מחקר מומן על ידי משרד ההגנה (ביטחון סוכנות לפרויקטי מחקר מתקדם, פקולטת פרס צעיר, מספר גרנט N66001-09-1-2117) וNINDS (R15NS070734).

1. הכנה כירורגית של בעלי חיים 1. נושאים ניסיוניים השתמש עכברים של קו B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / י המהונדס 9; מתח JAX # 7612) או עכברים אחרים המבטא את הערוץ הכחול הרגיש לאור קטיון, Channelrhodopsin-2, בנוירונים בקליפת המוח מוחיים. יישום של אור הכחול לקליפת המוח של קו B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / י המהונדס גורם לנוירונים פירמידליים מבטאים Channelrhodopsin-2 לdepolarize ולעבור פעולת פוטנציאלי 9,10. כתוצאה מהפעלת התא פירמידלי, interneurons המקומי מופעלים, והשינוי בפוטנציאל מופץ לנוירונים מעבר לאתר של גירוי 10. ביצוע ניתוח בתנאים סטריליים בעמידה בהנחיות הרגולטוריות החלות: כלים כירורגיים וחיטוי softpacks (שדה ניתוחי, פדה גזה); חם חרוז לעקר כל התקני חום הסובלני המושתלים המתכת (cannulas, ברגים וחוטים)עבור 30-שניות; לחטא מכשירים מושתלים חום סובלני (מחבר כבל סיב אופטי, פלסטיק) עם טבילה 10-שניות באתנול; פריטי מכת אתנול טבלו יבש על ידי יישום של אוויר משומר. 2. הרדמה, מיקום ועמילות של גולגולת Stereotaxic השתמש החולה 6 המערכת מולטי המשולבת IMPAC (וטרינר הצייד Inc) כדי להרדים את העכבר. השתמש 5% חמצן Isoflurane/95% לזירוז וIsoflurane/97% חמצן 3% לתחזוקה במהלך ניתוח. מניח את החיה על שמיכה במחזור מים המוגדרים 37 ג אין זה הכרחי כדי לפקח על טמפרטורת גוף אם השמיכה נשמרה בטמפרטורה זו. 3. הכנת הגולגולת להשרשה הכן את אתר החתך על ידי גילוח כל הפרווה מהחלק העליון של הגולגולת. האזור המגולח צריך להרחיב רוחבי מאוזן לאוזן וקדמית, אחורית מהעיניים לסוף האחורי של הגולגולת. לחטא את העור החשוף עם שלוש consecutivמטליות דואר של פולידין ואחריו אתנול. עושה חתך מדיאלי בחלק העליון של הגולגולת, מבין העיניים לחלק האחורי של הגולגולת. נקה את הגולגולת עם מי חמצן ותמיסת מלח סטרילית (0.9% NaCl). שליטה בדימום בכלי צריבה. האתר ולסמן גבחת ומבדה לקביעת קואורדינטות stereotaxic. קואורדינטות Stereotaxic לתצורות גירוי אלקטרודה / optogenetic שהשתמשנו בי מוצגות בטבלת 1 והראו סכמטי באיור 1 א. 4. הכנה של אתרי השתלות בגולגולת השתמש תרגיל שיניים במהירות גבוהה עם קצת 0.5mm כדור Burr להקים כל אתר שיושתל בגולגולת. Chamfer שולים החיצוניים של כל חור באמצעות 0.7 מ&quot;מ קצת Burr כדור כדי להקל על החדרת בורג. 5. כניסה ואבטחה של cannulas, EMG הובלות והובלות EEG הכנס ברגי EEG (0.8mm באורך, עם 2 סנטימטר של 3 ללא ציפוי0-מד נחושת משומר אוטובוס מראש חוט מולחם-לדפוק את הראש) לתוך החורים ולהסיע אותם ביד עם המברג מחורר מהפכות כ 4-5 להשיג את העומק הרצוי. החזק cannulas מדריך במקום עם בעל stereotaxic צינורית ואז להדביק אותם לגולגולת ועוגנים במלט אקרילי. כל מדריך צינורית צריכה להכיל קנולה / stylet דמה (פלסטיק אחד, חלק # C312 DC \ 1) ממועד הניתוח לזמן של ניסויים (10-14 ימים) כדי לשמור על patency. 6. סגירת אתר כירורגי ברגע אא&quot;ג וcannulas מדריך ממוקמים בגולגולת, האג&quot;ח יחד עם מלט אקריליק שיניים (שיני לאנג - Ortho-Jet מלט). לאחר סטי בטון, למקם את מחבר הפלסטיק (חלק טכנולוגית Pinnacle # 8402) מעל תלולית הבטון היבשה. את הקצוות של חוטים הנובעים מהפניות EEG למגעים במחבר פלסטיק הלחמה. עוטף את החוט מוביל במלט. ואז למשוך את חוטי EMG דרך השריר העורפיעל ידי זזה שלהם לתוך החבית של מחט 21ga פלח שריר. לקשור הקשר של תפר ניילון 5-0 של מנתח כפול סביב חוטים אלה רק דיסטלי למקום שבו הם יוצאים לשריר. לתפור בחזרה את העור שבוטל כדי לגשת לרקמת השריר עם קשרי מנתח נקטעו בודדים, באמצעות חיתוך הפוך מחט P-3 ותפר הניילון 5-0. 7. שיכוך כאבים שלאחר הניתוח והתאוששות לנהל עצירות כמשכך כאבים (0.1 מ&quot;ג / ק&quot;ג, תת עורי) וflunixin meglumine (0.1 מ&quot;ג / ק&quot;ג, תת עורי) כאנטי דלקתי מייד לאחר ניתוח, ומדי יום בימים 1-2 אחרי הניתוח. אפשר חיות להתאושש בתנאי דיור מושבה רגילים לפחות שבעה ימים לפני הניסויים. ללא טיפול נוסף מעבר לדיור מושבה הסטנדרטי, cannulas ניתן צפוי להישאר פטנט על לפחות שבועות עם stylets השכינה מובטחת במקום. חיישני EEG ו EMG צפוי גם לשמור עלפונקציונלי למשך זמן זה. 2. דור של אור מתוזמן קטניות 1. תכנות של יחידת Stimulus MC חבר את יחידת MC-Stimulus (מערכות רבי ערוצים) באמצעות חיבור USB למחשב שולחני. השתמש בגיליון אלקטרוני, כגון ממשק משתמש MC-Stimulus לתכנת את יחידת Stimulus MC. הזן את מתח TTL הרצוי (היגיון טרנזיסטור טרנזיסטור) לתקופה ב, את משך זמן הגירוי לסירוגין תקופות, במספר המחזורים בשניים רצויים, והמספר הכולל של מחזורים חוזרים ונשנים לגירוי המפגש כולו. לפרטים נוספים עיינו במדריך טכני MC-Stimulus: 3. ייצור / הרכבה של הסיבים האופטיים Prתוארי למשלוח אור לקליפת המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האספקה ​​וציוד הדרוש נמצאות ב: <a href="http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf" target="_blank">http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיתוך וליטוש של כבלי סיבים אופטיים. <a href="http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf" target="_blank">Http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf</a> </li></ol> 4. הרכבה של מערכת גירוי Optogenetic מכרסמת 1. ממשק של יחידת MC-Stimulus וליזר ברגע שיחידת MC-Stimulus מתוכנת, להריץ אותו כמחולל אותות עצמאי של ינארי 5-Volt / כיבוי האות. חבר את יחידת MC-Stimulus ליחידת הכח מופעל TTL של הליזר עם מחברי BNC. 2. הפקת פלט ליזר באמצעות כבל סיב אופטי השתמש בתצוגה הדיגיטלית וחיוג הספק משתנה של יחידת כוח הליזר לידניly להתאים את תפוקת החשמל של הליזר. חבר את יחידת כוח הליזר לליזר דרך כבל סרט. חבור את מתאם סיבים של הליזר למחבר FC זכר על כבל תיקון הסיבים האופטי (3 מ &#39;אורך, 200 מיקרומטר קוטר סיבי זכוכית הולכה עטופה באור משקף חיפוי פולימר Acrylate) נקבת FC (מחבר כובעון מתכת). 3. שינוע הליזר לבעלי החיים: מחלף רוטרי חבר את כבל הסיב האופטי שמקורו (3 מ &#39;אורך) וכבל הסיב האופטי המשלוח (45 סנטימטר אורך) להתנגדות לקצוות של המפרק הסיבובי האופטי encasing שתי עדשות collimating (עדשות דוריים). המפרק הסיבובי הסיבים האופטי משמש כמחלף: כחיה נעה על הכלוב שלו, המפרק הסיבובי מסתובב כדי למנוע שבירה של כבלי הסיבים האופטיים. השתמש בקשרי כבל פלסטיק כדי להצמיד למחלף מתכת עומד להציב מעל הכלוב הגלילי שבחיה נמצא. 4. מצרף משלוח סיב אופטיכבלים לראש לרסן את העכבר באמצעות יד אחת כדי להצמיד את העכבר בכף יד. אוריינט הראש בין אמצעו של הנסיין ואצבע המורה. הסר את צינורית הדמה ממדריך הצינורית הציבה לצינורית הסיבים האופטיות. נקה את צינורית המדריך של פסולת באמצעות מחט סטרילית 25ga. הכנס את כבל הסיב האופטי ביד ולהצמיד אותו לצינורית מדריך הסיבים האופטיות עם כובע בורג הליכים הוצלו מצינורית דמה. לשלוט בעומק ההחדרה של כבל הסיב האופטי במוח על ידי פקעת תפר הקשור בכבל הסיב האופטי במרחק קבוע מהקצה שטוח בקע. המנגנון הניסיוני כולו מוצג בתרשים 1B. 5. מדידה של שינה EEG מוגדר וריכוז לקטט במהלך גירוי Optogenetic 1. Precalibration של חיישן קטט טרום כיול של חיישן קטט מבוצע עם במבחנההערכה (חלק Pinnacle טכנולוגיה # 7000-K1-T). החיישן הוא מתאזן בנאגר מלוח פוספט (pH 7.4), ואז נחשף לשלושה ריכוזים של L-חומצת חלב באופן הדרגתי לפרוטוקולי יצרן. 2. החדרת חיישן קטט וכבלי EEG הכנס את החיישן מראש המכויל לצינורית הגולגולת הרכובה קטט המדריך באופן זהה להליך החדרת הסיב האופטי הכבל (סעיף 4.4). חבר את החיישן לקטט קדם המגבר של 8400 biosensor Pinnacle עם מחברי תקע דו קוטביים. צרף קדם המגבר הזה למחבר 8-PIN בheadmount המושתל-ניתוח. 3. הקמת עוצמת גירוי Optogenetic לפני איסוף נתונים, השתמש בכפתור בקרת עוצמת הליזר כדי להתאים את עוצמת גירוי optogenetic. המשרעת של תגובת EEG תשתנה פני בעלי חיים, בשל גורמים שלא נחקרו באופן שיטתי,<html> ד חייב להיות מאומת על ידי בדיקה חזותית בתחילת הגירוי. בפועל, עוצמת 80-120 μWatts תהיה בדרך כלל לייצר גידול במשרעת EEG של כ 50% בתדירות של גירוי. -Post hoc ניתוח מהיר התמרה (ראה סעיף 5.5) יש צורך לכמת את הבהירות המוחלטת של התגובה. 4. איסוף נתונים איסוף נתונים באמצעות מערכת 8400 Pinnacle: <a href="http://pinnaclet.com/pal-8400.html" target="_blank">http://pinnaclet.com/pal-8400.html.</a> 5. עיבוד נתונים עם Neuroscore לסווג לישון מדינות על ידי בדיקה ויזואלית של נתוני EEG וEMG עם Neuroscore הממשק (DataSciences, בינלאומי: <a href="http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp" target="_blank">http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp)</a> או Sirenia הממשק (Pinnacle הטכנולוגיה:f = היעד &quot;http://www.pinnaclet.com/sirenia.html&quot; = &quot;_blank&quot;&gt; http://www.pinnaclet.com/sirenia.html). נתוני תהליך בתקופות של עשר שניות, בעקבות שינה, ללא תנועת עיניים מהירות, או שנת תנועות עיניים מהירות המבוססת על EEG וחברת EMG. שמור את הנתונים כגיליונות אלקטרוניים של Microsoft Excel לניתוח נוסף ובדיקה סטטיסטית.

<ol>
	<li>Magistretti, P., Zigmond, M. J., Bloom, F. E., Landis, S. C., Roberts, J. L., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Energy+Metabolism.">Brain Energy Metabolism.</a> Fundamental Neuroscience. , 389-413 (1999).</li><li>Maquet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+glucose+utilization+during+sleep-wake+cycle+in+man+determined+by+positron+emission+tomography+and+[18F]2-fluoro-2-deoxy-D-glucose+method.">Cerebral glucose utilization during sleep-wake cycle in man determined by positron emission tomography and [18F]2-fluoro-2-deoxy-D-glucose method.</a> Brain Res. 513 (1), 136-143 (1990).</li><li>Buchsbaum, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+cerebral+glucose+metabolic+rate+in+human+sleep+assessed+by+positron+emission+tomography.">Regional cerebral glucose metabolic rate in human sleep assessed by positron emission tomography.</a> Life Sci. 45 (15), 1349-1356 (1989).</li><li>Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+cerebral+glucose+utilization+in+non-rapid+eye+movement+sleep.">Local cerebral glucose utilization in non-rapid eye movement sleep.</a> Nature. 297 (5864), 325-327 (1982).</li><li>Pappenheimer, J. R., Koski, G., Fencl, V., Karnovsky, M. L., Krueger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+sleep-promoting+factor+S+from+cerebrospinal+fluid+and+from+brains+of+sleep-deprived+animals.">Extraction of sleep-promoting factor S from cerebrospinal fluid and from brains of sleep-deprived animals.</a> J. Neurophysiol. 38 (6), 1299-1311 (1975).</li><li>Borbely, A. A., Achermann, P., Kryger, M. H., Roth, T., Dement, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+homeostasis+and+models+of+sleep+regulation.">Sleep homeostasis and models of sleep regulation.</a> Principles and Practice of Sleep Medicine. , 377-390 (2004).</li><li>Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+analysis+of+local+field+potentials+and+unit+discharges+in+cat+cerebral+cortex+during+natural+wake+and+sleep+states.">Spatiotemporal analysis of local field potentials and unit discharges in cat cerebral cortex during natural wake and sleep states.</a> J. Neurosci. 19 (11), 4595-4608 (1999).</li><li>Astrup, J., Sorensen, P. M., Sorensen, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+glucose+consumption+related+to+Na+-K++transport+in+canine+brain.">Oxygen and glucose consumption related to Na+-K+ transport in canine brain.</a> Stroke. 12 (6), 726-730 (1981).</li><li>Arenkiel, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+light-induced+activation+of+neural+circuitry+in+transgenic+mice+expressing+channelrhodopsin-2.">In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).</li><li>Mateo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Optogenetic+Stimulation+of+Neocortical+Excitatory+Neurons+Drives+Brain-State-Dependent.">In Vivo Optogenetic Stimulation of Neocortical Excitatory Neurons Drives Brain-State-Dependent.</a> Curr. Biol. , (2011).</li><li>Wisor, J. P., Clegern, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+short-term+slow+wave+sleep+homeostasis+and+its+disruption+by+minocycline+in+the+laboratory+mouse.">Quantification of short-term slow wave sleep homeostasis and its disruption by minocycline in the laboratory mouse.</a> Neurosci. Lett. 490 (3), 165-169 (2011).</li><li>El Yacoubi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral,+neurochemical,+and+electrophysiological+characterization+of+a+genetic+mouse+model+of+depression.">Behavioral, neurochemical, and electrophysiological characterization of a genetic mouse model of depression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6227-6232 (2003).</li><li>Tsunematsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+optogenetic+silencing+of+orexin/hypocretin+neurons+induces+slow-wave+sleep+in+mice.">Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).</li><li>Le, S., Gruner, J. A., Mathiasen, J. R., Marino, M. J., Schaffhauser, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+ex+vivo+receptor+occupancy+and+wake-promoting+activity+of+selective+H3+receptor+antagonists.">Correlation between ex vivo receptor occupancy and wake-promoting activity of selective H3 receptor antagonists.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 325 (3), 902-909 (2008).</li><li>Burmeister, J. J., Palmer, M., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-lactate+measures+in+brain+tissue+with+ceramic-based+multisite+microelectrodes.">L-lactate measures in brain tissue with ceramic-based multisite microelectrodes.</a> Biosens. Bioelectron. 20 (9), 1772-1779 (2005).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat. Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).</li><li>Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortically-induced+coherence+of+a+thalamic-generated+oscillation.">Cortically-induced coherence of a thalamic-generated oscillation.</a> Neuroscience. 92 (2), 427-443 (1999).</li><li>Liu, Z. W., Faraguna, U., Cirelli, C., Tononi, G., Gao, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+wake-related+increases+and+sleep-related+decreases+in+synaptic+strength+in+rodent+cortex.">Direct evidence for wake-related increases and sleep-related decreases in synaptic strength in rodent cortex.</a> J. Neurosci. 30 (25), 8671-8675 (2010).</li><li>Iwai, Y., Honda, S., Ozeki, H., Hashimoto, M., Hirase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+head-mountable+LED+device+for+chronic+stimulation+of+optogenetic+molecules+in+freely+moving+mice.">A simple head-mountable LED device for chronic stimulation of optogenetic molecules in freely moving mice.</a> Neurosci. Res. 70 (1), 124-127 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

השיטות שהוצגו כאן מאפשרים אחד כדי למדוד את הקשר בין שינה ושינויים בריכוז המוח של חומצת חלב ביניים glycolytic על ציר זמן אינו אפשרי בעבר. בעלי חיים עוברים מעברים ספונטניים בין התעוררות, וNREMS REMS. יתר על כן, אנו מסוגלים להחיל גירויי optogenetic תוך חיים עוברים המעברים האלה. נתונים שנאספו עד כה מראים כי השפעת גלים הם ספונטנית ומושרה בreadout של biosensor מונואמין מבוסס חומצת חלב. אפשר לבנות מערכות דומות לזו שתוארה כאן עם ציוד ותוכנות ממקורות אחרים ניסיוניות. מקורות חלופיים של מערכות מתאימות למכרסמי polysomnographic כוללים נתונים בינלאומיים 11 מדעים, ו12 Embla. תוכנה לסיווג מצב שינה זמינה מ 12 Somnologica, שנת 13 ורשם Icelus 14. biosensors Amperometric למדידת חומצת חלבזמינים 15 Quanteon. למיטב ידיעתנו, Pinnacle הטכנולוגיה מציעה המערכת היחידה שבי biosensors, EEG ו EMG ניתן למדוד בו זמנית עם ממשק תוכנה אחד. יש לנו למדוד שינויים בריכוז חומצת חלב והן דיסטלי EEG לאתר של גירוי optogenetic. תופעות של גירוי optogenetic באתרי דיסטלי כאלה מאשר כי שינויים אפשריים optogenetically מושרים מופצים מעבר לאתר של גירוי. אפשר למדוד פרמטרים אלו ישירות בתוך השטח של קליפת המוח נחשף לאור, אבל מדידתם במקום אחר מבטיחה כי תגובות הן תוצאה של גל הפצה, בניגוד לתגובה של artifactual biosensor לחשיפה לאור (כפי שתועד 16). Optogenetically מושרה גלים 1-הרץ נבדלים משנת גלים איטיים שבהם אינם מסונכרנים על ידי נוירונים מקרינים subcortical. כיוון שכך, הם אינם מתרחשים ביחסי זמן סטריאוטיפיים עם אחרים הקשורים לשינהתופעות, כגון צירים וקומפלקסי K-17. אם גירוי optogenetic מחק תופעות אחרות של גלים איטיים טבעיים (כמו שינויים בכוח הסינפטי 18 או שינויים בhomoeostatic פעילות גלים איטית EEG 11) אינו ודאית. שיטות שתוארו כאן יכולים לשמש כדי לענות על שאלה זו במחקרים עתידיים. בעלי חיים קשורים על ידי שני חוטי שינוע biopotentials מחיה למחשב וכבל הסיב האופטי המעביר אור כחול לקליפת המוח. שתי המערכות האלחוטיות EEG / bioanalyte הקלטה (http://pinnaclet.com/biosensor-recording-sys/fixed-frequency.html) וההתקנים אלחוטיים optogenetic גירוי 19 כבר דיווחו. עם זאת, שניים לא שולבו מערכת עובדת אחת לידיעתנו. למרות האיפוק קשור עם כבל קשירה, בעלי חיים לעתים קרובות ראו נעו סביב כלוביהם, וכמות זמן מוקדש לשינה אופיינית לעכברים למדו ביםמצבים ניסיוניים imilar. חיישנים תואמים עם מערכת זו זמינים למדידת bioanalytes האחר, כולל גלוקוז וגלוטמט. המערכת לכן עשויה להיות שימושי במצבים ניסיוניים אחרים שבהתנהגות, ריכוזי EEG וbioanalyte מנותחים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> שיא מאוס מדריך קנייה </td><td> Pinnacle טכנולוגיה / השיא Inc </td><td> 7032 </td><td></td></tr><tr><td> Biosensor קטט </td><td> Pinnacle טכנולוגיה </td><td> 7004 </td><td></td></tr><tr><td> ראש ההר </td><td> Pinnacle טכנולוגיה </td><td> 8402 </td><td></td></tr><tr><td> מערכת ההקלטה Biosensor שינה / </td><td> Pinnacle טכנולוגיה </td><td> 8400-K1-SL </td><td> 2 ערוצי ה-EEG, 1 EMG ערוץ, וbiosensor 1 </td></tr><tr><td> עכבר קשור במבחנת ערכת כיול </td><td> Pinnacle טכנולוגיה </td><td> 7000-K1-T </td><td></td></tr><tr><td> סיבים אופטי מדריך קנייה </td><td> פלסטיקת One </td><td> C312G </td><td> 21 מד מדריך קנייה </td></tr><tr><td> קנה בובה </td><td> פלסטיקת One </td><td> C312DC </td><td> Dummy מד 21 </td></tr><tr><td> סופר סיבי יהלומים </td><td> Thorlabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> סיבי המחבר crimp כולים </td><td> Thorlabs </td><td> CT042 </td><td></td></tr><tr><td> אבובי מזלוג </td><td> Thorlabs </td><td> FT030 </td><td> 03,0 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> Thorlabs </td><td> T10S13 </td><td> מקס דיא. 0.012 </td></tr><tr><td> חשפנית Tube מזלוג </td><td> Thorlabs </td><td> FTS3 </td><td></td></tr><tr><td> סיבי Multimode חיפוי קשיחים חשופים </td><td> Thorlabs </td><td> BFL37-200 </td><td> Core מיקרומטר 200, 0.37 NA </td></tr><tr><td> חוט חיתוכים / Kevlar ירס </td><td> Thorlabs </td><td> T865 </td><td></td></tr><tr><td> אפוקסי סיבים אופטיים </td><td> Thorlabs </td><td> F112 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> כלי חשפנית סיבים </td><td> Thorlabs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> צלחת זכוכית פוליש </td><td> Thorlabs </td><td> CTG913 </td><td></td></tr><tr><td> גומי הליטוש Pad </td><td> Thorlabs </td><td> NRS913 </td><td></td></tr><tr><td> עין זכוכית מגדלת </td><td> Thorlabs </td><td> JEL10 </td><td></td></tr><tr><td> קים מגבונים </td><td> Thorlabs </td><td> KW32 </td><td></td></tr><tr><td> אוויר דחוס </td><td> Thorlabs </td><td> CA3 </td><td></td></tr><tr><td> הפוליש פאק </td><td> Thorlabs </td><td> D50-xx </td><td></td></tr><tr><td> היקף פיקוח סיבים </td><td> Thorlabs </td><td> CL-200 </td><td></td></tr><tr><td> סרטי ליטוש </td><td> Thorlabs </td><td> LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P </td><td></td></tr><tr><td> קצה המחבר FC / PC </td><td> Thorlabs </tד&gt; <td> 30126G2-240 </td><td> 240 בורים מיקרומטר, אס כפת מתכת </td></tr><tr><td> יחידת Stimulus MC </td><td> מערכות רבות ערוצים </td><td> STG-4002 </td><td></td></tr><tr><td> תוכנת Stimulus MC </td><td> מערכות רבות ערוצים </td><td> MC-Stimulus V 2.1.5 </td><td></td></tr><tr><td> ליזר הכחול </td><td> CrystaLaser </td><td> CL473-050-0 </td><td></td></tr><tr><td> אספקת חשמל ליזר </td><td> CrystaLaser </td><td> CL2005 </td><td></td></tr><tr><td> משותף רוטרי סיבים אופטיים </td><td> עדשות דוריים </td><td> FRJ-V4 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלה 2. אספקה ​​וציוד. </td></tr></tbody></table>

simultaneous electroencephalography, real-time measurement of lactate concentration and optogenetic manipulation of neuronal activity in the rodent cerebral cortex

למרות שהמוח מהווה פחות מ 5% מהגוף על ידי מסה, היא מנצלת כרבע מגלוקוז בשימוש על ידי הגוף במנוחה 1. הפונקציה של שינה ללא תנועת עיניים מהירות (NREMS), החלק הגדול ביותר של שינה בזמן, אינה ודאית. עם זאת, מאפיין בולט אחד NREMS הוא ירידה משמעותית בשיעור ניצול הגלוקוז במוח ביחס לערות 2-4. זה וממצאים אחרים הוביל לאמונה מרוויחה כי שינה ממלאת תפקיד הקשור לחילוף חומרים במוח. ובכל זאת, את המנגנונים בבסיס הירידה בחילוף חומרים של הגלוקוז במוח במהלך NREMS יישארו להובהרו. תופעה אחת קשורה NREMS שעשוי להשפיע על קצב חילוף חומרים במוח היא המופע של גלים איטיים, תנודות בתדרים של פחות מ 4 רץ, באלקטרו 5,6. גלים איטיים אלו שאותרו ברמה של הגולגולת או משטח קליפת מוח מוחות משקפיםתנודות של נוירונים בסיסיים בין מדינת depolarized / ומדינה hyperpolarized / למטה 7. במהלך את המדינה, תאים אינם עוברים פוטנציאלי פעולה למרווחים של עד כמה אלפיות שניים 100. שיקום הדרגתי ריכוז יוני עוקבים לפוטנציאל פעולה מייצג עומס מטבולים משמעותי על התא 8; העדר פוטנציאל פעולה במצבים למטה קשורים NREMS עשוי לתרום לחילוף חומרים יחסית להעיר מופחת. שני אתגרים טכניים היו צריכים טיפול במסגרת מערכת היחסים ההיפותטי הזה כדי להיבדק. ראשית, היה צורך למדוד את חילוף חומרי glycolytic מוחות עם רזולוציה משקפת את הדינמיקה של EEG המוחי זמנית (כלומר, על שניות ולא דקות). כדי לעשות זאת, מדדה את הריכוז של חומצת חלב, התוצר של הגליקוליזה אירובית, ולכן readout של קצב חילוף חומרים של הגלוקוז במוחם של עכברים. קטט היהנמדד באמצעות חיישן קטט מונואמין מבוסס זמן אמת הגלומה בקליפת המוח הקדמית. מנגנון החישה מורכבת מאלקטרודה הפלטינה אירידיום המוקף בשכבה של מולקולות מונואמין קטט. חילוף חומרים של חומצת חלב על ידי מונואמין קטט מייצר מי חמצן, שמייצר זרם באלקטרודה הפלטינה אירידיום. אז ramping את הגליקוליזה המוח מספק עלייה בריכוזו של המצע למונואמין חומצת החלב, אשר לאחר מכן בא לידי ביטוי בעלייה נוכחית בהאלקטרודה החישה. זה היה בנוסף צורך למדוד המשתנים הללו תוך מניפולצית העירור של קליפת המוח, כדי לבודד את המשתנה הזה מהיבטים אחרים של NREMS. אנחנו פתחנו מערכת ניסיונית למדידה בו זמנית של פעילות עצבית דרך elecetroencephalogram, מדידת שטף glycolytic דרך biosensor חומצת חלב, והמניפולציה של פעילות עצבית בקליפת מוח מוח באמצעות הפעלת optogenetic של Pyraהנוירונים midal. יש לנו מנוצלים במערכת זו כדי לתעד את היחסים בין צורות גל שינה הקשורות electroencephalographic ואת הדינמיקה מהרגע לרגע של ריכוז חומצת חלב בקליפת המוח. הפרוטוקול עשוי להיות שימושי עבור כל אדם המעוניין ללמוד, במכרסמים מתנהגים בחופשיות, קשר בין הפעילות עצבית שנמדדה ברמת electroencephalographic והאנרגטיקה סלולרית בתוך המוח.

<html> כפי שמוצג באיור 2, עכבר המצויד לגירוי optogenetic וחומצת חלב / EEG / איסוף נתוני EMG עבר מעברי שינה / בעקבות ספונטניים מדינה תוך ריכוז חומצת חלב מוח EEG, EMG והיו במעקב רציף. נוכחיים בחיישן חומצת החלב מוגבר בתקופות של משרעת EEG נמוכה וירידה בתקופות של משרעת EEG גבוהה. כפי שמוצג באיור 3, שני הערוצים של EEG הם מגיבים לגירויי optogenetic נמסרו בקליפת המוח הקדמית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4328/4328fig1.jpg" /> איור 1). ייצוג סכמטי של אלקטרודות המושתלות בניתוח-EEG, חיישן חומצת חלב והצינורית לגירוי optogenetic. B) ייצוג סכמטי של המערכת הניסיונית כולו. 1, עופרת EEG 1. 2, עופרת EEG 2. GND, בורג הקרקע EEG. Ref, בורג ההתייחסות EEG.tp :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/4328/4328fig1large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4328/4328fig2.jpg" /> איור 2. איסוף נתונים מוכיח כי דוגמא חית מעבר לתוך ומתוך שינה תוך instrumented להקלטות באמצעות תצורת גירוי biosensor / optogenetic לראות בתרשים 1 א &#39;. גירוי Optogenetic לא הוחל בפרק הזמן שמוצג כאן. בעקבות (W) ושני תת הסוגים של שינה, שנת תנועות עיניים מהירה (R) ושנת תנועות עיניים המהירות שאינן (N) מוגדרים המבוססים על אלקטרו (EEG) וelectromyogram (EMG). המשרעת EMG הגבוה מלווה במשרעת EEG נמוכה מגדיר בעקבות. משרעת הנמוך EMG מלווה משרעת מגדיר שנת תנועות עיניים מהירה EEG נמוך. משרעת הנמוך EMG מלווה משרעת גבוהה EEG מגדיר שנת תנועות עיניים שאינן מהירה. קטטעליות נוכחיות biosensor כפונקציה של משרעת EEG (כלומר., במהלך היא בעקבות ושנת תנועות עיניים מהירה) נמוכה ונופלות כפונקציה של משרעת גבוהה EEG (כלומר., בזמן שנת תנועות עיניים המהירות שאינן). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4328/4328fig3.jpg" /> איור 3. נתוני נציג בעלי חי נתונים לגירוי optogenetic 1 ברץ () או 10 רץ (ב &#39;) באמצעות גירוי תצורת biosensor / optogenetic לראות בתרשים 1 א&#39;. עקבות מייצגות הקלטות 60-sec. העיתוי של מרווח 30-sec של גירוי מצוין בחלק העליון של כל לוח. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4328/4328fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> חזיתית גירוי-יחסית לגבחת (מ&quot;מ) </td></tr><tr><td></td><td> נמלה / Post </td><td> Lat </td><td> D / V </td></tr><tr><td> EEG1 </td><td> 2.2 </td><td> 1.6 </td><td> - </td></tr><tr><td> EEG2 </td><td> 2.2 </td><td> -1.6 </td><td> - </td></tr><tr><td> עיון </td><td> -3.5 </td><td> -1.5 </td><td> - </td></tr><tr><td> קרקע </td><td> -3.5 </td><td> 1.5 </td><td> - </td></tr><tr><td> קניית קטט </td><td> 1.0 </td><td> 1.6 </td><td> -0.5 </td></tr><tr><td> Optogenetic קנייה </td><td> 1.0 </td><td> -1.6 </td><td> -0.5 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. Stereotaxic קואורדינטות של התקנים מושתלים בניתוח.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral C

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

הליך מתואר למניפולציה של פעילות תאי עצב בקליפת מוח פירמידליים מוחיים optogenetically תוך אלקטרו, electromyogram, וריכוז חומצת חלב מוחות המנוטרים. הקלטות ניסיוניות מבוצעות על עכברי כבלים-כבולים בזמן שהם עוברים מחזורי שינה / בעקבות ספונטניים. Optogenetic ציוד מורכב במעבדה שלנו; ציוד הקלטה זמין מסחרי.

Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

simultaneous-electroencephalography-real-time-measurement-lactate

Google

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.1K Views.  Washington State University. הליך מתואר למניפולציה של פעילות תאי עצב בקליפת מוח פירמידליים מוחיים optogenetically תוך אלקטרו, electromyogram, וריכוז חומצת חלב מוחות המנוטרים. הקלטות ניסיוניות מבוצעות על עכברי כבלים-כבולים בזמן שהם עוברים מחזורי שינה / בעקבות ספונטניים. Optogenetic ציוד מורכב במעבדה שלנו; ציוד...

Video: Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in which functional MRI data and in vivo intracortical recording can be performed simultaneously. The combination of MRI and electrical recording is technically challenging because the electrodes used for recording distort the MRI images and the MRI acquisition induces noise in the electrical recording. To minimize the mutual interference of the two modalities, glass microelectrodes were used rather than metal and a noise removal algorithm was implemented for the electrophysiology data. In our studies, two microelectrodes were separately implanted in bilateral primary somatosensory cortices (SI) of the rat and fixed in place. One coronal slice covering the electrode tips was selected for functional MRI. Electrode shafts and fixation positions were not included in the image slice to avoid imaging artifacts. The removed scalp was replaced with toothpaste to reduce susceptibility mismatch and prevent Gibbs ringing artifacts in the images. The artifact structure induced in the electrical recordings by the rapidly-switching magnetic fields during image acquisition was characterized by averaging all cycles of scans for each run. The noise structure during imaging was then subtracted from original recordings. The denoised time courses were then used for further analysis in combination with the fMRI data. As an example, the simultaneous acquisition was used to determine the relationship between spontaneous fMRI BOLD signals and band-limited intracortical electrical activity. Simultaneous fMRI and electrophysiological recording in the rodent will provide a platform for many exciting applications in neuroscience in addition to elucidating the relationship between the fMRI BOLD signal and neuronal activity.

We have developed a method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and electrophysiological recording in the rodent brain, providing a platform for the investigation of the relationship between neural activity and the blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signal.

FMRI Electrophysiology סימולטני במוח מכרסמים

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic Entrainment התנודות תטא בהיפוקמפוס ב מתנהג עכברים

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Combined Transcranial Magnetic Stimulation and Electroencephalography of the Dorsolateral Prefrontal Cortex

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic field pulses. The initiation of cortical activation or its modulation depends on the background activation of the neurons of the cortical region activated, the characteristics of the coil, its position and its orientation with respect to the head. TMS combined with simultaneous electrocephalography (EEG) and neuronavigation (nTMS-EEG) allows for the assessment of cortico-cortical excitability and connectivity in almost all cortical areas in a reproducible manner. This advance makes nTMS-EEG a powerful tool that can accurately assess brain dynamics and neurophysiology in test-retest paradigms that are required for clinical trials. Limitations of this method include artifacts that cover the initial brain reactivity to stimulation. Thus, the process of removing artifacts may also extract valuable information. Moreover, the optimal parameters for dorsolateral prefrontal (DLPFC) stimulation are not fully known and current protocols utilize variations from the motor cortex (M1) stimulation paradigms. However, evolving nTMS-EEG designs hope to address these issues. The protocol presented here introduces some standard practices for assessing neurophysiological functioning from stimulation to the DLPFC that can be applied in patients with treatment resistant psychiatric disorders that receive treatment such as transcranial direct current stimulation (tDCS), repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS), magnetic seizure therapy (MST) or electroconvulsive therapy (ECT).

The protocol presented here is for TMS-EEG studies utilizing intracortical excitability test-retest design paradigms. The intent of the protocol is to produce reliable and reproducible cortical excitability measures for assessing neurophysiological functioning related to therapeutic interventions in the treatment of neuropsychiatric diseases such as major depression.

גירוי מגנטי טראנס המשולבת ואת אלקטרואנצפלוגרם של קליפת המוח הקדם חזיתית דורסולטרלי

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic ...

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In neuroscience, as well as a plethora of other scientific fields, these techniques are used. Immunohistochemistry can be done on slide mounted tissue or free-floating sections. Preparing slide-mounted samples is a time intensive process. The following protocol for a technique, called the Megabrain, reduced the time taken to cryosection and mount brain tissue by up to 90% by combining multiple brains into a single frozen block. Furthermore, this technique reduced variability seen between staining rounds, in a large histochemical study. The current technique has been optimized for using rodent brain tissue in downstream immunohistochemical analyses; however, it can be applied to different scientific fields that use cryosectioning.

Here, we present a protocol to freeze and section brain tissue from multiple animals as a timesaving alternative to processing single brains. This reduces staining variability during immunohistochemistry and reduces time cryosectioning and imaging.

Cryosectioning בו זמנית של המוח מכרסמים מרובים

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...