עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH הוענק ר ברוסטר (1R01GM085290-01A1).

1.Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל פלסמיד קידוד קרום במיקוד גרין פלורסנט חלבון (mGFP, באדיבות ריצ&#39;רד הרלנד) כדי בריכוז של 40 ng / ml. DNA הוא הוכן על ידי linearizing פלסמיד (mGFP/PCS2 +, באדיבות ריצ&#39;רד הרלנד) מטוהרים באמצעות ערכת הכנה Qiagen מקסי. תוספת של פנול אדום (בדילול מלא 1 / 10 הנפח הכולל) לפתרון עדיף לדמיין את הפתרון. שמור את פתרון ה-DNA על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת stereomicroscope, לכייל את מחט הזריקה (90mm זכוכית הנימים מ Narishinge מדעי: חתול מס &#39;NA-GD-1) על ידי יישור מחט בשקופית סיים בעדינות את החלק הקשה של המחט שבה הקוטר הוא 1μm באמצעות סכין גילוח נקי להב (כדי לקבל קצה בגודל המתאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לכייל את המחט להזריק נפח ידוע (2nl), לחבר את המחט למנגנון microinjection (PCI 100 Microinjector; הרווארד Apparatus) ו הקדמי למלא את המחט עם 0.5μl פתרון המכיל מים פנול אדום והניח על פיסת של פרפין. הפתרון ניתן לוותר באמצעות דוושת רגל. הגדר את הלחץ kPa 7 ולגוון את הזמן (10msec 30msec), כך שזה לוקח 250 דוושות לוותר 0.5μl של הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום מחט מכויל על רצועה של שעווה צלחת פטרי 100 מ&quot;מ humidified. כדי ללחלח את המנה, המקום Kimwipes רטוב בקצוות (זה מונע אידוי של הפתרון את המחט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש micropipette לטעון 0.5-1μl של דנ&quot;א לתוך קצה המחט (בסוף זה לא היה מכויל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפתרון הגיע חוד המחט, חבר את הקצה של המחט אשר שימשה להעמסה על מנגנון microinjection. התאם את ההגדרות על microinjector לספק כ -2 nl / ההזרקה באמצעות דוושת רגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, דג הזברה עמדה עוברים באמצע צלחת פטרי מלאות בינונית העובר (צילומים של 1.0 מ&quot;ל של האנק # 1, 0.1 במלאי מ&quot;ל של האנק מס &#39;2, צילומים של 1.0 מ&quot;ל של האנק # 4, 95.9 מ&quot;ל DDH 2 O, צילומים של 1.0 מ&quot;ל של האנק # 5 , צילומים של 1.0 מ&quot;ל של טרי האנק # 6, השתמש בערך 10 טיפות NaOH M 1 ל-pH 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העוברים פיתחו לשלב הרצוי, בעדינות אחיזת סיסית עם מלקחיים בסדר למקם את המחט לאזור ממוקד עבור זריקה. עבור ביטוי מגוון רחב mGFP, להזריק DNA בחלמון או בציטופלסמה בשלב 1cell. כדי להגביל את הביטוי של mGFP לאזור קטן יותר, להזריק DNA ב 4 (או יותר) שלב תאים לתוך הציטופלסמה של תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו על דוושת הרגל של המנגנון microinjection ולספק כ -2 nl, להבטיח כי הפתרון (גלוי בשל תוספת של פנול אדום) מוזרק כהלכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את המחט מן העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לכל העוברים בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לפתח את העוברים על 28.5 ° C לשלב הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים Dechorionate ידי בעדינות קילוף סיסית באמצעות מלקחיים קנס (אם עוברים בני פחות מ 24hpf, dechorionating בכלי זכוכית פטרי מעלה את שיעור ההישרדות של עוברים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר סיסית ריק מצלחת פטרי בעזרת פיפטה מזכוכית. </li></ol> 2. הדמיה mGFP שכותרתו סעיפים vibratome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה זכוכית להעביר עוברים לתוך paraformaldehyde (מחזיק 4% פתרון חיץ 1X פוספט (PBS). Fix עוברים על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עוברים 1X PBS 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים בצלחת פטרי, באמצעות מלקחיים בסדר, להסיר את החלמון מבלי לפגוע בעובר. הסר כמו חלמון האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4% נמוך להמיס agarose ב H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום agarose מותכת לתוך תבנית פלסטיק חתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים בסדר להרים עובר מוזרק מצלחת פטרי למקום לכוון את agarose. העובר צריך להיות ממוצבת לקראת סוף אחד עובש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose הוא מוקשה, להשתמש בכלי משטח שטוח, כגון מרית, כדי להסיר את הבלוק agarose מן התבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקצה התחתון של הגוש agarose בסכין גילוח כך שהוא אפילו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה של דבק סופר לשלב vibratome והמקום לחסום agarose על זה (הצד של גוש זה התייצבה עם סכין הגילוח צריך להתמודד עם דבק). עבור חתך עוברים מרובים, הר agarose-מוטבע מספר דגימות על הבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את הבמה vibratome את vibratome (Vibratome, Inc). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפרמטרים של vibratome (ההגדרות הנפוצות: מהירות-3, עובי-50μm). אם חתך עוברים מרובים, ליישר בלוקים agarose על הבמה להבטיח כי הלהב עובר לעובר כולו, אך לא דרך רוחב כולו מאבני agarose (כך בסעיפים המתאימים העובר אותו יישארו יחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 1X PBS בשלב vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם הם עוברים sectioנד, להסיר את הבלוק agarose (ים) משלב vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להפריד כל קטע על ידי חיתוך האחורי של לחסום agarose (ים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מלקחיים קנס כדי לבחור חלקים הרצוי מקום לתוך צלחת PBS מלא רב גם 1X (להשתמש בבארות שונים בסעיפים המתאימים עוברים שונים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה עבור כל העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עם תיוג נוגדן, 19 צעדים על פי 23, כדי לשפר את mGFP הדמיה (שלב זה לא עשוי להיות נחוץ אם הסעיפים הם צילמו בתוך יום או יומיים של הכנה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את הסעיפים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם פתרון חסימת 1X PBS לחסום הלא ספציפית מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפים דגירה עם נוגדן ראשוני (ארנב-GFP, Invitrogen חתול מס &#39;A11122) מדולל @ 1:200 בפתרון חסימת על שייקר במשך 5 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ארבע פעמים (10 דקות, 15 דקות, 30 דקות ו 60 דקות, כל אחד) 1% BSA/1X PBS / 1% פתרון DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו עם נוגדנים משני חלקים המתאימים פתרון חסימת במשך 5 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ארבע פעמים (10 דקות, 15 דקות, 30 דקות ו 60 דקות, כל אחד) 1% BSA/1X PBS / 1% פתרון DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את החלקים עם DAPI (0.1% ב 50 מ&quot;ל DAPI 1X PBS; Invitrogen חתול מס &#39;D1306) במשך 30 דקות להכתים את הגרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים 1X PBS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה באמצעות מיקרוסקופיה confocal. </li></ol> 3. חיים הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate לחיות, עוברים מוזרק 30 דקות לפני שהם מגיעים לשלב ההתפתחותי הרצוי. מניחים את העוברים בפתרון הרגעה (0.01% Tricaine ב בינונית העובר) במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום agarose ירידה של 1% על צלחת זכוכית 35mm התחתונה תרבות (MatTek; מס &#39;חלק P35G-o-20-C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים על אש צינור נימי לעשות 3 חורים agarose (חפצים אחרים כגון טיפים micropipette ניתן להשתמש כדי לעשות את החורים). ודא כי אין agarose שיורית בתחתית הבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את צלחת פטרי עם בינונית העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה זכוכית למקום העובר בתוך הבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לכוון את העובר באמצעות מלקחיים קנס כך האזור להיות צילמו (ראש הגבי) נמצא בקשר עם הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות התחבורה צלחת פטרי לשלב מיקרוסקופ (במקום המכסה מעל צלחת פטרי כדי למנוע אידוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הדמיה, להבטיח כי הם עוברים על 28.5 ° C. </li></ol> 4. תוצאות אנו מתארים כאן גישה ישירה לתאי תמונה אחת בצינור העצבי דג הזברה באמצעות הביטוי פסיפס. למרות השקיפות האופטי של העובר דג הזברה, מצאנו כי ויזואליזציה של תאים עצביים היא משופרת מאוד חתכים שהושגו באמצעות vibratome. סעיפים אלה עבה (50 מ&quot;מ) המאפשר הדמיה של הרחבה הסלולר מתא נתון מטוסים מוקד שונים באמצעות מיקרוסקופ confocal. תוצאות השימוש במתודולוגיה זו פורסמו 2 במקום אחר, אבל נציג תמונות של התאים בצינור העצבי של העובר WT (איור 1) ו - N-cadherin (N-CAD) מוטציה (איור 2) מסופקים. האחרון מגלה כי התאים באזורים לרוחב הצלחת עצבית N-CAD מוטנטים מצליחים להתמצא כראוי כלפי קו האמצע (איור 2). בניגוד תיוג זה פסיפס, immunostaining neuroepithelium עם סמן השטח הכללי תא כגון בטא catenin אינו מאפשר את המורפולוגיה של תאים בודדים להיות דמיינו (איור 3). זמן לשגות הדמיה של עוברים לחיות השלימו את תיוג פסיפס של דגימות קבוע, דבר המאפשר הבנה טובה יותר של הדינמיקה הסלולר המתרחשים במהלך neurulation. סרט 1 גילה כי תאים WT פעיל לנדוד לעבר קו האמצע ידי הרחבת מדיאלית מוכווני בליטות בממברנה. <img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig1.jpg" alt="איור 1" /> 1. איור mGFP ביטוי בצינור העצבי של העובר דג הזברה WT. <img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig2.jpg" alt="איור 2" /> 2. איור mGFP ביטוי בצינור העצבי של העובר דג הזברה N-cadherin. <img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig3.jpg" alt="איור 3" /> 3. איור ב-catenin חיסונית מכתים של neuroepithelium.

<ol>
	<li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish Practical approach series. , (2002).</li><li>Hong, E., Brewster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+is+required+for+the+polarized+cell+behaviors+that+drive+neurulation+in+the+zebrafish.">N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish.</a> Development. 133, 3895-3905 (2006).</li><li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cell+Motility+and+Actin+Cytoskeleton+of+Individual+Neurons+and+Neural+Crest+Cells+in+Zebrafish+Embryos.">Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

לסיכום, שיטות תיוג המתוארת כאן לאפשר לניתוח תא בודד של תהליכים המוךפו&quot;גנטי שהולך בעובר דג הזברה. הדגש העיקרי של פרוטוקול זה הוא על שיטות דימות תאים שכותרתו בצינור העצבי באמצעות mGFP בשליטת היזם בכל מקום. עבור יישומים נוספים של הקוראים זה assay חולף ביטוי לעיין במאמר לא?...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1976">Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain</a>. There was an error in the authors affiliations. The authors have been corrected to:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster1 1Department of Biological Sciences, University of Maryland, Baltimore County 2Center for Neuroscience, Children's National Medical Center
instead of:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster2 1Center for Neuroscience, Children's National Medical Center 2Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County

A correction to the author affiliations has been made for the article Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain.

Erratum: Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

פתרונות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האנק של צילומים מס &#39;1: 8.0 גרם NaCl, 0.4 גרם ב 100 מ&quot;ל KCl dd H 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האנק של צילומים מס &#39;2: 0.358 גרם Na 2 HPO 4 נטול מים, 0.60 גרם KH 2 PO 4 ב 100 מ&quot;ל DDH 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האנק של מלאי # 4: 0.72 גרם CaCl 2 ב 50 מ&quot;ל DDH 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האנק של מלאי # 5: 1.23 גרם MgSO 4 x7H 2 O ב 50 מ&quot;ל dd H 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 X הצפת פוספט: 0.8% NaCl, KCl 0.02%, 0.02 מ &#39;PO4, pH 7.3 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון חסימת: 2% נסיוב עז רגיל, 1% שור בסרום אלבומין (BSA), dimethysulfoxide 1% (DMSO) </li></ul>

labeling and imaging cells in the zebrafish hindbrain

מפתח להבנת תהליכים המוךפו&quot;גנטי שהולך המעצבות את העובר החולייתנים הראשונים הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. בשנת עוברי דג הזברה, הזרקה של תוצאות ה-DNA פלסמיד בביטוי פסיפס, המאפשר ויזואליזציה של תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים<sup&gt; 1</sup&gt;. אנו מתארים כיצד הזרקה של קידוד הדנ&quot;א פלסמיד קרום במיקוד חלבון פלואורסצנטי ירוק (mGFP) בשליטת היזם בכל מקום ניתן להשתמש בתאים הדמיה עוברת neurulation. במרכז פרוטוקול זה הוא מתודולוגיה תאים הדמיה ברזולוציה גבוהה שכותרתו בסעיפים וגם בזמן אמת. פרוטוקול זה מחייב את הזריקה של ה-DNA mGFP לעוברי דג הזברה הצעיר. עוברים מעובדים ואז חתך vibratome, תיוג נוגדן הדמיה במיקרוסקופ confocal. לחלופין, עוברים לגור להביע mGFP ניתן הדמיה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal. השתמשנו בעבר הגישה הזאת פשוט לנתח את התנהגות הסלולר כי הכונן היווצרות בצינור העצבי באזור למוח האחורי של עוברי דג הזברה<sup&gt; 2</sup&gt;. ההכנות קבוע מותר להדמיה חסר תקדים של צורות התא הארגון הצינור העצבי בעוד הדמיה לחיות השלים גישה זו המאפשרת הבנה טובה יותר של הדינמיקה הסלולר המתרחשים במהלך neurulation.

Watch this Scientific Journal Video about Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain at JoVE.com

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

מפתח להבנת תהליכים המוךפו&quot;גנטי שהולך המעצבים את העובר המוקדם הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. אנו מתארים כאן טכניקה תיוג תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים עוברי דג הזברה שלם עם חלבון הממברנה ממוקד, פלורסנט ירוק.

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

labeling-and-imaging-cells-in-the-zebrafish-hindbrain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K Views.  University of Maryland, Baltimore County. מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך המעצבים את העובר המוקדם הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. אנו מתארים כאן טכניקה תיוג תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים עוברי דג הזברה שלם עם חלבון הממברנה ממוקד, פלורסנט ירוק.

Video: Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

תיוג מדרדר של תאים ברשתית גנגליון מבוגרים דג הזברה עם צבעי ניאון

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

העכבר Hindbrain כמודל ללימוד נוירוג'נסיס עובריים

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

בתחום ההדמיה סידן Vivo של קו הצד תאים שיער בזחל דג זברה

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

זיהוי סמני שטח תא של גזע עצבי ראשוני ובתאי מחולל מטבולית על ידי תיוג מטבולי של סילוגליקן

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). Therefore, detection of the presence of A&#946; in AD brain tissue is a valuable tool for developing new treatments to prevent the progression of AD. Several classical amyloid binding dyes, fluorochrome, imaging probes, and A&#946;-specific antibodies have been used to detect A&#946; histochemically in AD brain tissue. Use of these compounds for A&#946; detection is costly and time consuming. However, because of its intense fluorescent activity, high-affinity, and specificity for A&#946;, as well as structural similarities with traditional amyloid binding dyes, curcumin (Cur) is a promising candidate for labeling and imaging of A&#946; plaques in postmortem brain tissue. It is a natural polyphenol from the herb Curcuma longa. In the present study, Cur was used to histochemically label A&#946; plaques from both a genetic mouse model of 5x familial Alzheimer&#39;s disease (5xFAD) and from human AD tissue within a minute. The labeling capability of Cur was compared to conventional amyloid binding dyes, such as thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR), and Fluoro-jade C (FJC), as well as A&#946;-specific antibodies (6E10 and A11). We observed that Cur is the most inexpensive and quickest way to label and image A&#946; plaques when compared to these conventional dyes and is comparable to A&#946;-specific antibodies. In addition, Cur binds with most A&#946; species, such as oligomers and fibrils. Therefore, Cur could be used as the most cost-effective, simple, and quick fluorochrome detection agent for A&#946; plaques.

Curcumin is an ideal fluorophore for labeling and imaging of amyloid beta protein plaques in brain tissue due to its preferential binding to amyloid beta protein as well as its structural similarities with other traditional amyloid binding dyes. It can be used to label and image amyloid beta protein plaques more efficiently and inexpensively than traditional methods.

תיוג והדמיה של שלטי עמילואיד ברקמת המוח באמצעות פוליפנול טבעי כורכומין

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...