קבע את הסף הנמוך ביותר האפשרי Am ציאן הערוץ. בגלל CD45 + leukocytes מגואלים בפנל יהיה Am ציאן חיובי, וחרוזי Trucount גם לזרוח בAm ציאן הערוץ, זה אמור לאפשר לכל הנתונים הרלוונטיים שנאסף כראוי. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת צינור המדגם למשך 5 שניות לפני הטעינה על cytometer הזרימה. חרוזי Trucount לזרוח מאוד בערוצים רבים. שער החרוזים במהלך איסוף על ידי מציאת האוכלוסייה, כי הוא מאוד כפול חיובי עבור PE Cy5 וAPC (2 קולוRS שרוב להבחין בקלות את החרוזים מהתאים עשוי להשתנות בהתאם למכשור). בחר את שער החרוז כשער העצירה שלך, ונתוני שיא לפחות עד 20,000 חרוזים הם נרכשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה, כגון FlowJo (Treestar; אשלנד, או). איור 1 מציג את ערכת gating מנוצלת לניתוח של אוכלוסיות שונות ליקוציט מתיקו דם שליטת נציג. </li></ol> 5. חישובי Trucount <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל שפופרת מכילה Trucount גלולת lyophilized של חרוזי ניאון. לאחר הוספת נוזל לצינור וvortexing, החרוזים צריכים להיות מופצים באופן שווה בכל המדגם. מספר החרוזים בגלולה משתנה במקצת על ידי מספר רב וניתן למצוא בשקית האחסון לצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שער חרוזי Trucount ואוכלוסיות תאים כפי שמוצג באיור 1 כדי לקבוע ספירות אירוע לכל אוכלוסייה. השוואת מספר האירועים אניn שער החרוז למספר הכולל של חרוזים במקור בצינור יאפשר לך לקבוע את יחס הדגימה שנאספה, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לקבוע את הריכוז המוחלט (כלומר, תאים / μl) לכל אוכלוסייה. המשוואה הבאה יכולה לשמש למטרה זו: = [אירועים # / אוכלוסייה (אירועים # # / חרוזי חרוזים כלל בגלולה)] / 100 μl ריכוז תאים (תאים # / כל דם μl). </li></ol> 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1.jpg" alt="איור 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1highres.jpg" /> איור 1. ערכת gating מנוצלת לניתוח של אוכלוסיות גדולות ליקוציט מראים נתונים מייצגים מן מתנדב בריא. ) חרוזי Trucount (i) הם מגודרים והוצא מתאים. גרנולוציטים (ii) מסומנים וlympohcytes ומונוציטים מחולקים 3 popluations: CD14הלימפוציטים שליליים (ג), כל התאים CD14 השליליים (ד), ושאינו לימפוציטים (v). B) CD14 ימפוציטים שליליים הם מגודרים להבחין CD4 + תאי T (vi), CD8 + תאי T (ז), תאי B (ח), CD56 תאי NK בהירים (לט), CD56 תאי NK עמומים (X), וCD56 תאי NK שליליים (יא). ג) כל התאים CD14 השליליים הם מגודרים להבחין מיאלואידית (יב) ו( XIII) תאי דנדריטים plasmacytoid. D)-lympocytes עישון הנו מגודרים להבחין (XIV), ביניים (XV), וקלסיים מונוציטים הלא קלסיים (XVI). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4302/4302fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> תת תא ספציפי יותר שאינם מוצגים באיור 1 (לדוגמה, תאים או נויטרופילים NKT) גם ניתן להבחין באמצעות לוח אנו מציגים, וערכת gating ניתן להרחיב או שונה כדי לענות על צרכי הלימוד ספציפיים. צעדי gating מסוימים המוצגים הם ייחודיים לשיטה זו. שים לב במיוחד, שער והכללהשער הדרה נמשך סביב חרוזי Trucount ומונח על גבי זה, אחד לשער החרוזים לספירה, ואחד שלא לכלול את החרוזים מהניתוח הסלולרי (איור 1 א). כמו כן, משום לימפוציטים, מונוציטים וגרנולוציטים לא הבחינו בקלות בדם כולו כפי שהם בתאי דם היקפיים mononuclear ידי פיזור קדימה וצד פיזור, gating התאים האלה באמצעות CD45 ביטוי ופיזור צד לעתים קרובות יש צורך (איור 1 א). גרנולוציטים מזהמים (מוקף בעיגול) שלא יכול להיות מופרד מלימפוציטים ומונוציטים באמצעות CD45 ופיזור צד ניתן להבחין בחלקות מסוימות על ידי CD16 הביטוי הגבוה שלהם (התרשים 1C ו1D איור). מספר גרנולוציטים מזהמים הוא בדרך כלל קטן, והם לא מפריעים לgating התא monocyte ונ&quot;ק.

<ol>
	<li>Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cryobiology+of+rat+and+human+dendritic+cells:+preservation+and+destruction+of+membrane+integrity+by+freezing.">The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing.</a> Cryobiology. 27, 269-278 (1990).</li><li>Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+lymphocyte+immunophenotype+and+proliferative+responses+in+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+donors:+implications+for+multicenter+clinical+trials.+The+ACTG+Immunology+Advanced+Technology+Laboratories.">Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).</li><li>Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+granulocytes:+study+of+granulocyte+function+and+ultrastructure.">Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure.</a> Blood. 56, 237-245 (1980).</li><li>Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+assurance+for+polychromatic+flow+cytometry.">Quality assurance for polychromatic flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).</li><li>Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytofluorometric+methods+for+assessing+absolute+numbers+of+cell+subsets+in+blood.+European+Working+Group+on+Clinical+Cell+Analysis.">Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis.</a> Cytometry. 42, 327-346 (2000).</li><li>Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+blood+processing+parameters+for+optimal+detection+of+cryopreserved+antigen-specific+responses+for+HIV+vaccine+trials.">Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials.</a> J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).</li><li>Kantor, A. B., Roederer, M., Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The handbook of Experimental Immunology. 43, 1-49 (1996).</li><li>Hulspas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+and+the+stability+of+phycoerythrin-tandem+dye+conjugates.">Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates.</a> Cytometry A. 75, 966-972 (2009).</li><li>Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+APC-tandem+dyes+are+degraded+through+a+cell-dependent+mechanism.">Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism.</a> Cytometry A. 75, 882-890 (2009).</li><li>Mandy, F., Brando, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+absolute+cell+counts+using+immunophenotypic+techniques.">Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).</li><li>Vuckovic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dendritic+cells+in+clinical+practice+using+a+new+whole+blood+single-platform+TruCOUNT+assay.">Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay.</a> J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).</li><li>Lichtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+dendritic+cells+and+interferon-alpha+production+in+patients+with+tuberculosis:+correlation+with+clinical+outcome+and+treatment+response.">Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response.</a> Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).</li><li>Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+analysis+of+dendritic+cell+subsets:+the+dendritogram.">Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram.</a> Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

בדו&quot;ח זה, אנו מציגים שיטת חרוז מבוססת על ספירת אוכלוסיות שלמות ליקוציט בדם טרי על ידי cytometry זרימה ולכסות את הפרמטרים דרושים לשימוש בו בניסוי קליני רב מרכזי בניתוח מדגם ריכוזי. שיטה זו מתבססת על ומייעלת את פרוטוקול Trucount BD ומאפשר השימוש האמין שלה בהגדרת ניסוי רב מרכז?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> Trucount צינורות ספירה מוחלטים </td><td> BD Biosciences </td><td> 340334 </td></tr><tr><td> FACS 10X Lysing פתרון </td><td> BD Biosciences </td><td> 349202 </td></tr><tr><td> הקטגוריה B &amp; מערכת משלוח פטורה, מבודדים </td><td> Saf-T-Pak </td><td> STP-320 </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי CD45 AmCyan </td><td> BD Biosciences </td><td> 339192 </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי CD3 FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td></tr><tr><td> CD8 PerCp-סיי 5.5 נוגדן חד שבטי </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td></tr><tr><td> CD4 Alexa פלואוריד 700 antibo חד שבטיdy </td><td> BD Biosciences </td><td> 557922 </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי HLA-DR ECD </td><td> Beckman Coulter </td><td> IM3636 </td></tr><tr><td> CD14 v450 נוגדן חד שבטי </td><td> BD Biosciences </td><td> 560349 </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי CD19 PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 555413 </td></tr><tr><td> APC-CD16 H7 נוגדן חד שבטי </td><td> BD Biosciences </td><td> 560195 </td></tr><tr><td> PE-CD56 Cy7 נוגדן חד שבטי </td><td> BD Biosciences </td><td> 335791 </td></tr><tr><td> CD11c APC נוגדנים חד שבטיים </td><td> BD Biosciences </td><td> 559877 </td></tr><tr><td> PE-Cy5 נוגדן חד שבטי CD123 </td><td> BD Biosciences </td><td> 551065 </td></tr></tbody></table>

enumeration of major peripheral blood leukocyte populations for multicenter clinical trials using a whole blood phenotyping assay

Cryopreservation של לויקוציטים דם ההיקפי נמצא בשימוש נרחב לשימור תאים להערכות תגובה חיסוניות בניסויים קליניים, ומציע יתרונות רבים לנוחות וסטנדרטיזציה של הערכות חיסוניות, אך השפעות מזיקות של תהליך זה נצפה בכמה תת קבוצות של תאים, כגון גרנולוציטים, תאי B , ותאים דנדריטיים 1-3. Assaying לויקוציטים הטרי נותן תמונה מדויקת יותר של המצב בvivo של התאים, אבל לעתים קרובות קשה לביצוע בהקשר של ניסויים קליניים גדולים. מבחני תא טריים תלויים התחייבויות התנדבות ולוחות זמנים, ואם זמן רב, היישום שלהם יכול להיות מעשי בשל שעתי העבודה הנדרשות מאנשי מעבדה. בנוסף, כאשר ניסויים נערכים במרכזים מרובים, מעבדות עם המשאבים וההכשרה הדרושים כדי לבצע את המבחנים לא יכולות להיות ממוקמות בקרבה מספיקה לאתרים קליניים. כדי לטפל בבעיות אלה, יש לנו develלאומי למטרולוגיה חוקית פנל מכתים נוגדנים 11-צבע שניתן להשתמש בו עם Trucount צינורות (הקיטון דיקינסון, סן חוזה, קליפורניה) לפנוטיפ ולמנות את אוכלוסיות ליקוציט מרכזיות בתוך הדם ההיקפי, מניב מידע ספציפי תא מסוג חזק יותר ממבחנים כגון ספירת דם מלא (CBC) או מבחנים עם לוחות, זמינים מסחריים המיועדים לצינורות Trucount שמכתימים אותו רק לכמה סוגי תאים. הליך ההכתמה הוא פשוט, דורש רק 100 μl של כל דם טרי, ולוקח כ 45 דקות, מה שהופך את זה אפשרי עבור מעבדות סטנדרטיות דם לעיבוד שיש לבצע. זה מותאם מגיליון BD Trucount צינור הנתונים הטכני <a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">(גרסה 8/2010).</a> קוקטייל הנוגדן המכתים יכול להיות מוכן מראש בכמויות גדולות במעבדת assay מרכזית ונשלח למעבדה לעיבוד באתר. צינורות מוכתמים ניתן לתקןוקפא למשלוח למעבדת הבדיקה המרכזית לניתוח cytometry זרימה ססגונית. נתונים המופקים מפנל מכתים זה יכול לשמש כדי לעקוב אחר שינויים בריכוזים ליקוציט לאורך הזמן ביחס להתערבות ויכול היה בקלות להיות מפותח יותר להעריך מצבי הפעלה של סוגי תאים ספציפיים של עניין. בדו&quot;ח זה, אנו מדגימים את התהליך בשימוש על ידי טכנאי מעבדת דם עיבוד לבצע צביעה על כל דם טרי ואת הצעדים כדי לנתח דגימות מוכתמות אלה במעבדת assay מרכזית תומכת בניסוי קליני רב מרכזי. פרטי וידאו ההליך כפי שהוא מתבצע בהקשר של תיקו דם ניסוי קליני בחיסון ה-HIV משפטי הרשת (HVTN).

Watch this Scientific Journal Video about Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay at JoVE.com

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

בדו&quot;ח זה, אנו מדגימים את שלבי צביעה וניתוח של assay phenotyping מבוצע על כל דם טרי למנות אוכלוסיות מולד אדפטיבית עיקריות יקוציט. אנו מדגישים שיקולים לביצוע הליכים אלה בהקשר של ניסוי קליני רב מרכזי.

ספירה של אוכלוסיות גדולות דם היקפיות יקוציט לניסויי multicenter קליניים באמצעות Assay phenotyping דם מלא

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

enumeration-major-peripheral-blood-leukocyte-populations-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.9K Views.  Fred Hutchinson Cancer Research Center. בדו"ח זה, אנו מדגימים את שלבי צביעה וניתוח של assay phenotyping מבוצע על כל דם טרי למנות אוכלוסיות מולד אדפטיבית עיקריות יקוציט. אנו מדגישים שיקולים לביצוע הליכים אלה בהקשר של ניסוי קליני רב מרכזי.

Video: Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

דלדול של אוכלוסיות תאים ספציפיים על ידי דלדול משלים

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

טיהור אוכלוסייה תאים ספציפיים על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &amp;#947;&amp;#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

הרחבת דם היקפיים האדם γδ T תאים באמצעות Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal titers. Studies of serum bactericidal titers in response to childhood vaccines have enabled us to develop and validate cut-off levels for protective immune responses and such cut-offs are in routine use. No such assays have been taken forward into the routine assessment of vaccines that induce primarily cell-mediated immunity in the form of effector T cell responses, such as TB vaccines. In the animal model, the performance of a given vaccine candidate is routinely evaluated in standardized bactericidal assays, and all current novel TB-vaccine candidates have been subjected to this step in their evaluation prior to phase 1 human trials. The assessment of immunogenicity and therefore likelihood of protective efficacy of novel anti-TB vaccines should ideally undergo a similar step-wise evaluation in the human models now, including measurements in bactericidal assays.
Bactericidal assays in the context of tuberculosis vaccine research are already well established in the animal models, where they are applied to screen potentially promising vaccine candidates. Reduction of bacterial load in various organs functions as the main read-out of immunogenicity. However, no such assays have been incorporated into clinical trials for novel anti-TB vaccines to date.
Although there is still uncertainty about the exact mechanisms that lead to killing of mycobacteria inside human macrophages, the interaction of macrophages and T cells with mycobacteria is clearly required. The assay described in this paper represents a novel generation of bactericidal assays that enables studies of such key cellular components with all other cellular and humoral factors present in whole blood without making assumptions about their relative individual contribution. The assay described by our group uses small volumes of whole blood and has already been employed in studies of adults and children in TB-endemic settings. We have shown immunogenicity of the BCG vaccine, increased growth of mycobacteria in HIV-positive patients, as well as the effect of anti-retroviral therapy and Vitamin D on mycobacterial survival in vitro. Here we summarise the methodology, and present our reproducibility data using this relatively simple, low-cost and field-friendly model.
Note: Definitions/Abbreviations
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal strain, transformed with shuttle plasmid pSMT1 carrying the luxAB genes from Vibrio harveyi, under the control of the mycobacterial GroEL (hsp60) promoter. 
CFU = Colony Forming Unit (a measure of mycobacterial viability).

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

We describe an alternative approach to the enumeration of mycobacteria in vitro, which uses reporter-gene tagged mycobacteria instead of colony-forming units (CFU). &#x201C;Survival&#x201D; of organisms as well as host response-markers are measured simultaneously, providing a low-cost, versatile and functional system for studies of host/pathogen interactions in the context of tuberculosis.

Assay פונקציונלית הדם כולו כדי למדוד את הכדאיות של mycobacteria, באמצעות הכתב-Gene Tagged BCG או מ Tb (BCG לוקס / מ Tb לוקס)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on the hypotonic lysis of erythrocytes and can be applied to human samples as well as to blood of non-human origin. The small initial sample volume of about 50 to 100 &#181;l makes this method applicable to recurrent blood sampling from small laboratory animals. Moreover, leukocyte enrichment is achieved within minutes and with low material efforts regarding chemicals and instrumentation, making this method applicable in multiple laboratory environments.
Standardized purification of leukocytes is combined with a highly selective staining method to evaluate halogenating peroxidase activity of the heme peroxidases, myeloperoxidase (MPO) and eosinophil peroxidase (EPO), i.e., the formation of hypochlorous and hypobromous acid (HOCl and HOBr). While MPO is strongly expressed in neutrophils, the most abundant immune cell type in human blood as well as in monocytes, the related enzyme EPO is exclusively expressed in eosinophils. The halogenating activity of these enzymes is addressed by using the almost HOCl- and HOBr-specific dye aminophenyl fluorescein (APF) and the primary peroxidase substrate hydrogen peroxide. Upon subsequent flow cytometry analysis all peroxidase-positive cells (neutrophils, monocytes, eosinophils) are distinguishable and their halogenating peroxidase activity can be quantified. Since APF staining may be combined with the application of cell surface markers, this protocol can be extended to specifically address leukocyte sub-fractions. The method is applicable to detect HOCl and HOBr production both in human and in rodent leukocytes.
Given the widely and diversely discussed immunological role of these enzymatic products in chronic inflammatory diseases, this protocol may contribute to a better understanding of the immunological relevance of leukocyte-derived heme peroxidases.

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

הערכה מהירה וספציפית של פעילות Halogenating Peroxidase בדגימות דם ליקוציט מועשר

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

שימוש Assay מונוציטים חד שכבתי להערכת Fcγ קולטן בתיווך Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies in an attempt to understand the precise mechanisms that lead to the breakdown of self-tolerance and subsequent autoimmunity. Approaches thus far have been based on the study of one specific aspect of the immune system (a single or few cell types or cytokines), and do not offer a global assessment of complex autoimmune disease. While patient sera-based studies have afforded important insights into autoimmunity, they do not provide the specific cellular source of the dysregulated cytokines detected. A comprehensive single-cell approach to evaluate cytokine production in multiple immune cell subsets, within the context of &#34;intrinsic&#34; patient-specific plasma circulating factors, is described here. This approach enables monitoring of the patient-specific immune phenotype (surface markers) and function (cytokines), either in its native &#34;intrinsic pathogenic&#34; disease state, or in the presence of therapeutic agents (in vivo or ex vivo).

Here we describe a single-cell proteomic approach to evaluate immune phenotypic and functional (intracellular cytokine induction) alterations in peripheral whole blood samples, analyzed via mass cytometry.

ניתוח מתא בודד של Immunophenotype וייצור ציטוקין בדם כל הפריפריה באמצעות Cytometry המונית

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...