אנו מודים Nobuyuki Onai, היטושי Takizawa ומרקוס Manz לייעוץ יקר. עבודה זו מומנה על ידי השוויצרי הקרן הלאומית למדע, השוויצרי סרטן הליגה Fondazione Ticinese לכל la RIcerca sul Cancro.

1. הכנת תרחיף תאים ממח העצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר ולמקם את בעל החיים בסיר נירוסטה ואתנול ספריי 70% על הבטן ועל הגב. איסוף עצם הירך לבין עצם השוק מן הרגליים האחוריות, ואת עמוד השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את כל שאריות מדויק של רקמות רכות של עמוד השדרה עם מספריים קצה חד לבין מעצמות הרגליים עם גזה. חנות הכלים צינור 50 פלקון מ&quot;ל עם 30 מ&quot;ל של מדיום RPMI המכיל 10% מומת חום בסרום שור עוברית (FBS), השלימו עם 50 mercaptoethanol β-מיקרומטר, 100 מיקרומטר ממ לא חיוניות חומצות אמינו, 1 MEM mM פירובט נתרן, 2 mM L-גלוטמין, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו - 100 סטרפטומיצין U / ml פניצילין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את תחתית מרגמה מעוקר בעבר עם מסנני סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העצמות אל תוך המדוכה ומכסים אותם בשכבה של מסננים על מנת להרכיב שטח החיכוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ&quot;ל צינור פלקון מסופק עם מסנן פלקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסק את העצמותבעזרת העלי עד קבלת ההשעיה התא הומוגנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה לתוך הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מ&quot;ל מרגמה 5 של המדיום RPMI טרי שלם לכבס למסוק את התאים הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שתי הנקודות האחרונות עד עצמות ומעורים נראה ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר ולסנן בצינור חדש ההשעיה התא כדי לחסל את פסולת ברקמות הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צינור בסל&quot;ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע תא גלולה. </li></ol> 2. פנוטיפי ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ולשטוף בתאים של עכברים בודדים 15 מ&quot;ל של PBS ו FBS 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צינור בסל&quot;ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות גלולה של 5 מ&quot;ל PBS ו 2% FBS ותאי הספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1 × 10 6 תאים / גם בתחתית בארות 96 עגולצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צלחת בסל&quot;ד 1500 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת של מבז המכוונים נגד סמני פני הבאים. לדלל אותם המצוין PBS ו - 2% FBS להכתים את התאים. <ul type="disc" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 מצומדות ל PE-Cy5 1:200 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> C-Kit מצומדות כדי APC 1:100 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצומדות כדי ביוטין 1:50 Sca1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצומדות כדי FITC 1:50 CD34 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצומדות כדי PE 1:100 FcγR </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IL-7R מצומדות ל PE-Cy7 1:100 </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק supernatant ולהוסיף 50 μL תמהיל מבז היטב כל אחד מהם. לנתק לתוך תאים בודדים ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 20 דקות בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים עם μL 150 של PBS ו 2% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צלחת בסל&quot;ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant ידי צלחת היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל streptavidin ב PBS ו - 2% FBS כמצוין להכתים את התאים. <ul type="disc" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streptavidin conjuמגודרת כדי APC-Cy7 1:300 </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL הפתרון היטב כל אחד מהם. לנתק את ההשעיה תא בודד על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 10 דקות בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים עם μL 150 של PBS ו 2% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צלחת בסל&quot;ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים μL 100 של PBS ו FBS 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג דגימות ב FACS. </li></ol> 3. העשרה המגנטי של C-Kit + תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מאגר המכיל PBS, pH 7.2, 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA), ו 2 mM EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה של העצם הדלועים נגזר לפחות 10 עכברים 1 מ&quot;ל של תמיסת מאגר המכיל C-Kit MAB מצומדות כדי APC בדילול 1:50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 20 דקות בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים את התאים עם 40 מ&quot;ל של תמיסת המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צינור בסל&quot;ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר tהוא supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ולהוסיף 50 μl של Anti-APC microbeads על העכבר בכל להרדים ישירות גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב דגירה של 20 דקות בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים על ידי הוספת 40 מ&quot;ל של תמיסת חיץ צנטריפוגות בסל&quot;ד 1500 דקות 5. Aspirate supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ב כפולה של 4 מ&quot;ל של הפתרון למאגר כל שלושה עכברים להרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום MACS טורים LS בשדה המגנטי של מפריד MACS מתאים. 1 השתמש בעמודה אחת לשלושה עכברים להרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו עמודות על ידי שטיפה עם 4 מ&quot;ל של תמיסת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ההשעיה התא על העמודים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התאים שהוסרו מהן תוויות העוברים ולשטוף טור עם 4 מ&quot;ל של תמיסת המאגר. לבצע פעולות כביסה ידי הוספת 4 מ&quot;ל של תמיסת חיץ שלוש פעמים. הוסף חוצץ חדש כאשר המאגר טור מתרוקנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של עמודות מ מפריד ו placה כל אחד על גבי 15 צינורות מ&quot;ל פלקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 4 מ&quot;ל של תמיסת חיץ על כל עמודה. מיד לשטוף את התאים המסומנים מגנטית על ידי לחיצה על הבוכנה לתוך הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צינורות בסל&quot;ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל גלולה עם 1 מ&quot;ל של תמיסת חיץ כדורי קבוצתיות צינור יחיד פלקון 15 מ&quot;ל. </li></ol> 4. מיון של בתאי גזע hematopoietic ואת אבות מסורים השושלת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת של מבז המכוונים נגד סמני פני הבאים. לדלל אותם כפי שעולה 500 PBS μL ו FBS 2% להכתים את התאים. <ul type="disc" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 מצומדות ל PE-Cy5 1:200 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> C-Kit מצומדות כדי APC 1:100 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SCA-1 מצומדות כדי ביוטין 1:50 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצומדות כדי FITC 1:50 CD34 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצומדות כדי PE 1:100 FcγR </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צינור מ לשנים הקודמותשל סעיף בסל&quot;ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תערובת מבז כדי גלולה. לנתק את ההשעיה תא בודד על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 20 דקות בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים את התאים עם 14mL של PBS ו FBS 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צינור בסל&quot;ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל streptavidin כמפורט 500 PBS μL ו 2% FBS להכתים את התאים. <ul type="disc" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streptavidin מצומדות כדי APC-Cy7 1:300 </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף הפתרון הצינור. לנתק את ההשעיה תא בודד על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 10 דקות בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים את התאים עם 14 מ&quot;ל של PBS ו - 2% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צינור בסל&quot;ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים μL 500 של PBS ו FBS 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר ולסנן את ההשעיה תא צינור חדש 5 מ&quot;ל כדי אליminate אגרגטים הסלולר זה יכול להפריע הליך המיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μL של 7-AAD (להשתמש בו בדילול 1:100) על השעיית התא על מנת להוציא 7-AAD + מתים תאים ממוינים האוכלוסיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין תאים עם FACSAria BD פי פנוטיפים את הבאים: <ul type="disc" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LKS תאים: לין - C-Kit + SCA-1 + </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LT-HSCs: LKS CD34 - </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ST-HSCs: LKS CD34 + </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> GMPs: לין - C-Kit + SCA-1 FcγR נמוכה גבוהה CD34 + </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברי הפרלמנט האירופי: לין - C-Kit + SCA-1 FcγR נמוך נמוך CD34 - </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CMPs: לין - C-Kit + SCA-1 FcγR נמוך נמוך CD34 + </li></ul></li></ol> 5. נציג תוצאות איור 1 מציג ודוגמא הליך gating אלקטרונייםהנפוצים הציון אבות הלימפה (CLPs) כמו - לין / c-Kit וראה זה / אינטרלוקין (IL)-7R + תאים, לין - / c-Kit + / SCA-1 + (LKS) ולין - / c-Kit + / SCA וראה זה -1 (C-Kit +) תאים, מ C-Kit + שער, אבות מיאלואידית משותף (CMPs) מזוהים FcγR וראה זה CD34 + תאים, אבות granulocyte / מונוציטים (GMPs) כמו FcγR היי CD34 + תאים megakaryocyte / אבות כדורית אדומה (חברי הפרלמנט האירופי) כמו FcγR Lo CD34 - תאים, משער LKS, LT-HSC ו ST-HSC מזוהים CD34 - ו CD34 + תאים, בהתאמה. מח העצם זו ההשעיה התא יכול להיות מועשר על C-Kit + תאים עם חרוזים מגנטיים (איור 2): LT-HSC ו ST-HSC לאחר מכן ניתן למיין על פי ביטוי CD34, כמו גם אבות אחרים על פי הפנוטיפ המתואר לעיל. HSCs יכולה להיות אנה<html> lyzed במיקרוסקופ הדמיה חיה confocal כפי שמוצג באיור 4, שם CD34 - תאים הוכתמו מתחם נוקלאוטיד מחייב quinacrine 11 כמו גם הגרעין האדום (DRAQ5). ב HSCs, אבל לא GMPs, quinacrine חיובי שלפוחית ​​נראים 12 הציטופלסמה. יתר על כן, HSCs מיון יכול לשמש בניסויים פונקציונליים כמו הפגינו 5 דמות, אשר מציג את העלייה cytosolic Ca 2 + ב HSC-LT ידי הפעלת קולטנים-P2 purinergic בחשיפה טריפוספט-אדנוזין (ATP) ו ionomycin 12. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig1.jpg" /> באיור 1. נציג ניתוח נקודה העלילה של לין-BM תאים. הליך gating אלקטרונית על cytometer זרימת לזהות להבקיע אבות hematopoietic ו HSCs מן ההשעיה מח עצם התא מוכתם כמתואר בטקסט פרוטוקול. pload/3736/3736fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. תוכנית להעשרת סלקטיבית של C-Kit + תאים ממח העצם. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig3.jpg" /> איור 3 מחזור התא ניתוח אלקטרונית LKS סגורות CD34 -. HSCs ב בריאים ועכברים עם IBD מוכתמים נוגדנים-67 קי ו DAPI. התאים היו קבועים permeabilized עם Lyse / תקן ו פרם מאגרים ואחריו מכתים עם מצומדות FITC Ki-67 ו DAPI ב 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל. תאים רכיבה הם בקושי אם בכלל לזיהוי LKS CD34 - תא HSCs של פקדים בריא 12. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig4.jpg" /> . איור 4 לחיות מיקרוסקופיה הדמיה confocal של FACS מיון CD34 - HSCs ו GMPs מוכתמים quinacrine נוקלאוטיד מחייב את המתחם הגרעיני ואדום (DRAQ5). את הרביעים קטנים להראות quinacrine קופהשלפוחית ​​itive זוהה בציטופלסמה של HSCs אך לא GMPs. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig5.jpg" /> איור 5. Cytosolic Ca 2 + עליות HSCs מיון עמוסות פורעה-2 ו מגורה עם ה-ATP ו ionomycin. עקבות של תאים בודדים מוצגים. כל התאים היו מגיבים ATP תאי מראה עלייה בולטת cytosolic Ca 2 + אחרי תוספת של ATP.

<ol>
	<li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+units+of+development,+units+of+regeneration,+and+units+in+evolution.">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li><li>Calvi, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche.">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425, 841-846 (2003).</li><li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size.">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425, 836-841 (2003).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li><li>Arai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie2/angiopoietin-1+signaling+regulates+hematopoietic+stem+cell+quiescence+in+the+bone+marrow+niche.">Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche.</a> Cell. 118, 149-161 (2004).</li><li>Essers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo.">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458, 904-908 (2009).</li><li>Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+on+hematopoietic+progenitor+cells+stimulate+innate+immune+system+replenishment.">Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment.</a> Immunity. 24, 801-812 (2006).</li><li>Wilson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135, 1118-1129 (2008).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273, 242-245 (1996).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D., D, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Transplantation+of+Hematopoietic+Stem+Cells+(HSCs.">Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs.</a> J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).</li><li>Romanello, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine/paracrine+stimulation+of+purinergic+receptors+in+osteoblasts:+contribution+of+vesicular+ATP+release.">Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).</li><li>Casati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+regulation+of+hematopoietic+stem+cell+cycling+activity+by+ATP.">Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP.</a> Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).</li><li>Bouma, G., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+and+genetic+basis+of+inflammatory+bowel+disease.">The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).</li><li>Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+variation+in+cycling+of+hematopoietic+stem+cells+in+steady+state+and+inflammation.">Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation.</a> J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח מהיר ומדויק של hematopoiesis בעכברים בודדים (איור 1). זה ניתוח במסגרות ניסיוניות שונות, כולל מודלים Murine של דלקת, אוטואימוניות, כשל חיסוני, מחלות ניווניות, הפרעות מטבוליות וסרטן, מאפשרת מענה את ההשפעה של התנאים פתולוגיים על hematopoiesis. איור 3 מציג ניתוח של פעילות רכיבה על התא LKS מגודרת באופן אלקטרוני CD34 - תאים בעכברים בריאים ועכברים עם מחלות מעי דלקתיות (IBD) 13 על ידי מכתימה עם Ki-67 מב ו DAPI. זה האחרון להציג גידול משמעותי של תאים S / G 2 / M שלבי מחזור התא. זה ניתוח cytometry זרימת מדגים את ההשפעה של דלקת תא T מתווכת על פעילות רכיבה על אופניים HSC 12. שילוב של תיוג מגנטי והעשרה של תאים במח העצם ביטוי c-Kit עם תא ומיון cytometr זרימתy מאפשר בידוד של מטוהרים מאוד אבות היווצרות הדם ואת השושלת HSCs. האוכלוסיות סלולריים שהתקבלו ניתן להשתמש במספר מבחני ללמוד ביולוגיה של התא (איור 4), התמרה האות (איור 5), ביטוי גנים מוסדר מבחינה התפתחותית ו במבחנה, כמו גם בפוטנציאל תפקודית vivo של תת תאים נפרדים. אכן, מועשר מגנטית C-Kit + התאים שימשו לא מוקרן המארחים נקלטים בהצלחה ללמוד וריאציה דינמי של פעילות רכיבה על אופניים HSCs במצב יציב דלקת 14. בידינו ההליך המתואר כאן מאפשר התאוששות יעילה יותר ומהירה יותר של תאים במח העצם מאשר עצם שטיפה עם תשואה ממוצעת של 200,000 תאים LKS לכל עכבר. מספר קטן מאוד של HSCs הצייתניים כי יכול להיות מבודד קישואים אספו עצם של עכברים רבים מהווה מגבלה עבור גישות ניסיוניות הדורשים תאים נוספים. כדי לייתר את מגבלה זו, במקרים רבים ראשונייםמחקרים ניתן לבצע על שפע תאים LKS יותר לדמיין ניתוח ממוקד יותר דייקן שיבוצעו ב - CD34 HSCs הצייתניים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 42401 </td></tr><tr><td> MEM NEAA 100x </td><td> Gibco </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> נתרן פירובט </td><td> Gibco </td><td> 11360 </td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 20012 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td></tr><tr><td> מסננת תא 40 מיקרומטר </td><td> BD פלקון </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> 7-AAD מכתים פתרון </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> Lyse / לתקן את המאגר </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558049 </td></tr><tr><td> פרם חיץ III </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558050 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Ki-67 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556026 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> CD4 (GK1.5) </td><td> eBioscience </td><td> 150041 </td></tr><tr><td> CD8 (53-6.7) </td><td> eBioscience </td><td> 150081 </td></tr><tr><td> CD3 (145-2C11) </td><td> eBioscience </td><td> 150031 </td></tr><tr><td> CD45R (RA3-6B2) </td><td> eBioscience </td><td> 150452 </td></tr><tr><td> CD19 (6D5) </td><td> eBioscience </td><td> 150193 </td></tr><tr><td> Gr1 (RB6-8C5) </td><td> eBioscience </td><td> 155931 </td></tr><tr><td> Tre119 (TER-119) </td><td> eBioscience </td><td> 155921 </td></tr><tr><td> NK-1.1 (PK136) </td><td> eBioscience </td><td> 455941 </td></tr><tr><td> C-Kit (2B8) </td><td> eBioscience </td><td> 171171 </td></tr><tr><td> SCA-1 (D7) </td><td> eBioscience </td><td> 135981 </td></tr><tr><td> CD34 (RAM34) </td><td> eBioscience </td><td> 110341 </td></tr><tr><td> FcγR (2.4G2) </td><td> eBioscience </td><td> 553145 </td></tr><tr><td> Anti-APC microbeads </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-090-855 </td></tr><tr><td> LS עמודות </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-042-401 </td></tr></tbody></table>

phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors

מח העצם הוא האתר העיקרי שבו HSCs ובוגרת יותר כדוריות הדם אבות השושלת מתגוררים ולהבחין באורגניזם הבוגר. HSCs מהווים אוכלוסייה תא גזע pluripotent דקה של תאים המסוגלים לייצר את כל שושלות תאים דם בפעם חיים 1. דיסקציה המולקולרי של הומאוסטזיס HSCs במח העצם יש השלכות חשובות hematopoiesis, אונקולוגיה ורפואה רגנרטיבית. אנו מתארים את פרוטוקול סימון נוגדנים הניאון הליך gating אלקטרוני cytometry זרימת להבקיע תת אבות היווצרות הדם והפצה HSCs בעכברים בודדים (איור 1). בנוסף, אנו מתארים שיטה בהרחבה להעשיר אבות hematopoietic כמו גם לטווח ארוך (LT) ו לטווח קצר (ST) לשחזר HSCs מ אספו מח עצם השעיות התא על ידי העשרת המגנטי של תאים המבטאים C-Kit. הכנת התא וכתוצאה מכך ניתן להשתמש כדי למיין תת שנבחרו במבחנהבמחקרים תפקודית ב vivo (איור 2). שני osteoblasts trabecular 2,3 ו -4 האנדותל סינוסי מהוות נישות תפקודית התומכים HSCs במח העצם. מספר מנגנונים בנישה osteoblastic, כולל משנה של N-cadherin + osteoblasts 3 ואינטראקציה של הקולטן טירוזין קינאז Tie2 לידי ביטוי HSCs עם angiopoietin-1 ליגנד שלה 5 מסכים בקביעת קפאון HSCs. &quot;מצב שינה&quot; במח העצם הוא חיוני כדי להגן על HSCs מ שכפול תשישות בסופו של דבר על פעילות רכיבה על אופניים יתר 6. גירויים חיצוניים הפועלים על תאים של מערכת החיסון המולדת כגון חיוג כמו ligands הקולטן 7 ו אינטרפרון אלפא-6 יכול גם לגרום ריבוי והתמיינות של HSCs לתוך אבות מסורים השושלת. לאחרונה, אוכלוסיית HSCs עכבר רדומים בתוך לין - C-Kit + SCA-1 + CD150 + CD48 - CD34 - האוכלוסייה תוארה 8. מיון של התאים על ביטוי CD34 מן ההשעיה אבות מועשר hematopoietic התא כמתואר כאן מאפשר בידוד של שניהם שוקט עצמית חידוש LT-HSCs ו ST-HSCs 9. הליך דומה על דלדול של תאים החיוביים השושלת ומיון של LT-HSC עם CD48 ו Flk2 נוגדנים תוארה קודם לכן 10. בדו&quot;ח הנוכחי אנו מספקים פרוטוקול אפיון פנוטיפי ו vivo לשעבר לתא מחזור ניתוח של אבות היווצרות הדם, אשר יכול להיות שימושי עבור ניטור hematopoiesis בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. יתר על כן, אנו מתארים FACS מיון הליך HSCs, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להגדיר את גורמי ומנגנוני ויסות עצמי חידוש שלהם, הרחבת והבחנה בביולוגיה של התא התמרה מבחני אות כמו גם להשתלה.

Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors at JoVE.com

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

שיטה לנתח את התפלגות אבות היווצרות הדם במח העצם ב cytometry זרימה, כמו גם ביעילות לבודד מטוהרים מאוד בתאי גזע hematopoietic (HSCs) מתואר. הליך הבידוד מבוסס בעיקרו על העשרת המגנטי של כ-Kit תאים + תא מיון לטהר HSCs ללימודי תאית ומולקולרית.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

phenotypic-analysis-isolation-murine-hematopoietic-stem-cells-lineage

Google

Research

JoVE Journal

Biology

18.5K Views.  Bellinzona (Switzerland). שיטה לנתח את התפלגות אבות היווצרות הדם במח העצם ב cytometry זרימה, כמו גם ביעילות לבודד מטוהרים מאוד בתאי גזע hematopoietic (HSCs) מתואר. הליך הבידוד מבוסס בעיקרו על העשרת המגנטי של כ-Kit תאים + תא מיון לטהר HSCs ללימודי תאית ומולקולרית.

Video: Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These regions are crucial in establishing the blood system in the embryos and leads to the eventual movement of stem cells into the fetal liver and then development of adult stem cells in the bonemarrow. Early hematopoietic stem cells can be isolated from these organs through microdissection of the embryo followed by flow cytometric sorting to obtain a more pure population. It remains unclear how these stem cell populations contribute to the fetal and adult stem cell pool.   Also, our lab investigates how early stem cells functionally differ from fetal and adult hematopoietic stem cells. Furthermore, our lab sorts different populations of hematopoietic stem cells and test their functional role in the context of a variety of genetic models. In this video, we demonstrate the micro-dissection procedure we commonly use and also show the results of a typical FACS plotfter isolating these rare populations, it is possible to perform a variety of functional assays including: colony assays and bone marrow transplants. 



This video shows how to micro-dissect the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region from embryos and use flow cytometry to sort hematopoietic stem cells.

בידוד מוקדם בתאי גזע hematopoietic מ Murine חלמון Sac ו AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

זיהום retroviral של Murine גזע עוברי תאי Embryoid גוף תא נגזר לניתוח של בידול המטופואטיות

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

זיהוי של גורמי מפתח עם הרגולציה עצמית התחדשות והתמיינות בתאי EML המטופואטיות מבשר על ידי ניתוח RNA-רצף

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

מדידת מיסת מיטוכונדריאלי ופוטנציאל ממברנה בתאי גזע ותאי T-תאים על ידי זרימה Cy,

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...