ברצוננו להודות למ Hoxter לקבלת סיוע טכני במיון AECII העכברי העיקרי בין 2 דגימות רמת biosafety. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המחקר הגרמניה (DFG) לDB (SFB587, TP-B12 וBR2221/1-1) ומלגה מבית הספר למחקר ביו הנובר (DFG GSC 108) לרמה של AA. DB נתמך על ידי היוזמה של הנשיא וקרן רשת של הלמהולץ איגוד מרכזי מחקר הגרמני (HGF) תחת W2/W3-029 מספר החוזה.

פרטים בדבר חומרים כימיים וחומרים נדרשים מפורטים בטבלה בסוף הפרוטוקול להלן. לפני תחילת עבודה, להכין 15 צינורות מ&quot;ל (אחת לעכבר) המכילים 4 מ&quot;ל של dispase ומראש חמים להם 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. בבלוק חימום, זמן קצר לחמם aliquots הקטן של 1-% להמס agarose הנמוך (במים) עד 95 מעלות צלזיוס עד שנוזלים ובהמשך קריר עד 45 מעלות צלזיוס עד לשימוש. 1. הכנת הריאות המאוסות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכבר על ידי 2 חנק CO. הערה: אין לבצע עקירת צוואר רחם כמו זה יהיה לפגוע בקנה הנשימה, כך שביצוע פעולות של הפרוטוקול, כגון התקנה של הריאות עם נוזל, לא ניתן לבצע בהצלחה. ודא אובדן הרפלקסים nociceptive. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רסס את העכבר עם אתנול ולעשות עוד חתך לאורך קו אמצע הגחון של הגוף. משוך את הפרווה ועור גחון ובהמשך גם לחתוך בזהירות ולהסיר את הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום לדימום מחודשעכבר על ידי חיתוך ורידי צוואר שמאל וימין (Vena jugularis), כמו גם את עורק הכליה (renalis Arteria). הסר זרימת דם ברקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות לנקב ולאחר מכן להסיר את הסרעפת לחשוף את הלב וריאות על ידי גזירה מהצלעות. קח טיפול מיוחד לא לפגוע ריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם צינורית 26G ומזרק מ&quot;ל 10 מלא בפוספט הקר נאגר מלוחים (PBS), לנקב החדר הימני של הלב והריאות תנקבנה עם PBS עד חופשי של דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך ולהסיר את בלוטות רוק כדי לחשוף את קנה הנשימה. גם לחתוך בזהירות את השריר המקיף את קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס צינורית שכינת 22g לקנה הנשימה, הוצא את המחט ולדחוף קטטר הפלסטיק לכיוון הריאות. תקן את הקטטר על ידי קשירת חתיכה קטנה של חוט סביב קנה נשימה וקטטר. </li></ol> 2. עיכול אנזימתי של רקמת הריאה אם ירצה, מדגם שטיפת רונכואלוואולרית יכול להיותשהוכן על ידי שטיפת הריאות בעזרת הצנתר בקנה הנשימה עם PBS או בינוני לפני השלב הבא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במזרק מ&quot;ל 2, להחדיר בזהירות נפח מקסימאלי של 2 מ&quot;ל של dispase (מ4 aliquot המ&quot;ל) לתוך הריאות דרך הצנתר, כך שכל האונות הם התרחבו באופן מלא. תחליף את המזרק עם מזרק 1 מ&quot;ל מכיל 0.5 מ&quot;ל של הנוזלים agarose וגם להחדיר לתוך הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את המזרק על קטטר כדי למנוע חזרה זרימה של agarose ולכסות את הריאות עם נייר וקרח רקמות מעבדה באופן מיידי. בואו ג&#39;ל agarose במשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את ממחטת נייר, קרח, המזרק וקטטר, לחתוך את קנה הנשימה ובלו הריאות, לב והתימוס מהחזה. לאחר מכן לשטוף את הריאה בצלחת עם PBS ולהסיר את הלב, התימוס וקנה הנשימה שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו את הריאות ל2 מ&quot;ל הנותר של dispase ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 45 דקות. </li></ol> 3. הכנה של הריאותהשעית תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הריאות מdispase ולהעביר אותו לצלחת המכילה 7 מ&quot;ל של anti-CD16/32 נוגדן (מיקרוגרם 1 / ריכוז סופי מ&quot;ל) במדיום DMEM ו100 DNase μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים, מתפורר לחלוטין רקמת הריאה על ידי משייכתו לגזרים ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר ואילו בעדינות מתנדנד על כסא נדנדה להגדיר עד 200 סל&quot;ד. אם תרצה, השעית התא לאחר מכן ניתן לאחסן ב 4 ° C עד לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את השעית התא דרך משתלב ניילון ראשון עם 100 מיקרומטר ולאחר מכן עם 70 מיקרומטר, 48 מיקרומטר ו 30 מיקרומטר נקבוביים. הקפד לשטוף את כל רשת, כמו גם את הצינורות ומנות ביסודיות עם DMEM כדי למזער פגיעה בתאים ולמקסם את התשואה. אם אתה איגום דגימות, זו יכולה להיות מושגת על ידי עובר כאן בהמשך תרחיפי תאים מעכברים של קבוצה אחת דרך אותו המסנן. לחדש את המסנן במקרה של סתימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תלוי בכמות, להעביר לתסנין 50 צינורות מ&quot;ל אחד או יותר וסרכזת במשך 15 דקות ב160 XG ו4 ° C. הסר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא הגלול במאגר 2 מ&quot;ל כדורי אדום תמוגה (0.15 4 Cl M NH, 0.01 מ 3 KHCO, 0.1 המ&quot;מ EDTA, 7.2 pH) ולסיים במהירות תמוגה ידי תוספת של 13 מ&quot;ל של מדיום DMEM. להעביר את הפתרון לצינור וצנטריפוגה מ&quot;ל 15 ל 12 דקות ב 160 XG ו4 ° C. </li></ol> 4. כתמי נוגדן למיון תא Cytometric תזרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בקוקטייל 3 מיליליטר נוגדן ראשוני, שהוכן במדיום DMEM בדילולים מתאימים לcytometry זרימה. (נוגדנים היו בעבר עבור טיטרציה דילולי עבודה אופטימליים ע&quot;י השאירו 1 10 6 splenocytes x בנפח של 100 μl. שימוש 3 מ&quot;ל של קוקטייל הנוגדן הראשוני המכיל את הריכוזים האופטימליים עבור כל אחד מהנוגדנים המשמשים לתאים מנקווה עד חמישה עכברים. אם יותר עכברים הם אספו לדגימה אחת, להתאים את עוצמת קול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכתמים, דגירת התאים למשך 10 דקות בחושךב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים על ידי מילוי צינור המ&quot;ל 15 עם בינוני וצנטריפוגה DMEM ל12 דקות ב160 XG ו4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה הנוגדנים כשהתיר או biotinylated שמשו ב4.1: הסירו את supernatant ו resuspend התאים ב2 - קוקטייל נוגדנים 3 מ&quot;ל משני. כתם עבור 10 דקות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים באמצעות מילוי הצינורית עם DMEM וצנטריפוגה במשך 12 דקות ב160 XG ו4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים ב1 מ&quot;ל של DMEM ומראש דרך המסנן של 50 מיקרומטר סינון לתוך צינור למיון תא. אופציונלי: ספירת התאים כדי להשיג את מספר התא הכולל בהשעית תא הריאות. </li></ol> 5. מיון תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את התאים על ידי vortexing לפני המיון. השתמש נחיר מיקרומטר 100 למיון תא של AECII. לחץ נוזל סיכוך ופליטת ליזר ואורכי גל גילוי תלוי במכשיר המשמש למיון תא cytometric זרימה, כמו גם את השימוש בfluorochromes antibody הליך הכתמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שער על התאים הגבוהים SSC שהם שליליים לfluorochromes משמש לצביעה וסוג לתוך צינור המכיל DMEM. השתמש קדימה גובה פיזור (FSC-H) לעומת אזור (FSC-) וגובה צידת פיזור (SSC-H) לעומת אזור (SSC-) חלונות כדי לכלול את כל כפילויות או אגרגטים סלולריים (ראה פירוט באסטרטגית gating איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לאסוף צנטריפוגה התאים הממוינים ל20 דקות על 280 XG ו4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בתרבית בינונית או חיץ כנדרש לניתוח שלאחר מכן. </li></ol>

<ol>
	<li>Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+epithelial+type+II+cell:+defender+of+the+alveolus+revisited.">Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited.</a> Respir. Res. 2, 33-46 (2001).</li><li>Folkerts, G., Nijkamp, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelium:+more+than+just+a+barrier.">Airway epithelium: more than just a barrier.</a> Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).</li><li>Gereke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+alterations+in+type+II+alveolar+epithelial+cells+in+CD4++T+cell+mediated+lung+inflammation.">Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation.</a> Respir. Res. 8, 47 (2007).</li><li>Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+type+II+epithelial+cells+present+antigen+to+CD4(+)+T+cells+and+induce+Foxp3(+)+regulatory+T+cells.">Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells.</a> Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).</li><li>Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+longer+an+innocent+bystander:+epithelial+toll-like+receptor+signaling+in+the+development+of+mucosal+inflammation.">No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation.</a> Mol. Med. 14, 645-659 (2008).</li><li>Herold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+epithelial+cells+direct+monocyte+transepithelial+migration+upon+influenza+virus+infection:+impact+of+chemokines+and+adhesion+molecules.">Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules.</a> J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).</li><li>Knight, D. A., Holgate, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+airway+epithelium:+structural+and+functional+properties+in+health+and+disease.">The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease.</a> Respirology. 8, 432-446 (2003).</li><li>Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+distribution+in+lung+parenchyma+early+after+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa.">Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).</li><li>Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-+and+Strain-Specific+Host+MicroRNA+Molecular+Signatures+Associated+with+Swine-Origin+H1N1+and+Avian-Origin+H7N7+Influenza+A+Virus+Infection.">Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection.</a> J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).</li><li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae,+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages.">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).</li><li>Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetyl-L-cysteine+(NAC)+inhibit+mucin+synthesis+and+pro-inflammatory+mediators+in+alveolar+type+II+epithelial+cells+infected+with+influenza+virus+A+and+B+and+with+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV).</a> Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).</li><li>Zarbock, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surfactant+protein+C+mutation+A116D+alters+cellular+processing,+stress+tolerance,+surfactant+lipid+composition,+and+immune+cell+activation.">The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation.</a> BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).</li><li>Taubenberger, J. K., Morens, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+of+influenza+virus+infections.">The pathology of influenza virus infections.</a> Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).</li><li>Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+alveolar+type+II+cells.">Isolation and culture of alveolar type II cells.</a> Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).</li><li>Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+murine+alveolar+type+II+cells.">Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).</li><li>Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization,+synthesis,+and+processing+of+surfactant+protein+SP-C+in+rat+lung+analyzed+by+epitope-specific+antipeptide+antibodies.">Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies.</a> J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).</li><li>Phelps, D. S., Floros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+pulmonary+surfactant+proteins+using+immunohistochemistry+and+tissue+in+situ+hybridization.">Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization.</a> Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+human+alveolar+type+II+cells+secrete+antiviral+IL-29+(IFN-lambda+1)+in+response+to+influenza+A+infection.">Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection.</a> J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+response+to+influenza+A+virus+in+differentiated+human+alveolar+type+II+cells.">Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הפרוטוקול שלנו לבידודה של AECII העכברי על ידי הזרימה cytometry מציע דרך מהירה לגישה לתאים ראשוניים מריאת העכבר למגוון שלם של מחקרים פונקציונליים ומולקולריים. ההליך המתואר תשואות אוכלוסיות קיימא והטהורות ביותר של AECII כי הם די במספר ניתוחים שלאחר מכן ישירות, כגון בידוד RNA (רא...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> שכינת צינורית Introcan 22g </td><td> בראון </td><td> REF 4252098B </td><td></td></tr><tr><td> Dispase, 100 מ&quot;ל (5000 יחידות caseinolytic) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> aliquot עד 4 מ&quot;ל בצינורות 15 מ&quot;ל, חנות ב -20 ° C </td></tr><tr><td> Biozym הרובד agarose </td><td> Biozym </td><td> 840101 </td><td> 1% w / v בH 2 O </td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease אני מלבלב שור, 2000 יחידות קוניץ / בקבוקון </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> D4263 </td><td> טרי לפזר תוכן של בקבוקון 1 בשנת 300 DMEM μl </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 22320-022 </td><td> משמש כמסופק על ידי יצרן (G הנמוךlucose, פירובט, HEPES) </td></tr><tr><td> מסננות סלולריות (100 מיקרומטר, 75 מיקרומטר) </td><td> BD פלקון </td><td> 352360, 352350 </td><td></td></tr><tr><td> ניילון רשת (48 מיקרומטר, 30 מיקרומטר) </td><td> Bückmann GmbH </td><td> 03-48/26-1020, 03-30/18-108 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrics 50 מסנן מיקרומטר </td><td> PARTEC </td><td> 04-0042-2317 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD16/CD32 </td><td> BioLegend </td><td> 101302 </td><td> שיבוט 93; מטוהרים </td></tr><tr><td> אנטי עכבר F4/80 </td><td> BioLegend </td><td> 123116 </td><td> השיבוט BM8; APC מצמידים </td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD11b </td><td> BioLegend </td><td> 101208 </td><td> השיבוט M1/70; PE מצמידים </td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD11c </td><td> BioLegend </td><td> 117310 </td><td> השיבוט N418; APC מצמידים </td></tr><tr><td> נגד עכברCD45 </td><td> BioLegend </td><td> 103102 </td><td> שיבוט 30-F11; מטוהרים </td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD19 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0193-83 </td><td> eBio 1D3; PE מצמידים </td></tr><tr><td> עיזים אנטי עכבר IgG polyclonal </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550767 </td><td> polyclonal, PE מצמידים </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> נוגדנים מצמידים fluorochromes החלופי יכולים לשמש, בהתאם cytometer הזרימה והלייזרים הזמינים. </td></tr></tbody></table>

flow cytometric isolation of primary murine type ii alveolar epithelial cells for functional and molecular studies

במהלך השנים האחרונות, התרומה של תאי שומן מסוג II (אפיתל AECII) להיבטים שונים של רגולציה בחיסון הריאות הוכרה יותר ויותר. AECII הוכח להשתתף בייצור ציטוקינים בנשימה מודלקת ואפילו לפעול כהצגת אנטיגן תאים הוא בזיהום והתפתחות מחל תאי T תיווך 1-8. לכן, הם מעניינים במיוחד גם בהקשרים קליניים כגון-תגובתיות היפר נשימה לזרה ו- אנטיגנים עצמיים, כמו גם זיהומים שבמישרין או בעקיפין למקד AECII. עם זאת, ההבנה של הפונקציות החיסוניות המפורטות מוגשות על ידי תאי האפיתל סוג II במכתשיים הריאה הבריאה כמו גם בדלקת שלנו נשארת חלק. מחקרים רבים בנוגע לתפקוד AECII מתבצעים באמצעות עכבר או שורות תאי אפיתל מכתשיים אדם 9-12. עבודה עם שורות תאים בהחלט מציעה מגוון של הטבות, כגון זמינות של מספר גדול of תאים לניתוחים נרחבים. עם זאת, אנו מאמינים כי השימוש בAECII העכברי העיקרי מאפשר הבנה טובה יותר של התפקיד מסוג זה תא בתהליכים מורכבים כמו זיהום או דלקת אוטואימונית. AECII העכברי הראשי יכולה להיות מבודד באופן ישיר מבעלי חיים סובלים מתנאי נשימה כאלה, כלומר הם היו כפופים לכל הגורמים החיצוניים הנוספים ששחקו תפקיד בהגדרה נתחה. כדוגמה, AECII קיימא יכול להיות מבודד מעכברים נגועים intranasally עם שפעת וירוס, אשר בעיקר מטרות אלו תאים לשכפול 13. חשוב מכך, באמצעות זיהום vivo לשעבר של AECII המבודד מעכברים בריאים, מחקרים של תגובות התאיות רכובות על זיהום יכולים להיות רחוקים יותר מורחבים. הפרוטוקול שלנו לבידודה של AECII העכברי העיקרי מתבסס על עיכול האנזימטית של ריאת העכבר ואחריו התיוג של השעית תא וכתוצאה עם נוגדנים ספציפיים לCD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 וCD16/CD32. AECII הגרעיני לאחר מכן זוהה כאוכלוסיית תא הפיזור ללא תווית וצידה הגבוה (SSC גבוה) ומופרד על ידי תא הפעיל פלואורסצנטי מיון 3. בהשוואה לשיטות חלופיות של בידוד תאי האפיתל עיקריים מריאות עכבר, הפרוטוקול שלנו לבידוד cytometric זרימת AECII ידי בחירה שלילית פירוש לא נגע, בת קיימא והטהור ביותר AECII בזמן קצר יחסית. בנוסף, ובניגוד לשיטות מקובלות של בידוד על ידי צילום פנורמי ודלדול של לימפוציטים באמצעות קשירה של נוגדן בשילוב חרוזים מגנטיים 14, 15, מיון תא cytometric זרימה מאפשר אפליה באמצעות גודל תא וגרעיניות. בהתחשב בכך שהמכשור למיון תא זרימת cytometric זמין, ההליך המתואר ניתן ליישם בעלויות נמוכות יחסית. הבא לנוגדנים ואנזימים להתפוררות ריאות, ללא ריאגנטים נוספים כגון מגנטי רגיליםחרוזים נדרשים. התאים המבודדים מתאימים למגוון רחב של מחקרים פונקציונליים ומולקולריים, הכוללים בתרבות מבחנה ומבחני גירוי תאי T, כמו גם transcriptome, Proteome או ניתוחי secretome 3, 4.

בעת מיון השעיות תאי ריאה שבודדו מעכברים בריאים, שער AECII יהיה בדרך כלל מהווה כ 42 ± 10% מכל האירועים. אחוז זה יכול להיות ניכר נמוך יותר כאשר עכברים עם תנאי נשימה כגון זיהום ויראלי משמשים, כהשעית תא הראשונית תכיל שיעור גבוה משמעותי של לימפוציטים ותאים אחרים של מערכת חיסון ש...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies at JoVE.com

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

אנו מתארים את הבידוד המהיר של תאים ראשוניים Murine סוג II (אפיתל מכתשיים AECII) על ידי סלקציה שלילית זרימת cytometric. AECII אלה להראות כדאיות וטוהר גבוה ומתאימים למגוון רחב של מחקרים מולקולריים פונקציונליים ובנוגע לתפקידם בתנאי נשימה כגון מחלות אוטואימוניות או זיהומיות.

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

flow-cytometric-isolation-primary-murine-type-ii-alveolar-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

26.1K Views.  Helmholtz Centre for Infection Research. אנו מתארים את הבידוד המהיר של תאים ראשוניים Murine סוג II (אפיתל מכתשיים AECII) על ידי סלקציה שלילית זרימת cytometric. AECII אלה להראות כדאיות וטוהר גבוה ומתאימים למגוון רחב של מחקרים מולקולריים פונקציונליים ובנוגע לתפקידם בתנאי נשימה כגון מחלות אוטואימוניות או זיהומיות.

Video: Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

ניתוח של נזק אפיתל הופק על ידי<em&gt; Histolytica Entamoeba</em&gt; זיהום

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...