המחברים מבקשים להודות רוגן אורח, מישל וויבר, וקריסטן יפרט. מימון למחקר זה מסופק על ידי NIH גרנט R03EB009237, כמו גם מענקי NIH הדרכת T32EB001026-06 ממכון הלאומי לדימות וBioengineering ביו T32HL076124-05.

1. הכנת רקמה והתקנת ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איבר חזירי קציר מייד לאחר המתת חסד ממתקן משחטה או מחקר ולשטוף את הדם עודף. חתוך את הלב של שומן ורקמה עודפים, שמירת הפרוזדורים ואב העורקים בשלמותה. לחתוך שומן להפריד מעורק הריאה לאב העורקים. אם יש קיצוצים כלשהם ברקמה, להשליך כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוטף כל אחד בנפרד בנייר לב מקפיא ולאחסן את כל הרקמות במקפיא ° C -80 לפחות 24 שעות כדי להבטיח הקפאה מוחלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשמוכן לשימוש (בדרך כלל פחות מ 3 חודשים), לב הפשרה 1 שלם קפוא חזירי במים מסוג 1 מתחת למים למשך הלילה בכוס 4 ליטר ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הלב מופשר לחלוטין, ללטף את הלב יבש, לשקול את הלב, ולהקליט במשקל. לבו של חזיר במשקל שוק צריך לשקול כ 375-450 גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צינורות גודל 18 Masterflex לסוף ¼ &quot;של מפחית תיל. הכנס מפחית התיל וצינורות בתוך אב העורקים. 2 תפסי מקום צינור או קשרי zip מאובטחים ברחבי אב העורקים, ממש מתחת לתא מטען brachiocephalic. המפחית והצנרת חייב להישאר מעל לשסתום אב העורקים, ולכן העורקים הכליליים ניתן perfused (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק 30 או 60 מ&quot;ל כדי למלא את הצינור במי סוג I. הכנס את הצינורות בתוך המחסנית של משאבת גלגלת Masterflex באמצע המשוער שלו. הצף את סוף היבוא של הצינורות בחלק התחתון של 4 כוס ליטר מלאה עם 2.5 ליטר מים ולאבטח את הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הלב בכוס מלאה במים, וראש המשאבה כדי להסיר בועות אוויר. אם בועות הם נצפו מגיעים מאב העורקים שבו הצינור מוכנס, אב העורקים ייתכן שיהיה הצורך לשנות את מיקום או מאובטח עם קשרים נוספים. חותם אטום הוא חשוב כדי לשמור על לחץ מתאים במשך תהליך decellularization (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את 4 כוס הליטר המכיל 3 ליטר של 0.2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 פתרון בצלחת מערבבים ומחמם אותו עד 37 מעלות צלזיוס בהכנת תהליך decellularization. </li></ol> 2. רקמת שטיפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המשאבה לקצב זרימה של 400 מ&quot;ל / דקה, להבטיח כי את גודל הצינורות נכון נבחר. שטוף את הלב עם סוג מים שעבור 15-25 דקות. כמשאבה התחילה, לב צריך להתנפח וeffuse דם מחדרי הלב. פתרון טרי צריך להחליף כל 5-10 דקות, או לפי צורך על בסיס כמות הדם הוסרה מהלב. אם דם לא effused מהלב, להתאים את הצינורות ותפסים במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את המשאבה ולהעביר את הלב לכוס נפרדת מלאה בפוספט 2X נאגר מלוח (PBS). אחרי הצינורות הם שקועים בפתרון, מפעיל את המשאבה ולהגביר את קצב הזרימה של 700 מ&quot;ל / דקה. הלב צריך להישאר בתמיסה למשך 15 דקות, שינוי הפתרון כל 5 דקות. כל שינוי דורש פתרון המשאבה צריך לעצור באופן זמני תוך הרקמות והצינורות מועברותלכוס החדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הלב לסוג מים שעבור 10 דקות ולהגביר את קצב הזרימה ל750 מ&quot;ל / דקה. </li></ol> 3. זלוף Decellularization והפתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הלב לכוס המכילה 0.2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% 3 NaN ב 37 ° C. הגדל את מהירות משאבת 1200 מ&quot;ל / דקה ומפעיל את המשאבה. השתמש במוט מערבבים הונח בתחתית הכוס לזרום פתרון במבחנה. הלב צריך להישאר בEDTA/0.05% 3 פתרון 0.2% Trypsin/0.05% NaN על 37 מעלות צלזיוס עבור סכום כולל של שלוש שעות. לאחר השעה 1, להגדיל את מהירות המשאבה ל -1,500 מ&quot;ל / דקה. לאחר שעה נוספת, להגדיל את מהירות המשאבה ל -1,800 מ&quot;ל / דקה. הרקמה היא נתונה באיטיות למהירות מוגברת זלוף למצב הרקמות ולמנוע קרע של כלי הדם. הלב יתפח וכמעט כפול בגודלו במהלך שלב זה של הפרוטוקול. הרקמות תאבדנה את צבעו הטבעי, ומתקדם מהאטרייה לשיא בכל רחבי הדואר הפרוטוקול (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל זלוף פתרון, 2 שלב שטיפה מתבצע על מנת להסיר שאריות סלולריות, שאריות כימיקלים, ותמוגה תא סיוע. כל השטיפה מורכבת מ10 דקות לשטוף במי סוג I ואחרי 10 דקות לשטוף עם פתרון 2X PBS בטמפרטורת חדר. כל שטיפה מורכבת מהסרת הפתרון מהכוס המקורית, והוסיף לשטוף פתרונות, ומחזור perfusate בתוך הכוס המכילה את הלב מתחת למים. לאחר 3 פתרון NaN 0.2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% מים, ינקבו ב1900 מ&quot;ל / דקה ואז ינקבו 2X PBS ב 1950 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הלב לפתרון של 3% X-100/0.05% טריטון EDTA/0.05% 3 NaN בטמפרטורת חדר. הגדל את מהירות המשאבה עד 2,000 מ&quot;ל / פתרון ינקב דקות ובמשך שעה אחת. הסר את התמיסה מהמבחנה ולהחליף עם פתרון חדש, להגדיל את מהירות המשאבה עד 2100 מ&quot;ל / דקה, ותנקב את הפתרון הטרי לשעה נוספת וחצי, מביא את הסך כל זמן ב3% טריטון X-100/0.05% EDTA/0.05% 3 NaN ל -2.5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרקמה במי סוג I ב2150 מ&quot;ל / דקה ו2X PBS ב 2180 מ&quot;ל / דקה למשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הלב ל4% פתרון Deoxycholate נתרן בטמפרטורת חדר. הגדל את מהירות משאבת 2200 מ&quot;ל / דקה ופתרון ינקב עבור 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרקמה במי סוג I וב2X PBS ב 2200 מ&quot;ל / דקה במשך 15 דקות כל אחד, משנות את הפתרונים לאחר דקות 5-10 לכל פתרון. ניתן לפצל את צעדי זלוף תואר על ימים מרובים על ידי ביצוע הצעד לשטוף פעמים ואחסון הלב עם צינורות מחוברים בין הלילה ב 4 ° C ושקוע במי סוג I. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, בצעו 5 דקות לשטוף עם מי סוג I ב 750 מ&quot;ל / דקה, ואחרי 5 דקות לשטוף ב1X PBS ב 1500 מ&quot;ל / דקה. הפרוטוקול ואז ניתן להמשיך בקצב הזרימה המתוארת בפתרון הראוי. </li></ol> 4. חיטוי ועיבוד סופי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הלב לperac 0.1%פתרון ינקב עבור 1.5 שעתי פתרון אתנול 4% וב2200 מ&quot;ל / דקת חומצת etic /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את השטיפות הסופיות לרקמות שבוצעו בכל 2200 מ&quot;ל / דקה. תנקב את הרקמה עם 1X PBS במשך 15 דקות, ואחרי 2 דקות 5 שטיפות במי סוג I. זו סדרה של שטיפות חוזרת על עצמו פעם נוספת על מנת להשלים את הליך זלוף פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה וניתק את הלב מפתרון לניקוז הלב. חותך את הקשרים מאב העורקים, להסיר את כל הצנרת, ולמקם את הלב בגביע ריק לניקוז לשעה 1. עודף נוזלים יהיו צורך לנקז אותו מדי. הנח את הלב על משטח סופג כדי לנקז את הלב (איור 4) באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שרוב המים מוסרים, להקליט את המשקל של מטריקס הלב (C-ECM). הלב יכול להיות צפוי לאבד כ 20-25% מהמשקל ההתחלתי שלה במהלך תהליך decellularization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את חדרי לב הימניים ושמאליים, וכן מחצו חדרית לדנ&quot;א quantificatiובעיבוד היסטולוגית כדי לאשר decellularization המלא של הרקמה (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפא C-ECM ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 2 שעות לפני lyophilization. </li></ol>

<ol>
	<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. , (2008).</li><li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation.">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. , (2010).</li><li>Wainwright, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+from+an+intact+porcine+heart.">Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+tissue+and+organ+decellularization.">Strategies for tissue and organ decellularization.</a> Journal of cellular biochemistry. , (2012).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).</li><li>Akhyari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+an+optimized+protocol+for+whole-heart+decellularization:+a+comparison+of+three+popular+and+a+novel+decellularization+technique+and+their+diverse+effects+on+crucial+extracellular+matrix+qualities.">The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).</li><li>Weymann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+perfusion+decellularization+porcine+heart+model--generation+of+3-dimensional+myocardial+neoscaffolds.">Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds.</a> Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).</li><li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation.">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).</li><li>Remlinger, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrated+xenogeneic+decellularized+tracheal+matrix+as+a+scaffold+for+tracheal+reconstruction.">Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction.</a> Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).</li><li>Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+hepatic+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+in+vitro+using+organ-specific+extracellular+matrix+scaffolds.">Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds.</a> Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).</li><li>Wainwright, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Right+ventricular+outflow+tract+repair+with+a+cardiac+biologic+scaffold.">Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold.</a> Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).</li></ol>

ד&quot;ר גילברט היה בוועדה המדעית המייעצת בACell, Inc בעוד שהמחקר שנעשה, והפך לאחרונה לסגן הנשיא למחקר ופיתוח. ACell, Inc מוכר מטריצת שלפוחית ​​שתן ואין לו עניין מסחרי במחקר הנוכחי.

המחקר הנוכחי תאר מתודולוגיה לdecellularization עקבי והיעיל של לב חזירי. הפרוטוקול היה שינוי ל1 דו&quot;ח שפורסם בעבר, וכלל חשיפה ארוכה יותר לזרימה ולחץ מוגבר, אשר ספקה תוצאות דיר יותר. רקמת decellularized התקבלה עמדה בכל הקריטריונים שפורסמו לdecellularization המוצלח של רקמה 2. שינו?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> טריפסין </td><td> Gibco </td><td> 15090 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> דיג </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> 3 NaN </td><td> סיגמא </td><td> S2002-500G </td><td></td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> סיגמא </td><td> X100-1L </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10X </td><td> דיג </td><td> BP399-20 </td><td></td></tr><tr><td> Deoxycholate נתרן </td><td> סיגמא </td><td> D6750-500G </td><td></td></tr><tr><td> חומצת Peracetic </td><td> Pfaltz ובאואר </td><td> P05020 </td><td> 35% CAS # 79-21-0 </td></tr><tr><td> אתנול </td><td> Pharmco </td><td> 111000200 </td><td></tד&gt; </tr><tr><td> כונן המשאבה Masterflex </td><td> הקול בן זוגו </td><td> Si-07524-50 </td><td></td></tr><tr><td> אבובי Masterflex </td><td> הקול בן זוגו </td><td> 96400-18 </td><td> גודל 18 </td></tr><tr><td> Reducer תיל </td><td> הקול בן זוגו </td><td> EW-30612-20 </td><td></td></tr><tr><td> כוס 4L </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 02-540T </td><td></td></tr></tbody></table>

procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion

כל decellularization האיבר זלוף המבוסס צבר לאחרונה עניין בתחום הנדסת רקמות כאמצעי ליצור פיגומים תאיים מטריקס ספציפיים לאתר, תוך שמירה על מידה רבה את הארכיטקטורה המקורית של הפיגום. עד כה, גישה זו נוצלה במגוון רחב של מערכות איברים, כוללת לב, ריאות, הכבד ו1-5. שיטות decellularization קודמות לרקמות ללא רשת כלי דם נגישה הסתמכו על חשיפה ממושכת של רקמות לפתרונות של חומרי ניקוי, חומצות, או טיפולים אנזימטיים כאמצעי כדי להסיר את הרכיבים הסלולריים וגרעיניים מהסביבה התאית 6-8. עם זאת, היעילות של שיטות אלה תלויים על יכולתו של את הפתרונים לחלחל רקמות באמצעות דיפוזיה. לעומת זאת, טפטוף של איברים דרך מערכת כלי הדם הטבעית ביעילות מצמצם את מרחק דיפוזיה ותחבורת הנחייתם של decellularizatiעל סוכנים לרקמה והמרכיבים תאיים מהרקמות. בזאת, אנו מתארים שיטה לdecellularize לב חזירי שלם מלא דרך זלוף המדרדר כלילית. הפרוטוקול הניב decellularized מלוא לב תאי מטריצה ​​(c-ECM) פיגום עם המבנה תלת הממדים של הלב השלם. השיטה שלנו השתמשה בסדרה של אנזימים, חומרי ניקוי, וחומצות בשילוב עם שטיפות hypertonic וhypotonic לסייע בתמוגה וההסרה של תאים. הפרוטוקול המשמש פתרון טריפסין לנתק את התאים מהמטריצה ​​אחרי Triton פתרוני X-100 ונתרן deoxycholate כדי לסייע בהסרה של חומר תאי. הפרוטוקול המתואר משתמש גם במהירויות של יותר מ זלוף 2 ליטר / דקה לפרקי זמן ארוכים. קצב הזרימה הגבוהה, בשילוב עם שינויי פתרון נתן הובלה של סוכנים לרקמות ללא זיהום של פסולת תאית והבטיח יעיל שטיפה של הרקמות. השיטה המתוארת הסירה את כל החומר גרעיני מנתיve רקמת לב חזירית, יצירת לב ECM פיגום באתר ספציפי שיכול לשמש למגוון רחב של יישומים.

ההשפעה של decellularization על לב חזירי שלם באופן טבעי משתנית בהתאם להבדלים בגודל, לחצים, וסידור כלי. לכן, את ההרכב המדויק של הפיגומים התאיים מטריקס הנגזרים לא יהיה אותו הדבר מלב אל לב. השלמת הפרוטוקול המתואר תניב לב שמופיע לבן או שקוף, המציין את האובדן של חומר תאי. עם זאת, מקוב?...

Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion at JoVE.com

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

שיטת מהירות לחלוטין להסיר רכיבים סלולריים מלב חזירי שלם באמצעות זלוף המדרדר מתוארת. שיטה זו מניבה מטריצת אתר פיגום תאי לבבי ספציפי שבו יש פוטנציאל לשימוש ביישומים קליניים מרובים.

נוהל Decellularization של לב חזירי ידי זלוף כלילית המדרדר

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

procedure-for-decellularization-porcine-heart-retrograde-coronary

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.7K Views.  McGowan Institute for Regenerative Medicine. שיטת מהירות לחלוטין להסיר רכיבים סלולריים מלב חזירי שלם באמצעות זלוף המדרדר מתוארת. שיטה זו מניבה מטריצת אתר פיגום תאי לבבי ספציפי שבו יש פוטנציאל לשימוש ביישומים קליניים מרובים.

Video: Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Decellularization ו Recellularization של כבדים שלמים

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

נוהל Decellularization של כבדי עכברוש בהתקן זלוף נדנוד לחץ

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

Decellularization של הלב האנושי כולו בתוך נרתיק מווסת בכיוון הפוך

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an allogeneic or xenogeneic source with human cells. A demonstration of methods for the efficient dissection, decellularization, and recellularization of porcine pancreas might benefit the field. Akin to human pancreases, porcine pancreases have a special anatomical arrangement with three lobes (splenic, duodenal, and connection) rounded by the duodenum and small intestine. The duodenal lobe of the pancreas connects to the duodenum by several small blood vessels. Tissue engineering of the pancreas is complicated because of its exocrine and endocrine nature. In this paper, we show a detailed protocol to dissect the whole porcine pancreas and decellularize it with detergents while saving its structure and some extracellular matrix components. To achieve complete perfusion, the aorta is chosen as inlet and the portal vein as outlet. The other blood vessels (hepatic artery, splenic vein, splenic artery,&#160;mesenteric artery and vein tree) and bile duct are ligated. To prevent the formation of thrombus, the pig is heparinized and, immediately after dissection, the organ is flushed with cold heparin. To inhibit the action of exocrine enzymes, the pancreas decellularization is set at 4 &#176;C. The decellularization is performed by perfusion of Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease, with an intermittent and final extensive washing. With a successful decellularization, the pancreas appears white, and a histological evaluation with hematoxylin and eosin shows an absence of nuclei with a preserved extracellular matrix structure. Thus, the proposed method can be used to successfully dissect and decellularize whole porcine pancreas.

Tissue engineering of the whole pancreas is a challenge because of its exocrine and endocrine functions. We show a method for the dissection of an intact porcine pancreas and the process of successful decellularization by perfusion of detergents Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease.

בידוד, Decellularization פוג'אלאדוצ'נוי זהאלאזי כל חזירי

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical communities. The resolution of results obtained from current methods of measuring certain biomarkers can take several days or weeks to obtain, as they can be limited in resolution both spatially and temporally (e.g., fluid compartment microdialysis of interstitial fluid analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA], high-performance liquid chromatography [HPLC], or mass spectrometry); thus, their guidance of timely diagnosis and treatment is disrupted. In the present study, a unique technique for detecting and measuring peptide transmitters in vivo through the use of a capacitive immunoprobe biosensor (CI probe) is reported. The fabrication protocol and in vitro characterization of these probes are described. Measurements of sympathetic stimulation-evoked neuropeptide Y (NPY) release in vivo are provided. NPY release is correlated to the sympathetic release of norepinephrine for reference. The data demonstrate an approach for the fast and localized measurement of neuropeptides in vivo. Future applications include intraoperative real-time assessment of disease progression and minimally invasive catheter-based deployment of these probes.

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Established immunochemical methods to measure peptide transmitters in vivo rely on microdialysis or bulk fluid draw to obtain the sample for offline analysis. However, these suffer from spatiotemporal limitations. The present protocol describes the fabrication and application of a capacitive immunoprobe biosensor that overcomes the limitations of the existing techniques.

מדידת In Vivo שנפתרה בזמן של נוירופפטידים דינמיים על ידי אימונופרוב קיבולי בלב חזירי

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

רכש ופרפוזיה-דה-סלוליזציה של דשים וסקולריים חזיריים בביוריאקטור פרפוזיה מותאם אישית

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an evolving reconstructive avenue for transferring multiple tissues as a composite subunit. Despite the promising nature of VCA, the long-term immunosuppressive requirements are a significant limitation due to the increased risk of malignancies, end-organ toxicity, and opportunistic infections. Tissue engineering of acellular composite scaffolds is a potential alternative in reducing the need for immunosuppression. Herein, the procurement of a rat hindlimb and its subsequent decellularization using sodium dodecyl sulfate (SDS) is described. The procurement strategy presented is based upon the common femoral artery. A machine perfusion-based bioreactor system was constructed and used for ex vivo decellularization of the hindlimb. Successful perfusion decellularization was performed, resulting in a white translucent-like appearance of the hindlimb. An intact, perfusable, vascular network throughout the hindlimb was observed. Histological analyses showed the removal of nuclear contents and the preservation of tissue architecture across all tissue compartments.

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

We describe the surgical technique and decellularization process for composite rat hindlimbs. Decellularization is conducted using low-concentration sodium dodecyl sulfate through an ex vivo machine perfusion system.

רכש ודה-סלוליזציה של חולדות אחוריות באמצעות ביוריאקטור מבוסס ex vivo perfusion עבור allotransplantation מרוכב וסקולרי

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

הערכת תכונות הידרודינמיות בשסתומי אבי העורקים החזיריים הרכובים

An Ex Vivo Porcine Model for Hydrodynamic Testing of Experimental Aortic Valve Procedures and Novel Medical Devices

The options for testing new cardiac procedures and investigative medical devices prior to use in an animal model are limited. In this study, we present a method for mounting a porcine aortic valve in a pulse duplicator to evaluate its hydrodynamic properties. These properties can then be evaluated before and after the procedure under investigation is performed and/or the investigative medical device is applied. Securing the inflow segment presents some difficulty owing to the lack of circumferential myocardium in the left ventricular outflow tract. This method addresses that issue by securing the inflow segment using the anterior leaflet of the mitral valve and then suturing the left ventricular free wall around the inflow fixture. The outflow segment is secured simply by inserting the fixture into an incision in the superior aspect of the aortic arch. We found that specimens had significantly different hydrodynamic properties before and after tissue fixation. This finding induced us to use fresh specimens in our testing and should be considered when using this method. In our work, we used this method to test novel intracardiac patch materials for use in the valvular position by performing an aortic valve neocuspidization procedure (Ozaki procedure) on the mounted porcine aortic valves. These valves were tested before and after the procedure to assess the change in hydrodynamic properties in comparison to the native valve. Herein, we report a platform for hydrodynamic testing of experimental aortic valve procedures that enables comparison with the native valve and between different devices and techniques used for the procedure under investigation.

מחבר זרקור: קידום בדיקות פרוצדורות לב לפני תחילת מחקרים גדולים בבעלי חיים 

We present a method for mounting a porcine aortic valve on a pulse duplicator to test its hydrodynamic properties. This method can be used to determine the change in hydrodynamics after the application of an experimental procedure or novel medical device prior to use in a large animal model.

מודל חזירי Ex Vivo לבדיקות הידרודינמיות של פרוצדורות ניסיוניות של מסתם אבי העורקים ומכשירים רפואיים חדשניים

The options for testing new cardiac procedures and investigative medical devices prior to use in an animal model are limited. In this study, we present a ...