כמו כן, אנו מודים למנתחי הלב באוניברסיטת היידלברג למתן רקמת פרוזדורים אנושיים וקלאודיה Liebetrau, קטרין Kupser ורמונה נגל לקבלת התמיכה הטכנית המעולה שלהם. תודה מיוחדת גם לאנדי וו טראפורד להצעות המועילות שלו והייעוץ במהלך הקמת 2 + המדידות חולפות קליפורניה. המחברים מבקשים להביע את התודה העמוקה ביותר שלהם לחברי המחלקה לפרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה (ראש: העורבים אורסולה) מהאוניברסיטה טכנולוגית של דרזדן על ההזדמנות שהם הציעו לנו ללמוד טכניקות בסיסיות ומיומנויות בסלולריים electrophysiology ובידוד cardiomyocyte. המחקר של המחברים הוא נתמך על ידי קרן המחקר הגרמני (Do769/1-1-3), משרד הגרמני הפדרלי לחינוך ולמחקר באמצעות רשת כשירות פרפור פרוזדורים (01Gi0204) ומרכז הגרמני לחקר לב וכלי דם, איחוד האירופי באמצעות האיחוד האירופירשת ropean למחקר Translational בפרפור פרוזדורים (EUTRAF, FP7-בריאות-2010, פרויקט שילוב בקנה מידה גדול, הצעת מס &#39;261,057) והברית אירופית בצפון אמריקה פרפור פרוזדורי המחקר (ENAFRA) מתן הגט Leducq (07CVD03). הסקירה סכמטית שמוצגת בקובץ הווידאו הופקה באמצעות אמנות רפואית Servier.

פרוטוקולי ניסוי צריכים להיות מאושרים על ידי ועדת האתיקה המקומית וכל החולים צריכים לתת הסכמה מדעת בכתב. המחקר שלנו אושר על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה במנהיים, אוניברסיטת היידלברג (# 2011-216N-MA) ובוצע בהתאם לכל הנחיות מוסדיות, לאומית ובינלאומיות לרווחת אדם. כל החולים נתנו הסכמה מדעת בכתב. 0. קבלת רקמות אנושי פרוזדורים במהלך הליכי cannulation שגרתי בחולים שעברו ניתוח לב פתוח להשתלת המעקפים cardiopulmonary, קצה תוספת פרוזדורי ימין בדרך כלל להסיר ויכול לשמש לבידוד של cardiomyocytes פרוזדורים. לאחר כריתת דגימת הרקמה מועברת מייד לתוך צינור פלקון 50 מ&quot;ל עם סטרילי Ca 2 + ללא פתרון תחבורה המכיל 2,3-butanedione monoxime (טבלת I; BDM, מעכב התכווצות, מניעת ג myocyteontracture). עם זמני הובלה בין דקות 30 ו -45, שלא זיהו את יתרון ברור של קירור או חמצון ביחס לשניהם מספר והאיכות של cardiomyocytes פרוזדורים מבודד. בתחבורה בכלל למעבדה צריכה להיות מהיר ככל האפשר. עם זאת, אם לא ניתן להימנע מתחבורה זמן ארוכה יותר, תחבורה על 4 מעלות צלזיוס בפתרון חומץ עשויה להיות יתרון. 1. Prearrangements <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את thermocirculator, אשר שולט על הטמפרטורה של כוס המעייל (לוח ב &#39;). ודא שהטמפרטורה בתוך הכוס שווה 37 ° C. לכסות את הכוס עם מכסה זכוכית כדי לשמור על טמפרטורה קבועה בתוך הכוס לאורך כל תהליך הבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל אני collagenase ופרוטאז XXIV לשלוש כוסות זכוכית ולאחסן אותו בטמפרטורת חדר. האנזימים ידוללו רק לפני שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות 20 מ&quot;ל של Ca 2 + פתרון חופשי בצלחת פטרי ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">חנות 250 מ&quot;ל של Ca 2 + פתרון חופשי באמבט מים ב 37 ° C. </li></ol> 2. ניקוי של הרקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את דגימת הרקמה יחד עם פתרון התחבורה לתוך צלחת פטרי (~ קוטר 10 ס&quot;מ) ולהסיר רקמת שומן בערך באמצעות מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את דגימת הרקמה. בין 200 ל 600 מ&quot;ג משמש לבידוד בתא. הרקמה שנותרה ניתן להקפיא בחנקן נוזלי לצורך הניתוח מאוחר יותר ביוכימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את דגימת הרקמה לתוך צלחת פטרי המכילה 20 מ&quot;ל Ca 2 + פתרון חופשי על 4 מעלות צלזיוס (ראה שלב 1.3) וקוצץ את דגימת הרקמה לחתיכות קטנות של כ 1 מ&quot;מ 3 בגודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלבים הבאים צריכים להיות מוצאים להורג על 37 מעלות צלזיוס ותחת המתה בגז רציפה עם 100% O 2. קצה פיפטה ניתן להציב על צינור החמצן כדי למנוע בעבוע חזק וליצור זרימת אוויר רציפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את נתחי הרקמות יחד עם פתרון Ca 2 + ללא בלכוס ומערבבים בזהירות מעייל לכ -3 דקות עם בר בחישה מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק לבחוש ולאפשר את נתחי הרקמות להתיישב לכמה שניות. מסנן את supernatant בזהירות דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר, לוח ב &#39;). להחזיר את נתחי רקמות המאופקים מהרשת לתוך הכוס באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את הכוס עם Ca 2 + פתרון חופשי ולחזור על שלב הכביסה 2.4 ו -2.5 פעמיים. </li></ol> 3. עיכול אנזימתי ראשון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את נתחי רקמות עם 20 מיליליטר אנזים הפתרון E1 (טבלת I) המכיל collagenase ופרוטאז ומערבבים היטב במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של 10 מ&quot;מ CaCl 2 פתרון להשיג ריכוז סופי של 20 מיקרומטר Ca 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 35 דקות מסננות את supernatant בזהירות דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר, לוח ב &#39;) באופן שרוב גושי הרקמה יישאר בכוס. תשואת יתרירד גשם גושי רקמה מהרשת לתוך הכוס. </li></ol> 4. עיכול אנזימתי שני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את נתחי רקמות שוב עם collagenase 20 מיליליטר אנזים פתרון E2 המכיל רק אני (טבלת I). הוסף 40 μl של 10 מ&quot;מ CaCl 2 פתרון באופן מיידי כדי להשיג ריכוז סופי של 20 מיקרומטר Ca 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך שימוש במספרי העיכול השני לקצוץ נוסף קרישי רקמות מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 דקות לקחת דגימה באמצעות פיפטה פסטר כדי לבדוק את הניתוק של תאים. חזור על כל 2-3 דקות עד שזה cardiomyocytes בצורת המוט, מפוספס יופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק לבחוש ולאפשר את נתחי הרקמות להתיישב לכ 20-30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את supernatant בזהירות דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר, לוח השני) לתוך 50 מ&quot;ל פלקון צינור (Tube). להחזיר את נתחי רקמות המאופקים מהרשת לתוך הכוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את נתחי רקמות בכוס עם 20 מ&quot;ל StoraGE הפתרון (טבלת I) 10 ועוד יותר לנתק את התאים על ידי טחינה דקה מכאנית עדינה בעזרת פיפטה סרולוגיות 20 מ&quot;ל עם מתקן. נסו להימנע מהיווצרות בועה מאז בועות משפיעות לרעה על הישרדות תא ואיכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את supernatant בזהירות דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר, טבלה השנייה) לתוך 50 מ&quot;ל פלקון Tube (צינור B). </li></ol> 5. הכנה סופית והתאמה הסופית Ca 2 + ריכוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הן פלקון צינורות A ו-B (ראה שלב 4.5 ו -4.7) בשעה 95 XG במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant משני הצינורות בזהירות על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את שני כדורים בפתרון 1.5 מיליליטר אחסון (טבלת I) כל אחד (בטמפרטורת חדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שתי פעמים μl 7.5 מ&quot;מ של פתרון 2 10 CaCl לכל פלקון ומערבבים בזהירות. דגירה של 10 דקות לאחר כל שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הוסף 15 μl של פתרון 10 מ&quot;מ CaCl 2 להשיג 2 + ריכוז Ca סופי של 0.2 מ&quot;מ. </li></ol> 6. טעינה של myocytes עם פלורסנט Ca 2 + מחוון Fluo-03:00 (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 1.5 מ&quot;ל של השעיה תא (צינור ו / או צינור B) לתוך צינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל (צינור Eppendorf). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לבצע את הפעולות הבאות בחשבון של הרגישות לאור של ניאון Ca 2 + מחוון Fluo-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 50 מיקרוגרם של נגזר הקרום החדיר acetoxymethyl אסתר של Fluo-3 (Fluo-3 בבוקר, טבלת III) ב44 μl של Pluronic פתרון מניות ה-F-127 (טבלת III) (20% w / v בDMSO נטול מים) כדי לקבל 1 מ&quot;מ Fluo-03:00 פתרון מניות, שניתן לאחסן ב -20 ° C למשך שבוע לכל היותר 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 μl של Fluo-03:00 מניות פתרון לצינור microcentrifuge המכיל 1.5 מ&quot;ל של השעיה תא (ראה שלב 6.1) ולהתסיסבזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ההשעיה התא למשך 10 דקות בקופסה אטומה אופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה צנטריפוגות בכ -6,000 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant מחדש להשעות את גלולה בפתרון אמבטיה 1.5 מ&quot;ל (לוח ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את ההשעיה התא לכ -30 דקות לדה esterification לפני תחילת עם ניסויים. </li></ol> 7. תיקון-מהדק וepifluorescent Ca 2 + מדידות בו זמנית מאז מדידות תיקון-הידוק לא הנושא המרכזי של סקירה זו, אנו מתייחסים לקורא מעוניין לפרסומים אחרים המספקים יותר בתיאור מעמיק של טכניקה זו. 11-14 למען השלמות אנו מספקים סיכום קצר של פרוטוקול למדידה פוטנציאל פעולה או L-type Ca 2 + שני זרמים, ביחד עם 2 הקלטות בו זמנית חולפות +-CA. במהלך ניסויי myocytes הם superfused על 37 מעלות צלזיוס עם האמבטיה solutiעל לוח (IV) באמצעות מערכת טפטוף מהירה (Octaflow IITM, ALA מכשירים מדעיים, ניו יורק). עבור ניסויי מתח מהדק, K + זרמים חסומים על ידי הוספת 4-aminopyridine (5 mmol / L) וBaCl 2 (0.1 mmol / L) לפתרון האמבטיה. microelectrodes זכוכית ורוסיליקט משמש וצריך להטות התנגדויות של 2-5 MΩ כאשר התמלא פיפטה פתרון (לוח ה). בנוסף לFluo-03:00 טעינה של myocytes (ראה שלב 6), Fluo-3 כלולים גם בפתרון פיפטה (לוח ה). הקרינה היא נרגשת ב488 ננומטר ואור נפלט (&lt;520 ננומטר) יומר ל[ Ca 2 +] אני מניח <img alt="משוואת 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> כאשר k = ד ניתוק מתמיד של Fluo-3 (864 Nז), F = Fluo-3 הקרינה;. F max = Ca 2 + רווי הקרינה המתקבלת בסופו של כל ניסוי 12 שני אותות חשמליים וCa 2 + אותות epifluorescent נרשמים בו זמנית. פוטנציאל פעולה הוא גירוי ברמה של 0.5 הרץ במצב נוכחי מהדק באמצעות פולסים 1 msec הנוכחיים של כוח סף 1.2x. L-סוג Ca 2 + זרמים נמדדים במצב מתח מהדק באמצעות פוטנציאל החזקת -80 mV ורמפת דופק של 100 אלפית שנייה ל-40 mV להשבית Na המהיר + שוטף, ואחרי 100 אלפיות שנייה בדיקת דופק ל+10 mV ברמה של 0.5 הרץ.

<ol>
	<li>Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+molecular+pathophysiology+of+atrial+fibrillation.">Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation.</a> J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).</li><li>Margaret, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsation,+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro.">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).</li><li>Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+atrial+and+ventricular+cells+from+the+human+heart.">Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart.</a> Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).</li><li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-Protein+&#946;3-subunit+825T+allele+is+associated+with+enhanced+human+atrial+inward+rectifier+potassium+currents.">G-Protein &#946;3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents.</a> Circulation. 102, 692-697 (2000).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+phosphorylation-dependent+regulation+of+constitutively+active+and+muscarinic+receptor-activated+IK,ACh+channels+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+IK,ACh+current+may+contribute+to+clinical+efficacy+of+class+I+and+class+III+antiarrhythmic+drugs+in+patients+with+atrial+fibrillation.">Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation.</a> Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).</li><li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G+protein-gated+potassium+current+IK,ACh+is+constitutively+active+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 112, 3697-3706 (2005).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-to-right+atrial+inward+rectifier+potassium+current+gradients+in+patients+with+paroxysmal+versus+chronic+atrial+fibrillation.">Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation.</a> Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).</li><li>Amos, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+between+outward+currents+of+human+atrial+and+subepicardial+ventricular+myocytes.">Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes.</a> J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).</li><li>Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrarapid+delayed+rectifier+current+inactivation+in+human+atrial+myocytes:+properties+and+consequences.">Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences.</a> Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).</li><li>Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-clamp-based+methods+for+the+detection+of+constitutively+active+acetylcholine-gated+IK,ACh+channels+in+the+diseased+heart.">Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart.</a> Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).</li><li>Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca2++buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++content+in+cardiac+ventricular+myocytes.">A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).</li><li>Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proarrhythmic+atrial+calcium+cycling+in+the+diseased+heart.">Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++leak+and+increased+Na+-Ca2++exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125, 2059-2070 (2012).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+metabolism+of+intact+muscle+cells+isolated+from+adult+rat+heart.">Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart.</a> Circ Res. 26, 679-687 (1970).</li><li>Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+calcium+tolerant+myocytes+from+adult+rat+hearts:+review+of+the+literature+and+description+of+a+method.">Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method.</a> Life Sci. 33, 1-18 (1983).</li><li>Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart.">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211, 646-647 (1966).</li><li>Bielecki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+changes+in+pH+of+the+perfusion+fluid+on+the+occurrence+of+the+calcium+paradox+in+the+isolated+rat+heart.">The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart.</a> Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).</li><li>Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+taurine+on+calcium+paradox+and+ischemic+heart+failure.">Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure.</a> Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).</li><li>Rich, T. L., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+depletion+in+rabbit+myocardium.+Calcium+paradox+protection+by+hypothermia+and+cation+substitution.">Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution.</a> Circ. Res. 51, 131-141 (1982).</li><li>Isenberg, G., Klockner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+tolerant+ventricular+myocytes+prepared+by+preincubation+in+a+"KB+medium".">Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium".</a> Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).</li><li>Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes.">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).</li><li>Worthington, K., Worthington, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Worthington Enzyme Manual. , (1993).</li><li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology-specific+effects+of+the+IKur/Ito/IK,ACh+blocker+AVE0118+on+ion+channels+in+human+chronic+atrial+fibrillation.">Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).</li><li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+downregulation+of+G-protein-coupled+inward+rectifying+K++current+IK,ACh+in+chronic+human+atrial+fibrillation:+decrease+in+GIRK4+mRNA+correlates+with+reduced+IK,ACh+and+muscarinic+receptor-mediated+shortening+of+action+potentials.">Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials.</a> Circulation. 104, 2551-2557 (2001).</li><li>Hatem, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+compartments+of+sarcoplasmic+reticulum+participate+in+the+excitation-contraction+coupling+process+in+human+atrial+myocytes.">Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes.</a> Circ. Res. 80, 345-353 (1997).</li><li>Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+different+potassium+channels+in+human+atrium.+Contribution+to+the+basal+potassium+conductance.">Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance.</a> Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).</li><li>Hove-Madsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+fibrillation+is+associated+with+increased+spontaneous+calcium+release+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+human+atrial+myocytes.">Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes.</a> Circulation. 110, 1358-1363 (2004).</li><li>Molina, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+adenosine+monophosphate+phosphodiesterase+type+4+protects+against+atrial+arrhythmias.">Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).</li></ol>

וורטינגטון יוכימית קורפ נתמך פרסום זה על ידי כיסוי עלויות ייצור של קובץ וידאו. היו הממנים שום תפקיד בתכנון מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד.

כאן אנו מתארים שיטה לבידוד של myocytes פרוזדורי אדם מנספחי פרוזדורים הנכונים שהתקבלו מחולים שעברו ניתוח לב פתוח. על מנת להשתמש בmyocytes אלה למדידות של cytosolic Ca 2 + מתאמנים שיטה שתוארה בעבר על ידי השמטת EGTA 4-11 מפתרון האחסון. כבר בשנת 1970 זה היה ציין כי למרות שmyocytes לנתק בנוכחות של Ca 2 + במהלך עיכול, כולם היו בהתכווצות ואינו בת קיימא. 16,17 לכן, בידוד תא מתבצע בCa 2 + ללא פתרון. עם זאת, מחדש המבוא של ריכוזים פיסיולוגיים של Ca 2 + הביא המהיר Ca 2 + זרם ומוות של תאים. זו תוארה כ2 + תופעת פרדוקס Ca אשר נצפתה במקור בלבבות perfused ידי צימרמן וHulsman. 18 שינויים של תקשורת הבידוד כולל הפחתה של ה-pH 7.0, &lt;sup&gt; 19 תוספת של 20 taurin או של כמויות קטנות של 2 + (ראה שלב 3.2 ו -4.1) Ca, 21 כמו גם אחסון של myocytes מבודד בEGTA המכיל אחסון פתרון 22 כבר הציע על מנת למנוע את Ca 2 + פרדוקס. 17 עם זאת, זה ידוע היטב כי Ca 2 + חציצה באמצעות EGTA מקטין את המשרעת של L-סוג Ca 2 +-Induced Ca 2 + נוכחי אמפליטודות ותוצאות בריקבון biphasic של Ca 2 + הארעיים חולפות. 23 לכן, אנו הושמטו EGTA לאורך כל תהליך הבידוד על מנת לקבל Ca 2 + ארעיים עם מאפיינים טיפוסיים והתפרקויות monophasic. כדי להגן על התאים מCa 2 + פרדוקס הגדלנו 2 + ריכוז Ca הסופי של פתרון האחסון באופן הדרגתי עד 0.2 מ&quot;מ. הבחירה של collagenase היא כנראה השלב הקריטי ביותר לבידוד myocyte מוצלח. קול קונבנציונליagenases הם הכנות גולמי המתקבלות מקלוסטרידיום histolyticum ומכיל collagenase בנוסף למספר proteinases, polysaccharidases וlipases האחרים. בהתבסס על collagenases ההרכב הכללי שלהם מחולקים לסוגים שונים. -24 סוגי collagenase ורטינגטון I ו-II היו בשימוש בהצלחה לבידודה של myocytes פרוזדורי אדם. 4-10,15,25-30 בפרוטוקול המתואר כיום אנו ממליצים על השימוש בcollagenase הקלד, למרות שהיינו גם יכול להשיג כמויות מקובלות של תאי קיימא באמצעות collagenase סוג II. עם זאת, אפילו בתוך סוג collagenase אחת יש וריאציה אצווה כדי אצווה משמעותית ביחס לפעילות האנזים. וריאציות אלו דורשות בחירה אצווה זהירה ובדיקה של קבוצות שונות כדי לייעל את הליך בידוד. הכלי אצווה בחירה זמינה באינטרנט ומורטינגטון קורפ (ביוכימית <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / CLS / match.php) ניתן להשתמש כדי למצוא קבוצות זמינות עם הרכב שהוכח להיות מתאים לבידודה של myocytes פרוזדורי אדם. כיום אנחנו משתמשים בcollagenase הקלד עם פעילות 250 U / מ&quot;ג collagenase, פעילות 345 U / מ&quot;ג caseinase, פעילות 2.16 U / מ&quot;ג clostripain ופעילות 0.48 U / מ&quot;ג tryptic (הרבה 49H11338 #). את התאים המתקבלים באמצעות ההליך המתואר בכתב היד הזה יכולים לשמש בתוך 8 שעות ללימודי תיקון-קלאמפ, Ca 2 + מדידות חולפות, ושילוב של שניהם. 15 בנוסף, תאים אלה מאפשרים מדידות של התכווצות סלולרית בתגובה לגירוי שדה החשמלי או גירוי חשמלי באמצעות פיפטה את תיקון המהדק (תצפיות שלא פורסמו).

<html> לימוד מאפייני אלקטרו של תעלות יונים לב עם טכניקת תיקון המהדק והחקירה של הסלולר Ca 2 + מומים טיפול דורשים cardiomyocytes מבודד. אלה הם בדרך כלל מתקבלים בעקבות החשיפה במבחנה של דגימות רקמת לב לאנזימי עיכול (collagenase, hyaluronidase, peptidase וכו &#39;). מאז הדו&quot;ח הראשון של בידוד של myocytes לב קיימא בשנת 1955 2 כמות גדולה של פרוטוקולים פותחה במטרה לקצור cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים בודדים ממינים שונים, כולל עכבר, חולדה, ארנב, כלב, חזיר ואדם. בסקירה זו אנו מתמקדים בבידוד של myocytes פרוזדורי אדם. בנוגע לנהלים לבידודה של myocytes ממינים אחרים שאנחנו מתייחסים לאוכלוסיית &quot;וורטינגטון רקמות דיסוציאציה המדריך&quot; המסופק על ידי וורטינגטון יוכימית קורפ, ארה&quot;ב <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">(www.tissuedissociation.com).</a> = &quot;Jove_content&quot;&gt; פרוטוקולי בידוד myocyte פרוזדורי אדם בדרך כלל נגזרים מהשיטה שתוארה על ידי בוסטמנטה, et al. 3 כאן אנו מספקים תיאור צעד אחר צעד של טכניקה, אשר מותאם משיטה שפורסמה בעבר, על מנת להשיג myocytes פרוזדורים מתאים לא רק לניסויי תיקון-מהדק אלא גם עבור Ca 2 + מדידות תאיות בו זמנית. 4-11

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> &nbsp;</td>
 <td> &nbsp;</td>
 <td> &nbsp;</td>
 <td>Transport solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A3059</td>
 <td>Storage solution: 1%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BDM</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>31550</td>
 <td>Transport solution: 30</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-b-Hydroxy-butyric acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6501</td>
 <td>Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td>Transport solution: 20 
 Ca2+-free solution: 20 
 Enzyme solution E1 and E2: 20 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1251</td>
 <td>Storage solution: 70</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Transport solution: 10 
 Ca2+-free solution: 10 
 Enzyme solution E1 and E2: 10 
 Storage solution: 20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KH2PO4</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P5655</td>
 <td>Transport solution: 1.2 
 Ca2+-free solution: 1.2 
 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO4</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M9397</td>
 <td>Transport solution: 5 
 Ca2+-free solution: 5 
 Enzyme solution E1 and E2: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MOPS</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M1254</td>
 <td>Transport solution: 5 
 Ca2+-free solution: 5 
 Enzyme solution E1 and E2: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3014</td>
 <td>Transport solution: 100 
 Ca2+-free solution: 100 
 Enzyme solution E1 and E2: 100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taurin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>86330</td>
 <td>Transport solution: 50 
 Ca2+-free solution: 50 
 Enzyme solution E1 and E2: 50 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase I</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>4196</td>
 <td>Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease XXIV</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8038</td>
 <td>Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml*</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Transport solution: 7.00 
 Ca2+-free solution: 7.00 
 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 
 Storage solution: 7.40</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Transport solution: 1 M NaOH 
 Ca2+-free solution: 1 M NaOH 
 Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH 
 Storage solution: 1 M KOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table I. Solutions.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon mesh (200 &mu;m)</td>
 <td>VWR-Germany</td>
 <td>510-9527</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Jacketed reaction beaker</td>
 <td>VWR</td>
 <td>KT317000-0050</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table II. Specific equipment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl-sulphoxide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2650</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-3 AM (special packaging)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F-1242</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F-127</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P6867</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Bath solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-aminopyridine*</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A78403</td>
 <td>Bath solution: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BaCl2*</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>342920</td>
 <td>Bath solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2 &times; 2H2O</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C5080</td>
 <td>Bath solution: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td>Bath solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H9136</td>
 <td>Bath solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Bath solution: 4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl &times; 6H2O</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M0250</td>
 <td>Bath solution: 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3014</td>
 <td>Bath solution: 140</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Probenecid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8761</td>
 <td>Bath solution: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Bath solution: 7.35</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Bath solution: 1 M HCl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Pipette solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-aspartat K+-salt</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2025</td>
 <td>Pipette solution: 92</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E4378</td>
 <td>Pipette solution: 0.02</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP-Tris</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G9002</td>
 <td>Pipette solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H9136</td>
 <td>Pipette solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Pipette solution: 48</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9187</td>
 <td>Pipette solution: 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2383</td>
 <td>Pipette solution: 4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-3**</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F3715</td>
 <td>Pipette solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>7.20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>1 M KOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and membrane currents

המחקר של מאפייני אלקטרו של תעלות יונים לב עם טכניקת תיקון המהדק וחקר הלב הסלולרי Ca 2 + מומים טיפול דורש cardiomyocytes מבודד. בנוסף, האפשרות לחקור myocytes מחולים תוך שימוש בטכניקות אלה היא דרישה לא יסולא בפז על מנת להבהיר את הבסיס המולקולרי של מחלות לב כגון פרפור פרוזדורים (AF). 1 כאן אנו מתארים שיטה לבידוד של myocytes פרוזדורי אדם אשר מתאימות לשניהם מחקרי תיקון-מהדק ומדידות בו זמניות של 2 + ריכוזי Ca תאיים. ראשית, נספחים פרוזדורים הנכונים שהתקבלו מחולים שעברו ניתוח לב פתוח מבותרים לחתיכות קטנות של רקמה (&quot;נתח שיטה&quot;) ורחצו בCa 2 + ללא פתרון. ואז את נתחי הרקמות מתעכלים בcollagenase ופרוטאז המכילים פתרונות עם 20 מיקרומטר Ca 2 +. לאחר מכן, myocytes המבודדים הוא הארוויsted על ידי סינון וצנטריפוגה של ההשעיה הרקמות. לבסוף, Ca 2 + הריכוז בפתרון אחסון התא מותאם לשלבי 0.2 מ&quot;מ. אנו דנים בקצרה את המשמעות של Ca 2 + וCa 2 + החציצה במהלך תהליך הבידוד וגם מספקים הקלטות מייצגות של פוטנציאל פעולה וזרמים בממברנה, שניהם בו זמנית יחד עם Ca 2 + ארעיות מדידות, שבוצע בmyocytes המבודדים אלה.

איור 2 א מציג שלוש דוגמאות מייצגות מmyocytes פרוזדורי זכויות אדם מבודד. כדי לכמת את תשואת התא אנו פיפטה μl 10 של השעיה תא (שלב 5.5) בשקופית מיקרוסקופ CellFinder <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">(http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html).</a> תשואות ממוצעות של תא באיור 2 עולה בבירור כי קיימת נטייה לתשואות נמוכות יותר בתא הכרוני AF (CAF) דגימות חולים (שפופרת A: 16.5 ± 3.1 cells/10 μl (n = 29) לעומת 5.1 ± 2.3 cells/10 μl (N = 10) בSR וקפה, בהתאמה, p &lt;0.05; צינור B: 17.9 ± 3.9 cells/10 μl (n = 29) לעומת 5.9 ± 2.0 cells/10 μl (n = 9) בSR וקפה, בהתאמה, p = 0.107). דוגמאות מייצגות של מדידות פעולה פוטנציאליות והקלטות בו זמניות של Ca 2 + ארעיים cytosolic ניתנות באיור 3. בכ -90% מהתאים שנחקרו, tהוא פעולה ופוטנציאל, מופעל Ca 2 + שחרור גורם להתכווצויות תא ברורות וקבועות. כפי שדווח בעבר, פוטנציאל הממברנה במנוחה, אשר מהווה אינדיקטור מקובל לשלמות תא, בממוצע כ -73.9 ± 2.7 mV (n = / חולים 23/10 myocytes) ו-77.7 / חולי ± 1.8 (n = 19/8 myocytes mV ) בSR וCAF בהתאמה (p &lt;0.05). 15 איור 4 מראה הקלטות בו זמנית יציגים של מתח מגודרת סוג L-Ca 2 + הזרמים וCytosolic Ca 2 + ארעיים. יישום של isoprenaline אגוניסט β-adrenoceptor לא סלקטיבי (1 מיקרומטר) מגדיל אמפליטודות של שניהם אני Ca, L ו cytosolic Ca 2 + ארעיים, המצביע על מפל הולכים אותות β-adrenergic ללא פגע. <img alt="איור 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> F1 igure. תרשים זרימה של myocytes Fluo-03:00 טעינת פרוטוקול (ראה שלב 6.1-6.5). M / V, מסה / נפח. <img alt="איור 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> איור 2. A, myocytes מבודד אדם נכון פרוזדורים לאחר שעה אחת בפתרון אחסון. B, ממוצע ± SEM של תשואת התא נספרת ב10 μl של תאים בפתרון אחסון (ראה שלב 5.5). N מתייחס למספר של הכנות בתוך כל קבוצה. * P &lt;0.05. <img alt="איור 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> הקלטות נציג איור 3. של פעולה ופוטנציאל אצבע קל על הדק Ca 2 + ארעיים (CAT) בmyocyte פרוזדורים מקצב סינוס וChrחולה פרפור פרוזדורי onic. למעלה: הזריק קרום נוכחי (אני מ &#39;) המשמש לגירוי (0.5 הרץ). להלן: הקלטה בו זמנית של פוטנציאל הממברנה (V ז), וחתול מופעל (תחתון). (Replotted באישור וויגט et al. 2012) 15 <img alt="איור 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> הקלטות נציג איור 4. של האפקט (1 מיקרומטר) isoprenaline על סוג L-Ca 2 + נוכחי אצבע קל על ההדק Ca 2 + ארעיים (CAT) בmyocyte פרוזדורים מקצב סינוס ומטופל פרפור פרוזדורים כרוני. למעלה: מתח מהדק פרוטוקול (0.5 הרץ). להלן: הקלטה בו זמנית של קרום נטו נוכחי (אני מ &#39;), המשקף בעיקר סוג L-Ca 2 + חתול נוכחי (באמצע) והפעיל (תחתון). (Replotted באישור וויגט,et al. 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="טבלת 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> פתרונות I. טבלה. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="טבלה 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> טבלה השנייה. ציוד ספציפי. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="טבלה 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> לוח ג. חומרים לטעינה של myocytes עם Fluo-3 PM. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="טבלה 4" fo:conteNT-width = &quot;2.5in&quot; עבור: src = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot; /&gt; לוח ד. פתרון אמבט לתיקון מהדק. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="טבלה 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> טבלת פתרון V. פיפטה לתיקון מהדק *.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents at JoVE.com

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

אנו מתארים את בידודו של myocytes פרוזדורי אדם אשר יכול לשמש לתאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; מדידות בשילוב עם לימודי תיקון-מהדק אלקטרו.

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ארעי וזרמים הממברנה

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

isolation-human-atrial-myocytes-for-simultaneous-measurements-ca2

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

20.3K Views.  University of Duisburg-Essen. אנו מתארים את בידודו של myocytes פרוזדורי אדם אשר יכול לשמש לתאיים Ca 2 + מדידות בשילוב עם לימודי תיקון-מהדק אלקטרו.

Video: Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

בידוד מניפולציה גנטית של Myocytes לב למבוגרים הדמיה confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

טכניקות הדמיה Ca 2 + איתות זרע אנושי

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

בידוד והקלטות בערוץ KV בcardiomyocytes פרוזדורים וחדרית Murine

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

פיתוח ואפיון של<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; וייצור Nitric Oxide

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

מיפוי בו זמנית, כימות של Ribonucleotides ב- DNA מיטוכונדריאלי אנושי

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video