המחברים מבקשים להודות למישל קית של מתקן MD Anderson הקטן בעלי חי ההדמיה לסיוע הטכני שלו עם מיקרו-CT, אדוארד TH יה, MD, לקבלת סיוע כירורגית, ורבקה Bartow, PhD, לסיוע מערכת. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי איגוד הלב האמריקאי.

1. תחול משאבת אוסמוטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקות סטריליות כפפות (למשל, מכסה המנוע זרימה למינרית) בעת עריכת המשאבות. הסר את המשאבה ומנחת זרימה מהאריזה. שוקל המשאבה הריקה ולהקליט את המשקל (מ&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את המשאבה באיטיות, כדי להימנע מיצירת בועות אוויר, על ידי שימוש במזרק 1cc קטן וצינור מילוי 27G הקהה שקצהו. כאשר הפתרון מגיע לחלק עליון של המשאבה, להפסיק מילוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את הפתרון העודף ולשקול את המשאבה מלאה. עבור רוב התמיסות מימיות, במשקל במ&quot;ג הוא אותו הדבר כמו בנפח μl. ההבדל במשקל ריק לעומת מלא צריך להיות יותר מ -90% מהיקף המילוי הממוצע שצוין. אם לא, לפנות את המשאבה עם המזרק ולמלא. אם אתם חווים קושי טכני עיין בסעיף פתרון הבעיות של הוראות המשאבה בhttp://www.alzet.com/products/guide_to_use/filling.html </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג מלקחיים כדי לשבור את מקורבות לבנה מmoderat הזרימהאו; להיזהר שלא להתכופף או למעוך את הצינור. צרף קטטר P50 לכל צד של המנחה, המשתרע על 3-4 מ&quot;מ. השתמש במזרק כדי למלא את הקטטר ומצורף המנחה ולהשאיר את המזרק המצורף לחלק הדיסטלי של קטטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המנחה לזרום לתוך המשאבה עד לקטטר הוא מיושר עם משטח המשאבה. לאחר מכן, הוצא את המזרק מהקצה הדיסטלי של קטטר. הנח את המשאבה בתמיסת מלח סטרילית 0.9% או פתרון PBS ב37 מעלות צלזיוס חממה למינימום של 6 שעות (רצוי O / N) לראש המשאבה לפני השתלתו לתוך העכבר. שיעור אספקת המשאבה משתנה עם מספר הדגם (כלומר דגם 1002 = 0.25 μl / שעה במשך 14 ימים). </li></ol> 2. יצירת איסכמיה hindlimb חד צדדית בעכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי העכברים עם סט isoflurane בין 2-4% ב 100% O 2 בקצב זרימה של 0.4 ליטר / דקה ולהסיר את השיער (רצוי היום לפני הניתוח) באזור hindlimb וחוזר עם depilatoקרם ר&quot;י. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל הכלים כירורגיים לפני הניתוח. מניחים את העכבר בתא ההרדמה האינדוקציה. השתמש באותן הגדרות ההרדמה המתוארות בסעיף 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד שהעכבר הוא שאינם מגיב לגירויים חיצוניים ולאחר מכן למקם אותו בעמדה נוטה על שולחן הניתוחים עם חרטום מצויד המספק זרימה רציפה של isoflurane (1.5-2.0%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את המינון המומלץ של חומר הרדמה (Bupivacaine; 0.25% (&lt;מ&quot;ל 1 ק&quot;ג /)) באתר החתך; טיפול בעור עם פתרון povidone-יוד ואחריו 70% אתנול. ביצוע חתך 4-6 מ&quot;מ בחלק האחורי (בצד של עמוד השדרה, באזור ההשכמות). להפריד את הקרום תת עורית עם מלקחיים עדינים ואז הפעל את העכבר למצב שכיבה טיפול בעור עם פתרון povidone-יוד ואחריו 70% אתנול ולעשות חתך עם מספריים 0.8-1 ס&quot;מ מיקרו כירורגיות מעל הברך לכיוון הירך המדיאלי, בעקבות הנתיב של עורק הירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנהרה עדצד של פלג גוף עליון עם צינורות נדן קטנים (6 הצרפתי) מהירך המדיאלי לחתך בגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר בעמדה פגיע. הסר את המשאבה / קטטר דרוכים האוסמוטי מפתרון PBS ולהנחות את הצנתר, דרך צינורות הנדן, לירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את המשאבה בתוך קדימה ולסגור את החתך חזרה עם 6-0 תפר prolene (טיפול בעור עם פתרון povidone-יוד ואחריו אתנול 70%). מניחים את העכבר אחורה במצב שכיבה, להסיר את צינור הנדן, והשאיר את הקטטר נחשף דרך החתך על הירך. אבטח את הרגל עם פלסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את רקמת השומן תת עורי כדי לחשוף את כלי הדם. כדי להמחיש טוב יותר בכלי הדם, יש להשתמש במפשק כדי לפתוח את החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירס נדן הירך הקרומי בעדינות באמצעות מלקחיים עדינים מחודדים לגשת צרור כלי הדם. לנתח ולהפריד את עורק הירך מעורק הירך ואת העצב ליד המפשעה, נזהר שלא לגרום לשעברדימום cessive. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני תפרי מקום 8-0 Prolene סמוך לקטוע את עורק הירך 2-3 מ&quot;מ הפרוקסימלי להסתעפות הירך (מקורו של femoris profunda ועורקי epigastrica). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הצנתר לאורך המתאים ומקום הקצה לאזור anterolateral של הירך, לקבע אותו עם תפר 6-0 prolene לfascia השטחי כדי להבטיח אספקה ​​ממוקדת של החומר. סגירה החתך ברגל עם תפר ריצה 6-0. לנהל הזרקה תת עורית של משכך כאבים סופית (עצירות; 0.1 מ&quot;ג / ק&quot;ג), לטיפול בעור עם פתרון povidone-יוד ואחריו 70% אתנול ולהחזיר את העכבר לכלוב. השתמש במנורת חימום במהלך התאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת החלמה של 30 דקות, להכין לעכבר לייזר דופלר הדמיה כדי לאשר את הקמתה של איסכמיה hindlimb. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על בעלי החיים, פעמים ביום במשך 5 ימים לאחר ניתוח. ניידות של החיה יקויימו לנתח כאב; פסולת בכלוב תשמש כהודיator של אכילה. כמו כן, במהלך התקופה לפקח לקבוע אם החיה היא חוותה כאב או אי נוחות ונותן זריקה תת עורית של עצירות (0.1mg/kg) פעמיים ביום. </li></ol> 3. הכנת דגימת הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר כאמור בסעיף 2.1. העבר את העכבר על שולחן הניתוחים במצב שכיבה. הזרק 1,000 IU של הפרין תת עורי למניעת קרישה בכלי הדם. בעוד העכבר מחובר לnosecone, עושה חתך גדול מספיק כדי לחשוף את חלל בית החזה ובטן התחתונה. להזיז את אברי הבטן לצד השמאל של בעלי החיים כדי לחשוף את אב העורקים הבטני (רש&quot;ת). להפריד בזהירות את אב העורקים מהווריד הנבוב הנחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולקשור את רשות העתיקות הפרוקסימלי כדי להפחית דימום במהלך החדרת קטטר. ואז, לעשות חתך קטן ברשות העתיקות. הכנס 27 ½ G בוטה מחט (שמחובר לקטטר P10) לרשות העתיקות ולאבטח אותו עם תפר 6-0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו שתייםהמזרקים 20cc עם מלח heparinized ו -10% ניטראלי שנאגרו פורמלין (NBF). ממלאי מזרק 5cc עם תרכובת גומי סיליקון radiopaque ניגוד. מערבבים את שלושה מרכיבים של MV-מתחם: סוכן MV-ריפוי ביחסי עבודה של 1:1.25:0.5: MV-diluent. מאז את התערובת (Microfil) יש זמן עבודה של 20 דקות בלבד לפני שסוכן polymerizes, מומלץ שלא להוסיף את סוכן MV-הריפוי עד ממש לפני ההזרקה לתוך כלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך בעלייה הימנית ולנהל ממנת יתר של isoflurane לגרום להמתת חסד, ולאפשר לניקוז נוזלים עודפים. צרף את המזרק מלא בתמיסת מלח לקצה המחט ומתחיל לשטוף כלי הדם במשך 5 דקות. ודא שכל הדם סמוק החוצה מכלי; לכבות את isoflurane ונתק את nosecone פעם השטיפה מתחילה. בשלב הבא, לצרף את המזרק המלא בפורמלין לקטטר שפורט לעיל (3.2) וperfuse לחץ ל5 דקות נוספות. לבסוף, perfuse המזרק שעבר, עם הניגודסוכן, לאט לתוך העכבר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: צילום Microfil בכלי הדם עם מצלמה על מנת להבטיח כי רק את המבנה העורק הוא perfused. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר במכל מלא בNBF 10% ולאחסן ב 4 ° CO / N לפילמור חומר הניגוד. לאחר 24 שעות, להסיר את העור על חיצו התחתון של הטורסו (דיסטלי לקשירת אב העורקים בבטן תחתונה) על ידי שימוש בכלים לנתיחה, לרענן 10% NBF, והנח את העכבר בחזרה לתוך המכל למשך 4 ימים נוספים ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את hindlimbs הנגדי ואיסכמי, ולמקם את הדגימות בפתרון חומצה פורמית (קאל-EX II) עבור 48 שעות כדי להקל decalcification של העצם. לאחר מכן, יש לשטוף את הדגימות תחת מים זורמים במשך שעה 1 ולחזור ל10% NBF ולהמשיך עם Faxitron (מערכת רנטגן משמשת כדי להבטיח את עצם decalcified) ומיקרו-CT הדמיה. </li></ol>

<ol>
	<li>Epstein, S. E., Fuchs, S., Zhou, Y. F., Baffour, R., Kornowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+interventions+for+enhancing+collateral+development+by+administration+of+growth+factors:+basic+principles,+early+results+and+potential+hazards.">Therapeutic interventions for enhancing collateral development by administration of growth factors: basic principles, early results and potential hazards.</a> Cardiovasc. Res. 49, 532-542 (2001).</li><li>Esaki, J., Marui, A., Tabata, Y., Komeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+release+systems+of+angiogenic+growth+factors+for+cardiovascular+diseases.">Controlled release systems of angiogenic growth factors for cardiovascular diseases.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 4, 635-649 (2007).</li><li>Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microcomputed+tomography+to+study+microvasculature+in+small+rodents.">The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, 1267-1279 (2002).</li><li>Golomb, B. A., Dang, T. T., Criqui, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+arterial+disease:+morbidity+and+mortality+implications.">Peripheral arterial disease: morbidity and mortality implications.</a> Circulation. 114, 688-699 (2006).</li><li>Hiatt, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+therapy+for+peripheral+arterial+disease+and+claudication.">Pharmacologic therapy for peripheral arterial disease and claudication.</a> J. Vasc. Surg. 36, 1283-1291 (2002).</li><li>Hirsch, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+arterial+disease+detection,+awareness,+and+treatment+in+primary+care.">Peripheral arterial disease detection, awareness, and treatment in primary care.</a> JAMA. 286, 1317-1324 (2001).</li><li>McDonald, D. M., Choyke, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+angiogenesis:+from+microscope+to+clinic.">Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic.</a> Nat. Med. 9, 713-725 (2003).</li><li>Hirsch, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACC/AHA+Guidelines+for+the+Management+of+Patients+with+Peripheral+Arterial+Disease+(lower+extremity,+renal,+mesenteric,+and+abdominal+aortic):+a+collaborative+report+from+the+American+Associations+for+Vascular+Surgery/Society+for+Vascular+Surgery,+Society+for+Cardiovascular+Angiography+and+Interventions,+Society+for+Vascular+Medicine+and+Biology,+Society+of+Interventional+Radiology,+and+the+ACC/AHA+Task+Force+on+Practice+Guidelines+(writing+committee+to+develop+guidelines+for+the+management+of+patients+with+peripheral+arterial+disease)--summary+of+recommendations.">ACC/AHA Guidelines for the Management of Patients with Peripheral Arterial Disease (lower extremity, renal, mesenteric, and abdominal aortic): a collaborative report from the American Associations for Vascular Surgery/Society for Vascular Surgery, Society for Cardiovascular Angiography and Interventions, Society for Vascular Medicine and Biology, Society of Interventional Radiology, and the ACC/AHA Task Force on Practice Guidelines (writing committee to develop guidelines for the management of patients with peripheral arterial disease)--summary of recommendations.</a> J. Vasc. Interv. Radiol. 17, 1383-1397 (2006).</li><li>Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+vessels+in+mouse+models+of+disease.">Molecular imaging of vessels in mouse models of disease.</a> Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).</li><li>Losordo, D. W., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+angiogenesis+and+vasculogenesis+for+ischemic+disease.+Part+I:+angiogenic+cytokines.">Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines.</a> Circulation. 109, 2487-2491 (2004).</li><li>Waters, R. E., Terjung, R. L., Peters, K. G., Annex, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+human+peripheral+arterial+occlusive+disease:+implications+for+investigation+of+therapeutic+agents.">Preclinical models of human peripheral arterial occlusive disease: implications for investigation of therapeutic agents.</a> J. Appl. Physiol. 97, 773-780 (2004).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד העניינים. נהלי כל החיה שנערך בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת טקסס למדעי בריאות המרכז ביוסטון.

כאן אנו מציגים שיטה להעברת תרופות / חומר אוסמוטי במודל עכבר של איסכמיה hindlimb. בנוסף, אנו מתארים טכניקת יציקה שביש לנו להשתמש Microfil לייצר שחזור 3D לניתוח של רשת כלי הדם. הרמה או חומרת איסכמיה משתנה בהתאם למקום שבי קשירה / הכריתה העורק מ...

מחלת עורקים היקפית (PAD) היא מחלה שגורמת לטרשת עורקת אספקת דם מספיקה ברגליים 4. זה משפיע 8-12,000,000 אמריקאים, וטיפולים רפואיים הנוכחיים מציעים רק הקלה מוגבלת 5,6. סוכנים טיפוליים חדשניים המשפרים את זרימת דם ברגליים לא רק לרסן את התקדמות מחלה, אלא גם לשפר את איכות החיים. ההיארעות של PAD היא גבוהה יותר בקרב אנשים מעל גיל 50 שנים, ולכן טיפול תרופתי מקומי הוא שיטת טיפול רצויה יותר, כי הכליות מופחתת ותפקוד כבד נראים לעתים קרובות בחולים מבוגרים יותר יכולים להקטין את חילוף החומרים של תרופה ולהגדיל את תופעות לוואי עם מנהל מערכתי. לפיכך, יצרנו מודל עכבר של PAD לבחון האם סוכנים המנוהלים באופן מקומי להקל איסכמיה hindlimb על ידי קידום אנגיוגנזה ושיפוץ כלי הדם. באופן ספציפי, השתמשנו במשאבה האוסמוטי צינתור, כדי לספק את הסוכן הטיפולי ברציפותשריר ירך איסכמי של עכברים. באמצעות מערכת האספקה ​​שלנו, הצלחנו לשמור על ריכוז אופטימלי של התרופה בסביבה המקומית; גישה זו מאפשרת לbioactivity התרופה המתאים, נמנעת תופעות לוואי מערכתיות אפשריות, ומתגברת על החסרון של הגישה סמים המקומי המוגבל קשורה למנהל מערכתי. בנוסף, כדי להעריך האם סוכנים המנוהלים באופן מקומי לקדם revascularization, השתמשנו ליהוק מתקדם ושיטות הדמיה בחדות גבוהה המאפשרות כימות של שינויים בmicrovasculature. באופן קולקטיבי, השילוב של מתודולוגיות בשימוש במאמר זה וידאו שימושי במחקרים פרה כדי לסייע בהבנת revascularization המושרה פרמקולוגית בחולי PAD 7-9.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td>Type: Tool</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Puritan sterile cotton swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-029-499</td>
			<td>Type: Tool</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Betadine (povidone-iodine)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-065534</td>
			<td>Type: Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>70% Alcohol pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9926371</td>
			<td>Type: Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td>Type: Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>6-0 prolene suture</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>8709</td>
			<td>Type: Tool</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>8-0 prolene suture</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>2775</td>
			<td>Type: Tool</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td>Type: Tool</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Osmotic pump</td>
			<td>ALZET</td>
			<td>1002</td>
			<td>Type: Tool, 14 day release</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vinyl catheter</td>
			<td>ALZET</td>
			<td>7760</td>
			<td>Type: Tool</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Heparinized saline (0.9%)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B0944</td>
			<td>Type: Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neutral buffered formalin</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>5705</td>
			<td>Type: Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microfil (silicone rubber contrast agent)</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-112</td>
			<td>Type Reagent, Microfil White</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cal-Ex II (formic acid solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CS511-1D</td>
			<td>Type: Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Buprenex</td>
			<td>CIII</td>
			<td>7571</td>
			<td>Type: Analgesic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bupivicaine</td>
			<td>Hospira, Inc.</td>
			<td>381</td>
			<td>Type: Analgesic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microimaging</td>
			<td>Zeiss Stemi 2000-C</td>
			<td>Type:Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Laser Doppler perfusion imager</td>
			<td>Perimed Inc.</td>
			<td>Periscan PIM3 </td>
			<td>Type:Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Micro-CT imaging system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Explore Locus SP </td>
			<td>Type:Equipment</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

osmotic drug delivery to ischemic hindlimbs and perfusion of vasculature with microfil for micro-computed tomography imaging

מחקר קליני במודלים של בעלי חיים של מחלת עורקים היקפית ממלא תפקיד חיוני בבדיקת יעילותם של סוכנים טיפוליים שנועדו לעורר את זרימת דם. בחירת שיטת משלוח עבור הסוכנים האלה חשובה כי התוואי של ממשל עמוק משפיע על הפעילות ביולוגית והיעילות של אלה 1,2 הסוכנים. במאמר זה, אנו מדגימים כיצד לנהל את החומר באופן מקומי על ידי hindlimbs איסכמי באמצעות משאבה האוסמוטי צינתור. משאבה זו יכולה לספק נפח קבוע של תמיסה מימית ברציפות במשך תקופה מוקצב של זמן. כמו כן, אנו מציגים מודל העכבר שלנו של איסכמיה hindlimb חד צדדית הנגרם על ידי קשירה של עורק הירך המשותף הפרוקסימלי למקורו של femoris profunda ועורקים epigastrica בhindlimb השמאל. לבסוף, אנו מתארים בcannulation vivo וקשירה של אב העורקים והטפטוף של כלי דם hindlimb infrarenal בטן עם Microfil, סוכן ליהוק radiopaque סיליקון. Microfil יכול perfuse ולמלא את המיטה כולה כלי הדם (עורקי ורידים), ובגלל שיש לנו ligated צינור כלי הדם העיקרי ליציאה, ניתן להיעזר בסוכן בכלי הדם להדמית vivo לשעבר עתיד עם השימוש בדגימה קטנה מיקרו-CT 3 .

האנימציה מדגימה את החדרת המשאבה האוסמוטי וניתוח איסכמיה hindlimb המפורט בפרוטוקול. איור 1 מציג תמונות לייזר דופלר של זלוף של hindlimb, המאשר איסכמיה. אחרי ליהוק כלי דם עם Microfil, תמונת 3D מיקרו CT של רשת כלי הדם מראה כי Microfil יכול למלא ביעילות את כלי (איור 2 א), אלא ?...

Watch this Scientific Journal Video about Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging at JoVE.com

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

אנחנו מראים כאן<em&gt; In vivo</em&gt; כניסה של משאבה האוסמוטי עבור משלוח סמים מקומי מתמיד ויצירת איסכמיה hindlimb במודל של עכברים. יתר על כן, כלי דם hindlimb הוא perfused עם Microfil, סוכן radiopaque סיליקון, כדי להתכונן למייקרו טומוגרפיה ממוחשבת (CT מיקרו) הדמיה.

משלוח סמים האוסמוטי לhindlimbs איסכמי וטפטוף של כלי דם עם Microfil למייקרו-טומוגרפיה ממוחשבת הדמיה

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

osmotic-drug-delivery-to-ischemic-hindlimbs-perfusion-vasculature

Research

JoVE Journal

Medicine

12.2K Views.  The Texas Heart Institute at St. Luke's Episcopal Hospital. אנחנו מראים כאן In vivo כניסה של משאבה האוסמוטי עבור משלוח סמים מקומי מתמיד ויצירת איסכמיה hindlimb במודל של עכברים. יתר על כן, כלי דם hindlimb הוא perfused עם Microfil, סוכן radiopaque סיליקון, כדי להתכונן למייקרו טומוגרפיה ממוחשבת (CT מיקרו) הדמיה.

Video: Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for imaging vasculature, few are able to visualize the vascular network as a whole while extending to a resolution that includes the smaller vessels1,2. Additionally, many vascular casting techniques destroy the surrounding tissue, preventing further analysis of the sample3-5. One method which circumvents these issues is micro-Computed Tomography (&mu;CT). &mu;CT imaging can scan at resolutions &lt;10 microns, is capable of producing 3D reconstructions of the vascular network, and leaves the tissue intact for subsequent analysis (e.g., histology and morphometry)6-11. However, imaging vessels by ex vivo &mu;CT methods requires that the vessels be filled with a radiopaque compound. As such, the accurate representation of vasculature produced by &mu;CT imaging is contingent upon reliable and complete filling of the vessels. In this protocol, we describe a technique for filling mouse coronary vessels in preparation for &mu;CT imaging.
Two predominate techniques exist for filling the coronary vasculature: in vivo via cannulation and retrograde perfusion of the aorta (or a branch off the aortic arch) 12-14, or ex vivo via a Langendorff perfusion system 15-17. Here we describe an in vivo aortic cannulation method which has been specifically designed to ensure filling of all vessels. We use a low viscosity radiopaque compound called Microfil which can perfuse through the smallest vessels to fill all the capillaries, as well as both the arterial and venous sides of the vascular network. Vessels are perfused with buffer using a pressurized perfusion system, and then filled with Microfil. To ensure that Microfil fills the small higher resistance vessels, we ligate the large branches emanating from the aorta, which diverts the Microfil into the coronaries. Once filling is complete, to prevent the elastic nature of cardiac tissue from squeezing Microfil out of some vessels, we ligate accessible major vascular exit points immediately after filling. Therefore, our technique is optimized for complete filling and maximum retention of the filling agent, enabling visualization of the complete coronary vascular network &#x2013; arteries, capillaries, and veins alike.

Visualization of the coronary vessels is critical to advancing our understanding of cardiovascular diseases. Here we describe a method for perfusing murine coronary vasculature with a radiopaque silicone rubber (Microfil), in preparation for micro-Computed Tomography (&mu;CT) imaging.

זלוף מדרדר ומילוי בכלי הדם הכליליים עכבר כהכנה מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת והדמיה

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft tissue filler as it is readily available, easily obtained, inexpensive, and inherently biocompatible.1 However, despite its burgeoning popularity, fat grafting is hampered by unpredictable results and variable graft survival, with published retention rates ranging anywhere from 10-80%. 1-3
To facilitate investigations on fat grafting, we have therefore developed an animal model that allows for real-time analysis of injected fat volume retention. Briefly, a small cut is made in the scalp of a CD-1 nude mouse and 200-400 &#181;l&#160;of processed lipoaspirate is placed over the skull. The scalp is chosen as the recipient site because of its absence of native subcutaneous fat, and because of the excellent background contrast provided by the calvarium, which aids in the analysis process. Micro-computed tomography (micro-CT) is used to scan the graft at baseline and every two weeks thereafter. The CT images are reconstructed, and an imaging software is used to quantify graft volumes.
Traditionally, techniques to assess fat graft volume have necessitated euthanizing the study animal to provide just a single assessment of graft weight and volume by physical measurement ex vivo. Biochemical and histological comparisons have likewise required the study animal to be euthanized. This described imaging technique offers the advantage of visualizing and objectively quantifying volume at multiple time points after initial grafting without having to sacrifice the study animal. The technique is limited by the size of the graft able to be injected as larger grafts risk skin and fat necrosis. This method has utility for all studies evaluating fat graft viability and volume retention. It is particularly well-suited to providing a visual representation of fat grafts and following changes in volume over time.

Fat grafting is an essential technique for reconstructing soft tissue deficits. However, it remains an unpredictable procedure characterized by variable graft survival. Our goal was to devise a mouse model that utilizes a novel imaging method to compare volume retention between differing techniques of fat graft preparation and delivery.

הערכה של יכולת הקיום של הזרקת שומן האנושי בעכברי עירום עם מיקרו-טומוגרפיה ממוחשבת

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse models of lung cancer are being used to study the mechanism of cancer development and to experiment with various therapeutic strategies. However, the absence of a real-time technique to identify the development of tumor nodules in mice lungs and to monitor the changes in their size in response to various experimental and therapeutic interventions hampers the ability to obtain an accurate description of the course of the disease and its timely response to treatments. In this study, a method using a micro-computed tomography (CT) scanner for the detection of the development of lung tumors in a mouse model of lung adenocarcinoma is described. Next, we show that monthly follow-up with micro-CT can identify dynamic changes in the lung tumor, such as the appearance of additional nodules, increase in the size of previously detected nodules, and decrease in the size or complete resolution of nodules in response to treatment. Finally, the accuracy of this real-time assessment method was confirmed with end-point histological quantification. This technique paves the way for planning and conducting more complex experiments on lung cancer animal models, and it enables us to better understand the mechanisms of carcinogenesis and the effects of different treatment modalities while saving time and resources.

We describe a method for the detection of tumor nodule development in the lungs of an adenocarcinoma mouse model using micro-computed tomography and its use for monitoring changes in nodule size over time and in response to treatment. The accuracy of the assessment was confirmed with end-point histological quantification.

באמצעות טומוגרפיה מיקרו שחושבת הערכת התפתחות גידול ומעקב של תגובה לטיפול במודל עכברי של סרטן הריאות

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

Intraluminal Drug Delivery to the Mouse Arteriovenous Fistula Endothelium

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The simple murine AVF model was combined with intraluminal administration of drug solution to the venous endothelium at the same time as fistula creation. Technical aspects of this model are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The infra-renal aorta and IVC are dissected for clamping. After proximal and distal clamping, the puncture site is exposed and a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta and into the IVC. Immediately after the puncture, a reporter gene-expressing viral vector was infused in the IVC via the same needle, followed by 15 min of incubation. The intraluminal administration method enabled more robust viral gene delivery to the venous endothelium compared to administration by the external route. This novel method of delivery will facilitate studies that explore the role of the endothelium in AVF maturation and enable intraluminal drug delivery at the time of surgical operation.

After puncturing the aorta through the inferior vena cava (IVC) to create an aorto-caval fistula in the mouse, solution containing a drug is infused into the IVC via the same needle, followed by incubation. This method enables more robust drug delivery to the venous endothelium compared to the external route.

החדרת תרופות Intraluminal אל האנדותל מורסה arteriovenous עכבר

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

משולב האינפרה-אדום הקרוב הדמיה פלורסנט וטומוגרפיה-מחושב מיקרו ישירות חזותי מוחין Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ischemia/reperfusion (I/R) injury with myriad negative consequences. Potential I/R injury in marginal organs destined for liver transplantation contributes to the current donor shortage secondary to a decreased organ utilization rate. A significant need exists to explore hepatic I/R injury in order to mediate its impact on graft function in transplantation. Rat liver hilar clamp models are used to investigate the impact of different molecules on hepatic I/R injury. Depending on the model, these molecules have been delivered using inhalation, epidural infusion, intraperitoneal injection, intravenous administration or injection into the peripheral superior mesenteric vein. A rat liver hilar clamp model has been developed for use in studying the impact of pharmacologic molecules in ameliorating I/R injury. The described model for rat liver hilar clamp includes direct cannulation of the portal supply to the ischemic hepatic segment via a side branch of the portal vein, allowing for direct segmental hepatic delivery. Our approach is to induce ischemia in the left lateral and median lobes for 60 min, during which time the substance under study is infused. In this case, pegylated-superoxide dismutase (PEG-SOD), a free radical scavenger, is infused directly into the ischemic segment. This series of experiments demonstrates that infusion of PEG-SOD is protective against hepatic I/R injury. Advantages of this approach include direct injection of the molecule into the ischemic segment with consequent decrease in volume of distribution and reduction in systemic side effects.

A unique rat liver hilar clamp model was developed for studying the impact of pharmacologic molecules in ameliorating ischemia-reperfusion injury. This model includes direct cannulation of the portal supply to the ischemic liver segment via a branch of the portal vein, allowing for direct hepatic delivery.

שיטה של ​​המגזרים הישירים Intra-כבדית משלוח באמצעות מודל קלאמפ עכברוש הכבד hilar

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

שיטת אופטימיזציה LC-MS/MS לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות קליניות של Ivacaftor, שלה מטבוליטים העיקריים Lumacaftor של נוזלים ביולוגיים של חולי סיסטיק פיברוזיס

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional properties of diseased tissue is critical to determine their interactions with arrhythmic behavior. Microscale tissue remodeling, below the clinical resolution, is emerging as an important source of lethal arrhythmia, with high prevalence in young adults. Challenges remain in obtaining high imaging contrast at sufficient microscale resolution for preclinical models, such as large mammalian whole hearts. Moreover, tissue composition-selective contrast enhancement for three-dimensional high-resolution imaging is still lacking. Non-destructive imaging using micro-computed tomography shows promise for high-resolution imaging. The objective was to alleviate sufferance from X-ray over attenuation in large biological samples. Hearts were extracted from healthy pigs (N = 2), and sheep (N = 2) with either induced chronic myocardial infarction and fibrotic scar formation or induced chronic atrial fibrillation. Excised hearts were perfused with: a saline solution supplemented with a calcium ion quenching agent and a vasodilator, ethanol in serial dehydration, and hexamethyldisilizane under vacuum. The latter reinforced the heart structure during air-drying for 1 week. Collagen-dominant tissue was selectively bound by an X-ray contrast-enhancing agent, phosphomolybdic acid. Tissue conformation was stable in air, permitting long-duration microcomputed tomography acquisitions to obtain high-resolution (isotropic 20.7 &#181;m) images. Optimal contrast agent loading by diffusion showed selective contrast enhancement of the epithelial layer and sub-endocardial Purkinje fibers in healthy pig ventricles. Atrial fibrillation (AF) hearts showed enhanced contrast accumulation in the posterior walls and appendages of the atria, attributed to greater collagen content. Myocardial infarction hearts showed increased contrast selectively in regions of cardiac fibrosis, which enabled the identification of interweaving surviving myocardial muscle fibers. Contrast-enhanced air-dried tissue preparations enabled microscale imaging of the intact large mammalian heart and selective contrast enhancement of underlying disease constituents.

Here, we present a protocol to obtain high resolution micro computed tomography images of healthy and pathological large mammalian whole hearts with collagen-selective contrast enhancement.

טכניקות הכנת רקמות להדמיית טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו משופרת ניגודיות של מודלים לבביים של יונקים גדולים עם מחלות כרוניות

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the three-dimensional (3D) architecture of the organ at the whole-organ level. Liver architecture is characterized by multiple branching lumenized structures, which can be filled with resin, including vascular and biliary trees, establishing a highly stereotyped pattern in the otherwise hepatocyte-rich parenchyma. This protocol describes the pipeline for performing double resin casting micro-computed tomography, or &#34;DUCT&#34;. DUCT entails injecting the portal vein and common bile duct with two different radiopaque synthetic resins, followed by tissue fixation. Quality control by clearing one lobe, or the entire liver, with an optical clearing agent, allows for pre-screening of suitably injected samples. In the second part of the DUCT pipeline, a lobe or the whole liver can be used for micro-computed tomography (microCT) scanning, (semi-)automated segmentation, and 3D rendering of the portal venous and biliary networks. MicroCT results in 3D coordinate data for the two resins allowing for qualitative as well as quantitative analysis of the two systems and their spatial relationship. DUCT can be applied to postnatal and adult mouse liver and can be further extended to other tubular networks, for example, vascular networks and airways in the lungs.

Double resin casting micro-computed tomography, or DUCT, enables visualization, digitalization, and segmentation of two tubular systems simultaneously to facilitate 3D analysis of organ architecture. DUCT combines ex vivo injection of two radiopaque resins followed by micro-computed tomography scanning and segmentation of the tomographic data.