<p class="jove_content"&gt; אנו מודים לד&quot;ר גוטליב יובל דרור להמחשת electroporation. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים לDSD מהמכון הלאומי לפסיכוביולוגיה בישראל ושיתוף הפעולה מתכנית מחקר Niedersachsen לישראל ועל ידי מענקים מקרן AK הלאומי למדע, משרד בריאות, והמרכז למורשת מצוינות-Legacy שותפות מדע ביו.</p&gt;

1. Electroporation המוח האחורי טיפול ביצה 1.1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הביצים בצורה אופקית בחממת humidified (37-38.5 מעלות צלזיוס). עוברי electroporated לאחר 65-70 שעות של דגירה, כשהם מגיעים 16-17 (HH) שלב (25-30 somites). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הביצים מהחממה, הם נשארים במצב האופקי. </li></ol> 1.2 הכנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך זכוכית נימים (בקוטר 0.5 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר אלקטרודות Genetrodes מכופף בצורת L זהב (קוטר 3 מ&quot;מ) עם בעל מתאם למחולל הפעימות. פרמטרים Electroporation כוללים 25 וולט, 5 מספרים דופק, 45 אורך הפולס אלפיות, 300 מרווחי דופק msec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פיפטה פה, 10 מיליליטר מחט מזרק, רצועות parafilm, מברשת רכה, מספריים חדים ולנתח 25 מיליליטר פתרון PBS סטרילית. סכום זה הוא בדרך כלל מספיק כדי להתמודד עם מגש ביצים (18 ביצים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת נאותה של פלסמידים DNA (5 מיקרוגרם / μl כל אחד) ולהוסיף על 0.025% צבע ירוק מהיר כדי להמחיש הזרקת ה-DNA. בדרך כלל בהיקף של 4 μl מספיק להזרקה של מגש. </li></ol> 1.3 Windowing, הזרקה וElectroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנקות את קליפות ביצים עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמודד עם ביצה אחת בכל פעם כדי לצמצם את זמן חשיפה עוברית לאוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חור בקוטב הביצה עם קצות המספריים ולהסיר מיליליטר 3-4 של אלבומין עם המזרק. אין להסיר כמות גדולה יותר של אלבומין שכן הוא מפחית יכולת קיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח חלון סגלגל קטן (בגודל 2.5 ס&quot;מ X 2) במרכז העליון של קליפת הביצה באמצעות המספריים לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפטף כמה טיפות של PBS על גבי של העובר כדי למנוע יובש במהלך כל התהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען כמות קטנה של תערובת ה-DNA לתוך נימי הזכוכית באמצעות פיפטה פה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העובר עם הקצה האחורי שלה כלפיך. הזרקת דיו לא נדרשת בשלב זה כעובר נראה בבירור. הימנעות עליות הזרקת דיוהישרדות עוברית. לחדור למוח האחורי הזנב על ידי החזקת הנימים ב ~ 45 מעלות. אין להסיר כל קרום מסביב העובר. הזרק פתרון ה-DNA בזהירות לתוך לום המוח האחורי ולנשוף בלי ליצור בועות אוויר. פתרון ה-DNA מתפשט anteriorly. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר הזרקת ה-DNA, הנח את האלקטרודות המקבילות בAP המדויק ואת מיקום המוח האחורי DV אתם שואפים להתמקד. לדחוף את האלקטרודות מעט ventrally בלי לגעת בלב, כפי שהוא עשוי להפחית את הכדאיות. דופק electroporator. אלקטרודות צריכה להיות מכוסות בבועות כדי לציין מוליכות חשמלית (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את האלקטרודות ולטפטף כמה טיפות של PBS כדי לקרר את העובר וכדי להסיר בועות. לאטום את הביצה פותחת כראוי עם רצועת parafilm כדי למנוע התייבשות במהלך דגירה. שטוף אלקטרודות בPBS עם המברשת הרכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ביצה בחממה לאורך הרצוי של זמן. הישרדות של עוברים היא כ -90% אחרי 2-3 ימיםelectroporation, ומפחית עד 50% 12 ימים לאחר electroporation. </li></ol> 2. ניתוח של עוברים 2.1 הכנה וimmunofluorescence שטוח הר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לבצע את ההכנות שטוח הר המוח האחורי לE6.5 לדמיין האקסונים בקלות תחת מיקרוסקופ או סטריאו מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את העובר בקפידה על ידי הפרדתו מקרומים המקיפים וכלי דם. הנח את העובר בסיליקון קטן - צלחת פטרי המכילה PBS מצופה. צרף את העובר לצלחת עם סיכות טונגסטן מול dorsally. לבצע חריץ בגב גג הצלחת באמצעות חדות זכוכית נימי המוח האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פינצטה חדה ומייקרו מספריים להחזיק את החלק העליון של הראש ולמשוך את רקמת המוח האחורי בזהירות רבה ממקורי לזנב. לאחר ההפרדה של רקמות המוח האחורי להסיר הגחון שנותרו כדי להגיע להכנה נקיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המוח האחורי עם 4Paraformaldehyde% (PFA) פתרון עבור שעות 1-2 בטמפרטורת החדר (RT). שטוף את המוח האחורי עם PBT (PBS/0.1% טריטון X-100) כדי להסיר PFA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לImmunofluorescence בhindbrains שטוח רכוב להוסיף 500 μl של פתרון חסימה (5% נסיוב עז בPBT ו דגירה במשך שעה 2 ב RT דגירה עם נוגדן 1 st ON ב 4 ° C. לשטוף עם PBT (15 דקות X 3). דגירה עם נוגדן nd 2 לשעה 2 ב RT. לשטוף עם PBT (15 דקות X 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המוח האחורי מול dorsally בשקופית זכוכית. הוסף תקשורת הרכבה ניאון אל המוח האחורי. השתמש בזכוכית נימים או מחטי טונגסטן לשטח המוח האחורי בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כמות קטנה של שומן בכל פינה כדי למנוע התכווצות של הרקמות על ידי להחליק את המכסה. זהירות במקום להחליק על גבי עטיפה של המוח האחורי ולמנוע בועות אוויר. לדבקות להוסיף לק כדי לכסות את קצות זכוכית. </li></ol> 2.2 סעיפי Cryo וImmunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי Cryo של CA גזע המוחn להתבצע בכל שלב כדי להמחיש מסלולי עצב. ובכל זאת, אחרי E6.5 זו צריכה להיות שיטה המועדפת בשל הקושי לדמיין האקסונים בעובר שטוח רכוב, אשר הופך להיות סמיכים מדי. יתר על כן, הפגנה של סינפסות דורשת חתך של הרקמות ונוף גבוהה הגדלה תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את העובר ולהסיר את כל הרקמות הסובבות. יש לשטוף עם PBS. חותכים את העובר בחלק הזנב של הלשד באמצעות מיקרו מספריים ופינצטה חדה. ביצוע חתך רחב בין המוח הקטן והמוח התיכון ולהסיר את כל גזע המוח. הרקמה צריכה להכיל את הלשד, פונס ומוח הקטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן גזע המוח בPFA 4% ללילה (ON) ב 4 ° C, לשטוף עם PBS (10 דק &#39;x 3), ו דגירה עם 30% סוכרוז לON על 4 מעלות צלזיוס עד לטביעתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ המוח האחורי בcryo-תבנית עם מתחם אוקטובר (טמפרטורה אופטימלית חיתוך), ולמקם אותו ב -20 מעלות צלזיוס עד הקפאה, כפי שתואר במקומות אחרים 11. </li><li&gt; מניחים את הגוש באוקטובר cryostat בציר החתך הרצוי. רוחב החתך הוא 12 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את השקופיות. הוסף פתרון חסימת μl 100 בכל שקופית במשך שעה 2 ב RT. הוסף 100 μl של נוגדנים (בדילול בפתרון החסימה לריכוז הרצוי). תקופת הדגירה של 1 ו 2 nd נוגדנים היא על על 4 מעלות צלזיוס או 2 שעות ב RT, בהתאמה. לכל אחד זמן דגירה, בעדינות להוסיף רצועת parafilm על גבי השקופית כדי למנוע יובש. לשטוף עם PBS (10 דק &#39;x 3) בין נוגדנים. במידת צורך, להוסיף 1:1,000 DAPI (4&#39;-6-diamidino-2-phenylindole), בדילול מלא PBS במשך 20 דקות ב RT. יש לשטוף עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר השקופית עם תקשורת הרכבה ניאון. תן יבש במשך שעה 1 לפני הניתוח. </li></ol>

<ol>
	<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+precerebellar+nuclei+in+the+rat:+II.+The+intramural+olivary+migratory+stream+and+the+neurogenetic+organization+of+the+inferior+olive.">Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive.</a> J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).</li><li>Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+neurons+of+the+proprioceptive,+interoceptive,+and+arousal+hindbrain+networks+share+a+developmental+requirement+for+Math1.">Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).</li><li>Storm, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+transcription+factor+Olig3+marks+the+dorsal+neuroepithelium+of+the+hindbrain+and+is+essential+for+the+development+of+brainstem+nuclei.">The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei.</a> Development. 136, 295-305 (2009).</li><li>Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+of+segmentation+in+the+developing+hindbrain.">The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain.</a> Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+precerebellar+neuron+development+by+Olig3+bHLH+transcription+factor.">Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor.</a> J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).</li><li>Muller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+factor+Olig3+coordinates+the+specification+of+dorsal+neurons+in+the+spinal+cord.">The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord.</a> Genes Dev. 19, 733-743 (2005).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+and+dorsal+root+ganglion+axons+serve+as+choice+points+for+the+ipsilateral+turning+of+dI3+axons.">Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons.</a> J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).</li><li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1.">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Dev. 4, 21 (2009).</li><li>Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+axonal+pathways+of+genetically+defined+groups+of+neurons+in+the+chick+neural+tube+utilizing+in+ovo+electroporation.">Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation.</a> J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).</li><li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Patterns+and+Targets+of+dA1+Interneurons+in+the+Chick+Hindbrain.">Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain.</a> J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).</li><li>Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+delineation+of+ischemic+tissue+in+rat+brain+cryosections+by+high-contrast+staining.">Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining.</a> Stroke. 30, 1134-1141 (1999).</li><li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system.">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li><li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice.">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).</li><li>Lu, Y., Lin, C., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac+transgenic+strategies+in+the+developing+chicken+spinal+cord.">PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord.</a> Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-like+elements+in+the+pink+bollworm,+Pectinophora+gossypiella.">piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella.</a> Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).</li><li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo:+dynamics+and+modulation+by+BDNF.">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).</li><li>Leal-Ortiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piccolo+modulation+of+Synapsin1a+dynamics+regulates+synaptic+vesicle+exocytosis.">Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis.</a> J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).</li><li>Gardzinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+synaptotagmin+I+C2A+calcium-binding+domain+in+synaptic+vesicle+clustering+during+synapse+formation.">The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation.</a> J. Physiol. 581, 75-90 (2007).</li><li>Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SV2+regulates+neurotransmitter+release+via+multiple+mechanisms.">SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).</li><li>Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+Hox+expression+in+the+vertebrate+hindbrain:+influence+of+paraxial+mesoderm+and+rhombomere+transposition.">Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition.</a> Neuron. 16, 487-500 (1996).</li><li>Clarke, J. D., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+repetition+of+neuronal+phenotype+sets+in+the+chick+embryo+hindbrain.">Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain.</a> Development. 118, 151-162 (1993).</li><li>Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+hodological+and+cytoarchitectonic+organization+in+the+vestibular+complex+of+the+11-day+chicken+embryo.">The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo.</a> J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).</li><li>Marin, F., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+fate+of+rhombomeres+in+quail/chick+chimeras:+a+segmental+analysis+of+hindbrain+nuclei.">Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; אין ניגודי האינטרסים הכריזו.</p

ב electroporation אובו הוא כלי אפשרי, אמין, יעיל ולבחון מפרט תא והכוונה axonal במהלך אפרוח פיתוח מערכת עצבים 20. בפרוטוקול זה אנו מתארים מצב של electroporation במוח האחורי החומוס בE2.75 באמצעות משפר אלמנטים המאפשרים תיוג המותנה של interneurons הספציפי. אסטרטגיה זו היא בשילוב עם ?...

המוח האחורי מייצג רכזת ממסר מרכזית של מערכת העצבים על ידי תקשורת בין מערכות העצבים המרכזיות והיקפיות באמצעות עולה ויורד רשתות נוירונים. הוא מווסת את פונקציות בסיסיות כולל נשימה, תודעה, שמיעה, ומוטורי תיאום 1-3. במהלך ההתפתחות עוברית מוקדמת, המוח האחורי החוליות מחולק transiently לאורך הציר (AP) קדמי, האחורי שלה לתוך rhombomeres חוזרת ונשנית, שבו תאים מסוגים שונים עצביים נוצרים וליצור מרכזי גרעיני גזע מוח מספר 4. המוח האחורי מחולק גם לאורך הציר (DV) גב, גחונו לתוך צלחת בסיס ועלאר, שבו אבות עצביים בדידים להפוך צוינו ולהבדיל במקומות שונים DV 3,5,6. איך מוקדם AP וDV ספציפיים הדפוסים עצביים המסדירים את הקמתה של circuitries גזע המוח תפקודי הוא במידה רבה לא ידוע. כדי לצבור ידע על זה בסיסישאלה, כלים הנדרשים כדי לתייג תת ספציפית של תאי עצב במוח האחורי מוקדם ולעקוב אחר המסלולים וקישוריות axonal בשלבים מתקדמים יותר. יש לנו מנוצלים בעבר אלמנטים משפר ספציפיים, ומערכת משפט תנאי Cre / מבוסס LoxP למעקב אחר המסלול של axonal interneurons השדרה הגבי בעובר האפרוח מוקדם 7-9. בכתב היד הנוכחית יש לנו ממוקד למוח האחורי ומשודרג פרדיגמה הניסויית לתיוג interneurons המאוחר עוברי המוח האחורי, אקסונים והיעדים סינפטיים שלהם, משתמש באסטרטגיה שונה וelectroporation PiggyBac - טרנספוזיציה DNA התיווך. האסטרטגיה החדשה שלנו מאפשרת התיוג של תת עצביים נפרדים בצד אחד של המוח האחורי ואת המעקב של תחזיות axonal ואתרים סינפטיים בשלבים עובריים שונים, מ -2 עד 12 ימים לאחר electroporation. המבוסס על שיטה זו, אנו הכותרת הגבי ביותר תת קבוצה של interneurons המוח האחורי (dA1/Atoh1 + </s&gt; תאים למעלה) וחשף שני דפוסי הקרנת axonal עולים נגדיים, כל אחד נובע ממיקום AP שונה ומתארכת בחבל טבור מובהק. dA1 אקסונים נמצאו פרויקט וסינפסות טופס בשמיעת גרעינים, המוח התיכון ובשכבות מרובות של המוח הקטן 10. שילוב של electroporation האפרוח, התחקות הגנטית של תאי עצב וניתוח של אתרי הקרנה בשלבים מתקדמים של פיתוח רבים מספק פלטפורמה ייחודית ללמוד את היווצרותם של רשתות עצביות במוח ועל מנת להבהיר מנגנונים מולקולריים השולטים היווצרות מעגל.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes</td>
			<td>BTX, Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0162 </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pulse generator, ECM 830</td>
			<td>BTX, Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0002</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound</td>
			<td>Tissue-Tek
				Sakura</td>
			<td>4583 O.C.T. Compound </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>From Any Commercial Supplier </td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

electroporation of the hindbrain to trace axonal trajectories and synaptic targets in the chick embryo

Electroporation של הצינור העצבי החומוס העוברי יש יתרונות רבים כגון להיות מהיר ויעיל לביטוי של גנים זרים לתוך תאים עצביים. בכתב היד הזה אנו מספקים שיטה ייחודית המדגימה כיצד electroporate דנ&quot;א לתוך המוח האחורי העופות בE2.75 כדי לתייג את קבוצת משנה של אבות עצביים באופן ספציפי, וכיצד לעקוב אחרי תחזיות axonal ומטרות סינפטיים בשלבים מתקדמים הרבה של פיתוח, עד E14.5. יש לנו מנוצלים כלים גנטיים חדשים כולל אלמנטים ספציפיים משפר, Cre / קס - פלסמידים מבוססי ומערכת ה-DNA טרנספוזיציה PiggyBac בתיווך לנהוג ביטוי של GFP בתת סוג של תאי מוח אחוריים (רוב תת קבוצה של interneurons הגבי, dA1). מסלולים ויעדים של dA1 האקסונים axonal הם אחריו בשלבים עובריים מוקדמים ומאוחר באזורי גזע מוח שונים. אסטרטגיה זו תורמת טכניקות מתקדמות למיקוד תאים של עניין במוח האחורי העוברי ועבור טרהcing היווצרות מעגלים בשלבים שונים של פיתוח.

<html> פרוטוקול זה היה בשימוש לאחרונה לחשוף את דפוסי axonal ואתרי הקרנה של dA1 תת קבוצה של interneurons בחומוס המוח האחורי 10. לתייג במיוחד אקסונים אלה, אלמנט משפר (Atoh1), שבעבר התאפיין כספציפיים לתאי עצב בעמוד השדרה dI1 8,12,13, אושר לבוא לידי ביטוי במוח האחורי dA1 תאים 10. ה...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo at JoVE.com

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

איך רשתות עצביות נוצרות במוח העוברי היא שאלה בסיסית בנוירוביולוגיה התפתחותית. כאן אנו בשילוב טכניקת electroporation עם כלים גנטיים חדשים, כגון מערכת טרנספוזיציה DNA PiggyBac בתיווך במוח האחורי העופות לתייג interneurons גב ולעקוב אחר תחזיות axonal ומטרות סינפטיים בשלבי התפתחות שונים Cre / קס-פלסמידים ו.

Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

electroporation-hindbrain-to-trace-axonal-trajectories-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.8K Views.  The Hebrew University of Jerusalem. איך רשתות עצביות נוצרות במוח העוברי היא שאלה בסיסית בנוירוביולוגיה התפתחותית. כאן אנו בשילוב טכניקת electroporation עם כלים גנטיים חדשים, כגון מערכת טרנספוזיציה DNA PiggyBac בתיווך במוח האחורי העופות לתייג interneurons גב ולעקוב אחר תחזיות axonal ומטרות סינפטיים בשלבי התפתחות שוני...

Video: Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

הפקה של חילוץ העובר צ&#39;יק לגידול Murine בתאי גזע עצביים קרסט

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

שימוש pHluorin כדי להעריך את הדינמיקה של קולטני הדרכה אקסון בתרבות התא בעובר אפרוח

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

השימוש של התניה קלאסית Eyeblink מעקב כדי להעריך תפקוד בהיפוקמפוס במודל של עכברים של אלכוהול עוברית ספקטרום הפרעות

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

הקלטה הפלסטיות הסינפטית בפרוסות בהיפוקמפוס חריפה, בהשתתפות של מיחזור - בנפח מצומצם, זלוף- ומערכת ועלייתו-סוג תא

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions in the immature and adult brain. Here we describe a zinc histochemical staining procedure that reveals differences in staining patterns among different layers and brain regions. Others have utilized this procedure not only to reveal the distribution of zinc-containing neurons and circuits in the brain, but also to successfully delineate areal and laminar boundaries in the developing and adult brain in several species. Here we illustrate this staining procedure with images from developing and adult ferret brains. We reveal a zinc-staining pattern that serves as an anatomical marker of areas and layers, and can be reliably used to distinguish visual cortical areas in the developing and adult visual cortex. The main goal of this protocol is to present a histochemical method that allows the accurate identification of layers and regions in the developing and adult brain where other methods fail to do so. Secondarily, in conjunction with densitometric image analysis, this method allows one to assess the distribution of synaptic zinc to reveal potential changes throughout development. This protocol describes in detail the reagents, tools, and steps necessary to successively stain frozen brain sections. Although this protocol is described using ferret brain tissue, it can easily be adapted for use in rodents, cats, or monkeys as well as in other brain regions.

We describe a histochemical procedure that reveals characteristic laminar and areal zinc staining patterns in different brain regions. The zinc-staining pattern may be used in conjunction with other anatomical markers to reliably distinguish layers and regions in the developing and adult brain.

השימוש להסטולוגיה אבץ סינפטית כדי לחשוף אזורים שונים שנבזזו במוח המתפתח, למבוגרים

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

שילוב Optogenetics עם מיקרו Rna מלאכותי כדי לאפיין תופעות נוקאאוט גנטי על פונקציה Presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...