עבודה זו נתמכה על ידי חדשני הצעיר biotechnologist פרס BT/BI/12/040/2005 ומענק BT/PR13289/BRB/10/745/2009 מהמחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו וקרנות ליבה של המרכז לDNA טביעת אצבעות ואבחון, היידראבאד. MNR וGB הם המקבלים זוטרים ובכירות מלגות מחקר של מועצת המחקר מדעי ותעשייתי למרדף האחר תואר PhD מאוניברסיטת Manipal. SB הוא הנמען של זוטר ובכירה למחקר מלגה מהמחלקה לביוטכנולוגיה לקראת המרדף האחר תואר PhD מאוניברסיטת Manipal.

מומלץ לבצע ג ניסויי זיהום glabrata במעבדה עם בלימת בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL-2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת monolayer מקרופאג THP-1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת ג השעיה תא glabrata. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהום של מקרופאגים THP-1 עם ג תאי glabrata. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידה של קצב phagocytosis ושכפול תאיים באמצעות assay יחידת המושבה להרכיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניטור של שכפול תאיים באמצעות מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה. </li></ol> 1. הכנת THP-1 Macrophage חד שכבתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> THP-1 הוא קו סלולרי monocytic אדם נגזר מהדם ההיקפי של ילד זכר 1 בן סובל מלוקמיה חריפה monocytic 14. THP-1, שורת תאי השעיה, נשמר באופן שיגרתי על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 humidified במדיום תרבות RPMI-1640 תוספת 10% FBS (בסרום שור עוברי). טיפול עם phorbol 12 myristate 13 יצטטו (PMA, אסתר phorbol) תוצאות בבידול מסוף של תאי monocytic THP-1 למקרופאגים. חשוב מכך, טיפול PMA אינו משפיע על כדאיות תא ותאים מובחנים לא להתחלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע כ 1.5 x 10 6 מונוציטים THP-1 ב100 תרבות מנות מ&quot;מ RPMI-1640 בינוני מלא (מדיום RPMI-1640 תוספת סרום 10%, 2 מ&quot;מ גלוטמין ו 1x אנטיביוטיקה; 10 מיליליטר / צלחת) ולתת לתאים לגדול ב 37 ° C ב 5% CO 2 למשך 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שTHP-1 תאים הגיעו צפיפות של 8 x 10 5 תאים / מיליליטר, להעביר את המנה התרבות לזרימה למינרית תרבית תאים ובעדינות לערבל אותו לresuspend תאים התיישבו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה ההשעיה התא החוצה, מקום לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 1,000 סל&quot;ד (130 XG) במשך 4 דקות. בטל supernatant ו להשעות תא גלולה THP-1 ב 5 מיליליטר בינוני טרי, prewarmed, RPMI-1640 מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים עם hemocytometer ולדלל את celהשעיה ליטר לצפיפות סופית של 10 6 תאים / מיליליטר עם מדיום להשלים RPMI-1640 prewarmed </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של 160 מניית מ&quot;מ PMA (פתרון 13 יצטטו 12 Myristate phorbol הערוך sulfoxide דימתיל) ל10 מיליליטר השעיה תא THP-1 (ריכוז סופי 16 ננומטר) ומערבבים היטב. לוותר על ההשעיה תא 1 מיליליטר לבאר כל צלחת תרבית רקמת 24 היטב דגירה צלחת בחממה נשמרה על 37 ° C עם 5% CO 2 למשך שעות 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני ישן, להוסיף 1 מיליליטר prewarmed RPMI-1640 בינוני מלאה ומאפשר לתאים להתאושש במשך שעות 12 על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ הפוכה כדי לוודא שתאי monocytic THP-1 הסגלגל בהשעיה כבר מובחנים למקרופאגים שטוחים, ציר בצורה והחסידה. תאים מובחנים אלה הם עכשיו מוכנים לנהל ג מחקרי זיהום glabrata. </li></ol> 2. הכנת ג glabrata &amp; #תרחיף תא; 160 Bg2 זן ג glabrata פראי מהסוג ישמש להדביק THP-1 מקרופאגים. ג תאי glabrata נמצאים באופן שגרתי בתרבית YPD הנוזלי (תמצית שמרים (1%)-peptone (2%), דקסטרוז (2%)) בינוני. בינוני YPD מוצק הוא הוכן על ידי הוספה אגר 2% לפני מעוקר בינוני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את התרבות של ג glabrata, לבחור מושבה את אחת מהצלחת אגר עם לולאה סטריליים, חד פעמים ולחסן ל10 מיליליטר מדיום נוזלי YPD ו דגירה של 14-16 שעה עם הרעד (200 סל&quot;ד) ב30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תרבות זו (1 מיליליטר) בשעה 4,000 סל&quot;ד (1,800 XG) במשך 5 דקות בmicrocentrifuge בראש טבלה, לשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS (פוספט שנאגרו מלוח, pH 7.4) סטרילי ולהשעות את התא גלולה ב 1 מיליליטר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד OD 600 של ג ההשעיה glabrata תא ולדלל עם נפח מתאים של PBS סטרילי כדי לקבל צפיפות של 2 x 10 מיליליטר / 6 תאים (OD 600= 0.1). לחלופין, צפיפות התאים הרצויה יכולה להיות מושגת על ידי ספירת תאי שמרים באמצעות hemocytometer. </li></ol> 3. זיהום של המקרופאגים THP-1 עם ג תאי glabrata <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 ג μl השעיה תא glabrata לTHP-1 מקרופאגים (10 6 תאי זרע לכל טוב של צלחת תרבות 24 גם) כדי להשיג משרד הפנים (ריבוי של זיהום) של 0.1 דגירה צלחת ב 37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע שמרי ספירות קיימא, לדלל 50 ג μl תא השעיה פי 100 glabrata בPBS סטרילי וצלחת על מצע מוצק YPD 100 μl. דגירה צלחות ב30 מעלות צלזיוס ולספור ידני את מספר מושבות שמרים המופיעות אחרי 1-2 ימים. מספרים אלה יהיו, מכאן ואילך, יופנו כג 0 שעות glabrata CFUs (מושבה להרכיב יחידות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר coculturing 2 שעות של תאי THP-1 עם ג תאי glabrata, תרבות בינונית שנזרקו על ידי היפוך צלחת תרבית רקמת 24 גם iמאגר na ולשטוף בעדינות שלוש פעמים עם PBS סטרילי prewarmed להסיר ג תאי nonphagocytosed תאי glabrata. שטיפות עדינות עם PBS הן חיוניים כדי להשיג את ההסרה של כל השמרים תאיים שלמה בלי לגרום נזק לmonolayer מקרופאג THP-1. </li></ol> 4. מדידה של Phagocytosis דרג ותאי שכפול באמצעות מושבה להרכיב יחידת Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse ג glabrata נגוע THP-1 מקרופאגים ב 1 מיליליטר סטרילי H 2 O למשך 2 דקות, לגרד בעדינות כדי להסיר את פסולת מקרופאג מהבאר ולאסוף lysate תא בצינור microcentrifuge. אימות מיקרוסקופית של תמוגה מקרופאג המוחלטת היא מרכזית להתאוששות של כל השמרים הפנימו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול פי 100 של lysate ב PBS סטרילי, צלחת על מצע מוצק YPD 100 μl ודגירת צלחות ב30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 1-2 ימים, לספור ידני את מספר ג glabrata מושבות ap כיpeared על מדיום YPD, להכפיל בגורם לדילול (2 CFUs שעה) ולחשב את שיעור phagocytosis המתייחס לאחוזים של ג תאי glabrata המעובדים על ידי THP-1 מקרופאגים לאחר coincubation שעה 2 תוך שימוש בנוסחה הבאה. phagocytosis% = [(CFUs ב2 h) / (CFUs ב 0 h)] X 100 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את קצב השכפול תאיים של ג תאי glabrata בTHP-1 מקרופאגים, לאסוף שמרים תאיים בזמן שונה נקודות לפרסם כלומר זיהום. 4, 6, 8, 10, 12, ו24 שעות, על ידי חזרה על שלבי 3.3-4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב הישרדות / שכפול של פי ג תאי glabrata בTHP-1 מקרופאגים על ידי חלוקת סך CFUs בכל נקודת זמן נתון עם אלה בשעה 2 (שמרי phagocytosed). </li></ol> 5. ניטור של תאיים שכפול באמצעות Confocal אסאה סריקה מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע השלבים המתוארים בסעיף 1, זרע 5 x 10 5 תאים THP-1 שטופל ב-PMA בכל טוב של שתי שקופיות קאמריות ארבעה היטב ולדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 למשך שעות 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני ישן עם מדיום מלא prewarmed RPMI-1640 ולאפשר לתאים להתאושש מטיפול PMA עבור שעות 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) מתויג ג ההשעיה תא glabrata כפי שתואר בסעיף 2 ולהדביק לTHP-1 מקרופאגים למשרד הפנים של 1. אם ג glabrata זנים להביע GFP אינם זמינים, תאי שמרים שכותרתו עם FITC (isothiocyanate והעמסת) ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר המתרחשים בתחילת לפרסם דהינו זיהום. שיעור phagocytosis והתבגרות phagolysosomal בשעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות במשך שעה 2 ב37 ° C עם 5% CO 2, להפוך אותם בקפידה כדי לבטל בינוני ולשטוף 3x עם סטרילי, prewarmed PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl prewarmed RPMI-1640 Medi מלאאממ לכל תא של שקופית אחת ודגירה אותו על 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 22 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתקן 2 ג hr מקרופאגים THP-1-נגועים glabrata, להוסיף 500 μl של פורמלדהיד .3.7% (שהוכן PBS) לכל תא של שקופית אחרת ודגירה אותו בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף להחליק שלוש פעמים עם PBS, להוסיף 500 μl Triton-X (0.7%), ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x שקופיות לשטוף עם PBS, להסיר קאמרי משקופית התרבות ואוויר לייבש אותו ל3-5 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בזהירות coverslip באמצעות מדיום Vectashield הרכבה המכיל DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole) בשקופית הימנעות היווצרות בועה. להסיר בעדינות את הנוזל העודף עם Kimwipe ולאטום קצות coverslip עם לכה לציפורניים. שקופיות חנות בחושך על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.4 ו5.6-5.9 לעבד THP-1 תאים 24 הודעה hr זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תמונה באמצעות confo סריקת לייזרמיקרוסקופ קאל (אובייקטיבי 60x נפט טבילה, עירור ב 405 ננומטר ו488 ננומטר לDAPI וכתם ה-GFP, בהתאמה). </li></ol>

<ol>
	<li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+Invasive+Candidiasis:+a+Persistent+Public+Health+Problem.">Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem.</a> Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).</li><li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+from+the+ARTEMIS+DISK+global+antifungal+surveillance+study.">Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study.</a> J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).</li><li>Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+opportunistic+fungal+infections+in+India.">Overview of opportunistic fungal infections in India.</a> Jpn. J. Med. Mycol. 49 (3), 165-172 (2008).</li><li>Kaur, R., Domergue, R., Zupancic, M. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+by+any+other+name:+Candida+glabrata+and+its+interaction+with+the+host.">A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8 (4), 378-384 (2005).</li><li>Silva, S., Negri, M., Henriques, M., Oliveira, R., Williams, D. W., Azeredo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata,+Candida+parapsilosis+and+Candida+tropicalis:+biology,+epidemiology,+pathogenicity+and+antifungal+resistance.">Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance.</a> FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).</li><li>Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+glycosylphosphatidylinositol-linked+aspartyl+proteases+is+required+for+virulence+of+Candida+glabrata.">A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), 7628-7633 (2007).</li><li>Seider, K., Brunke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation.">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187 (6), 3072-3086 (2011).</li><li>Rai, M. N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+Candida+glabrata-macrophage+interaction.">Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction.</a> PLoS Pathog. 8 (8), e1002863 (2012).</li><li>Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Sch&#252;ller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+supports+Candida+glabrata+survival+during+phagocytosis.">Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis.</a> Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).</li><li>Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+THP-1+Cells:+an+attractive+model+for+the+assessment+of+intracellular+growth+rates+of+Mycobacterium+tuberculosis+isolates.">Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates.</a> Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).</li><li>Murayama, T., Ohara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Cytomegalovirus+induces+Interleukin-8+production+by+a+human+monocytic+cell+line,+THP-1,+through+acting+concurrently+on+AP-1-+and+NF-kB-binding+sites+of+the+Interleukin-8+gene.">Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene.</a> J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).</li><li>Gross, O., Poeck, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syk+kinase+signalling+couples+to+the+Nlrp3+inflammasome+for+anti-fungal+host+defence.">Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence.</a> Nature. 459, 433-436 (2009).</li><li>Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+leukemia+cell+line,+THP-1:+a+multifacetted+model+for+the+study+of+monocyte-macrophage+differentiation.">The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation.</a> Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).</li><li>Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+maturation+in+cultured+human+monocytic+leukemia+cells+by+a+phorbol+diester.">Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester.</a> Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).</li><li>Casta&#241;o, I., Kaur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7-based+genome-wide+random+insertional+mutagenesis+of+Candida+glabrata.">Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata.</a> Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מערכת חיסון מולדת משחקת תפקיד חשוב בשליטה על זיהומים פטרייתיים אופורטוניסטיים. המקרופאגים תורמים להגנה נגד פטריות על ידי בליעה והרס של הפתוגן פטרייתי. לפיכך, הבהרה של גורמים הנדרשים להישרדות ו / או מנטרל את הפונקציות מיקרוביאלית של מקרופאגים תקדם את ההבנה של אסטרטג?...

מיני קנדידה הם הגורם המוביל לזיהומים פטרייתיים פולשניים מסכנות חיים בחולי מדוכאי חיסון 1. קנדידה glabrata, הפתוגן nosocomial מתעוררים, הוא שני או שלישיים מבודד בתדירות הגבוהה ביותר מיני קנדידה מחולי טיפול נמרץ בהתאם למיקום הגיאוגרפי 1-3. פילוגנטית, ג glabrata, שמרי ניצנים הפלואידים, קשור באופן הדוק יותר לSaccharomyces cerevisiae מאשר spp קנדידה פתוגניים אינם שמרי מודל פתוגניים. כולל ג אלביקנס 4. עולה בקנה אחד עם זו, ג glabrata חסר כמה תכונות ארסיות פטרייתי מרכזיות, כולל הזדווגות, פעילות מפרקי חלבונים מופרשת ופלסטיות המורפולוגית 4-5. למרות שג glabrata אינו טופס העובש, הוא יכול לשרוד ולשכפל במקרופאגים העכבריים והאנושיים 6-8 טוען כי היא פיתחה מנגנוני פתוגנזה ייחודיים. מידע מוגבל זמין על האסטרטגיות שג glabrata מעסיק לשרוד סביבת מקרופאג תאית תזונתית ירודה ולנטרל חמצוני ותגובות מארח nonoxidative רכובים על ידי תאים חיסוניים מארח 5. מערכת מודל מקרופאג רלוונטי היא תנאי הכרחי כדי להתוות את האינטראקציה של ג glabrata עם תאי phagocytic מארח באמצעות גישות הגנומי וproteomic פונקציונליים. תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) ומקרופאגים עצם שמקורם במח (BMDMs) ממקור אנושי ועכברי, בהתאמה, קודם לכן שימשו ללמוד את האינטראקציה של ג glabrata עם תאים חיסוניים מארח 7,9. עם זאת, קושי בהשגת PBMCs וBMDMs, תוחלת שלהם מוגבלת החיים ווריאציה מקומית בין תורמי יונקים שונים להגביל את הניצול של תאים אלה מערכות מודל צדדי כ. כאן, אנו מתארים שיטה להקמתה של מערכת במבחנה ללמוד intracellular התנהגות של ג תאי glabrata במקרופאגים נגזרו משורת תאי monocytic אדם THP-1. המטרה הכללית של פרוטוקול זה הייתה לחוקק מערכת מודל פשוטה, זולה, מהירה, ושחזור תרבית תאים שניתן להשפיע בקלות ללמוד היבטים שונים של האינטראקציה הפתוגן מארח פטרייתי. THP-1 תאים ששמשו בעבר לפענח את התגובה החיסונית המארחת נגד מגוון רחב של פתוגנים, כולל חיידקים, וירוסים, פטריות ו10-12. תאי THP-1 monocytic קלים לשמור ויכולים להיות מובחן, על טיפול אסתר phorbol, למקרופאגים אשר לחקות מקרופאגים נגזרות מונוציטים של אדם ומבטאים את סמני מקרופאג מתאימים 13. היתרונות העיקריים של מערכת מודל מקרופאג THP-1 הם קלות השימוש וחוסר דרישת ציוד מתוחכמת. הפרוטוקול המובא כאן הוא להתאמה בקלות ללמוד את האינטראקציה של פתוגנים פטרייתי אדם אחרים עם הוזt תאים חיסוניים. ההליך הנוכחי גם יכול להיות מועסק על מנת לזהות גורמים ארסי לפתוגן של עניין באמצעות מסכי מוטציה תפוקה גבוהה. הוכחה של רעיון זה באה לידי ביטוי על ידי השימוש המוצלח של מערכת מודל התרבות THP-1 לזהות סט של 56 גנים הנדרשים להישרדותו של ג glabrata במקרופאגים אדם 8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:40px;width:163px;">THP-1</td>
			<td style="width:105px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:85px;">TIB 202</td>
			<td style="width:243px;">Human acute monocytic leukemia cell line</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:105px;">Hyclone</td>
			<td style="width:85px;">SH30096.01</td>
			<td style="width:243px;">For maintaining THP-1 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td style="width:105px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:85px;">P 8139</td>
			<td style="width:243px;">Caution: Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">YPD&#160;</td>
			<td style="width:105px;">BD-Difco</td>
			<td style="width:85px;">242710</td>
			<td style="width:243px;">For growing Candida glabrata cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:105px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:85px;">F8775</td>
			<td style="width:243px;">For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,&#160; pH 7.4) for washes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Saline-sodium citrate (SSC)&#160;</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Prehybridization buffer</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">Buffer (50% formamide, 5x Denhardt&#8217;s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">VECTASHIELD mounting medium</td>
			<td style="width:105px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:85px;">H-1200</td>
			<td style="width:243px;">For mounting slides for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">32P-labeled &#945;-dCTP</td>
			<td style="width:105px;">JONAKI-BARC</td>
			<td style="width:85px;">LCP-102</td>
			<td style="width:243px;">For radiolabeling of signature tags</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">100 mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:105px;">Corning</td>
			<td style="width:85px;">430167</td>
			<td style="width:243px;">To culture THP-1 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">24-well tissue culture plate</td>
			<td style="width:105px;">Corning</td>
			<td style="width:85px;">3527</td>
			<td style="width:243px;">To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">4-chamber tissue culture-treated glass slide</td>
			<td style="width:105px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:85px;">REF354104</td>
			<td style="width:243px;">To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:105px;">Rohem India</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">For enumeration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Table top microcentrifuge</td>
			<td style="width:105px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:85px;">Microfuge 18</td>
			<td style="width:243px;">For spinning down cells in microtubes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Table top centrifuge</td>
			<td style="width:105px;">Remi</td>
			<td style="width:85px;">R-8C</td>
			<td style="width:243px;">For spinning down cells in 15 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:105px;">Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:85px;">Ultraspec 10</td>
			<td style="width:243px;">To monitor absorbance of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Plate incubator</td>
			<td style="width:105px;">Labtech</td>
			<td style="width:85px;">Refrigerated</td>
			<td style="width:243px;">To grow C. glabrata cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Shaker incubator</td>
			<td style="width:105px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:85px;">Innova 43</td>
			<td style="width:243px;">To grow C. glabrata cells</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Water jacketed CO2&#160; incubator</td>
			<td style="width:105px;">Thermo Electron Corporation</td>
			<td style="width:85px;">Forma series 2</td>
			<td style="width:243px;">To culture THP-1 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:105px;">Carl Ziess</td>
			<td style="width:85px;">Ziess LSM 510 meta&#160;</td>
			<td style="width:243px;">To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td style="width:85px;">CKX 41</td>
			<td style="width:243px;">To observe C. glabrata and THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">PCR machine</td>
			<td style="width:105px;">BioRad&#160;</td>
			<td style="width:85px;">DNA Engine</td>
			<td style="width:243px;">To amplify unique tags from input and output genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Hybridization oven</td>
			<td style="width:105px;">Labnet</td>
			<td style="width:85px;">Problot 12S</td>
			<td style="width:243px;">For hybridization&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PhosphorImager</td>
			<td style="width:105px;">Fujifilm</td>
			<td style="width:85px;">FLA-9000</td>
			<td style="width:243px;">For scanning hybridized membranes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:85px;">Thermomixer Comfort</td>
			<td style="width:243px;">For denaturation of radiolabeled signature tags</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:163px;">Gel documentation unit</td>
			<td style="width:105px;">Alphainnontech</td>
			<td style="width:85px;">Alphaimager</td>
			<td style="width:243px;">To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an in vitro system to study intracellular behavior of candida glabrata in human thp-1 macrophages

מערכת מודל תרבית תאים, אם לחקות קרוב של תנאים סביבתיים מארח, יכול לשמש כאלטרנטיבה זולה, לשחזור ובקלות למניפולציה למערכות מודל חיה ללימוד צעד ספציפי של זיהום חיידקים פתוגנים. שורת תאי monocytic אדם THP-1, אשר, על טיפול אסתר phorbol, הוא מובחן למקרופאגים, כבר בעבר נעשתה שימוש כדי ללמוד אסטרטגיות ארסיות רבים פתוגנים תאיים כגון שחפת Mycobacterium. כאן, אנו דנים בפרוטוקול לחוקק במבחנה מודל תרבית תאים מערכת באמצעות THP-1 מקרופאגים להתוות את האינטראקציה של שמרי הפתוגן אנושי אופורטוניסטי קנדידה glabrata עם תאי phagocytic המארח. מערכת מודל זה היא פשוטה, מהיר, נוח למסכי מוטציה תפוקה גבוהה, ואינה דורשת ציוד מתוחכם. ניסוי זיהום מקרופאג טיפוסי THP-1 לוקח כ 24 שעות עם 24-48 שעות נוספות כדי לאפשר תאיים התאושששמרים לגדול על המצע עשיר למושבה להרכיב ניתוח כדאיות מבוסס יחידה. כמו במבחנה מערכות מודל אחרות, מגבלה אפשרית של גישה זו היא קושי בחיוץ התוצאות שהתקבלו למעגלי תא חיסון מורכבים ביותר קיימים במארח האנושי. אולם, למרות זאת, בפרוטוקול הנוכחי הוא מאוד שימושי כדי להבהיר את האסטרטגיות שהפתוגן פטרייתי עשוי להעסיק להתחמק / לנטרל תגובת מיקרוביאלית ולשרוד, להתאים, ולהתרבות בסביבה התזונתית ירודה של תאים חיסוניים מארחים.

זיהום ניתוחים של מקרופאגים THP-1 שטופל ב-PMA עם ג תאים מהסוג בר glabrata (WT) גילו כי תאי WT היו phagocytosed ידי מקרופאגים בשיעור של 55-65% אחרי 2 coincubation שעה. יתר על כן, ג תאי glabrata היו מסוגלים להתנגד להריגתו על ידי THP-1 מקרופאגים ועברו 5 מתונות - לגידול פי 7 בCFUs לאחר 24 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages at JoVE.com

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול להקים מערכת מודל תרבית תאים במבחנה כדי לחקור את האינטראקציה של הפתוגן פקולטטיבי תוך תאי אנושי פטריית קנדידה glabrata עם מקרופאגים אדם אשר יהיה כלי שימושי כדי לקדם את הידע של מנגנוני ארסיות פטרייתי שלנו.

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

establishment-an-vitro-system-to-study-intracellular-behavior-candida

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

11.5K Views.  Centre for DNA Fingerprinting and Diagnostics, Andhra Pradesh, India.  המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול להקים מערכת מודל תרבית תאים במבחנה כדי לחקור את האינטראקציה של הפתוגן פקולטטיבי תוך תאי אנושי פטריית קנדידה glabrata עם מקרופאגים אדם אשר יהיה כלי שימושי כדי לקדם את הידע של מנגנוני ארסיות פטרייתי שלנו. 

Video: Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Transfection יעיל ביותר של של אדם המקרופאגים THP-1 על ידי nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

יישום של פלורסנט חלקיקים לחקר שיפוץ של מערכת Endo-lysosomal על ידי חיידקים תאיים

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

העברה יעילה במיוחד של מקרופאגים ראשוניים עם מחוץ לגופית

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...