מחקר במעבדה של רובינסון הוא נתמך על ידי מימון מהאשכול מצוינות קלן על תגובות הלחץ הסלולר במחלות Aging-Associated, אוניברסיטת קלן, גרמניה (CECAD; במימון של DFG בתוך יוזמה מצוינות של הפדרלי הגרמני, המדינה ממשלות) ומענקים פתוח (SFB 670), הון קלן, מריה-Pesch יסודות אוניברסיטת קלן, גרמניה.

כל השלבים הכרוכות של פתוגניים ס typhimurium צריך להתבצע BSL-2 או גבוה יותר מתקן רמת אבטחה ביולוגי. התרבות ואת ציפוי של ס Typhimurium, כמו גם את הזיהום של מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMDMs) חייב להתבצע תחת תא למינארי למניעת זיהום. בידודו של ס typhimurium-המכיל phagosomes יכול להתבצע על כל ספסל מעבדה BSL-2-
 החילוץ של מח העצם של עכברים עבור בידול שלה לתוך מקרופאגים שבוצעה בהתאם המוסדיים הנחיות על רווחת בעלי החיים ואושרו על-ידי הסוכנות מדינת נורדריין-ווסטפהאליאניות טבע, איכות הסביבה, הגנת הצרכן [Landesamt לדנציג נטור, Umwelt ו- Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; קובץ לא: 84-02.05.40.14.082 ו- 84-02.04.2015.A443], באוניברסיטת קולון.
 1. Culturing typhimurium ס <ol><li>Inoculate ס typhimurium (זן SL1344) של מושבת חיידקים יחיד לתוך מ ל מרק אינפוזיה (BHI) הלב של המוח באמצעות לולאה חיידקי.</li>
	<li>דגירה ההשעיה חיידקי באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ברעידות.</li>
	<li>למחרת, להעביר 1 מ"ל של ההשעיה חיידקיים לתוך 19 מ ל מרק BHI בבקבוקון חרוט, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור ברעידות.</li>
	<li>לפקח על ס typhimurium הצמיחה על ידי מדידת צפיפות אופטית (OD)-600 nm (OD 600) עם ספקטרופוטומטרים. מדידות להתחשב בערך כל 30 דקות</li>
	<li>OD כאשר 600 מגיע ל- 1.0, להסיר השעיית חיידקי חממה, העברת לתוך שפופרת 50 מ. צנטריפוגה חיידקים ב g x 5,400 למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע, resuspend ב- 10 מ ל תמיסת סטרילית באגירה פוספט (PBS).</li>
	<li>צנטריפוגה ב g x 5,400 למשך 15 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע, resuspend החיידק ב mL 4.9 ל- PBS סטרילי.</li>
</ol> 2. ציפוי של ס' typhimurium עם NHS-ביוטין/Streptavidin-מצומדת Beads מגנטי <ol><li>µL להוסיף 100 של 10 מ"ג/מ"ל ביוטין קישור פתרון (NHS-ביוטין מומס דימתיל סולפוקסיד, דימתיל סולפוקסיד) וטרי, כדי ההשעיה חיידקי מוכן בשלב הקודם. לדוגמה, לדלל 5 מ"ג של NHS-ביוטין לתוך 0.5 מ של דימתיל סולפוקסיד סטרילי. מיקס כראוי על-ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים.</li>
	<li>לפצל את התערובת לתוך חמישה צינורות 1.5 mL-</li>
	<li>Incubate כבר שעתיים בטמפרטורת החדר (RT) ב- thermoblock עם טלטול מתמיד ב- 350 סל"ד.</li>
	<li>צנטריפוגה צינורות ב 15,000 g x 10 דקות ב RT ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend ב 1 מ"ל של PBS סטרילי, צנטריפוגה ב 15,000 x g 10 דקות ב RT ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>חזור על שלב 2.5 פעמיים נוספות כדי להסיר לחלוטין את ביוטין עודף קישור פתרון.</li>
	<li>לאחר השטיפה האחרונה resuspend בגדר ב 1 מ"ל של PBS סטרילי.</li>
	<li>העברת 100 µL של 10 מ"ג/מ"ל פתרון streptavidin מצומדת beads מגנטי לתוך צינור 1.5 מ ל ולהשאיר את זה על המדף מגנטי עבור 5 דק.</li>
	<li>להסיר הממס עם פיפטה לקחת את streptavidin-מצומדת beads מגנטי הפתרון מהמדף מגנטי, resuspend זה עם 1 מ"ל של הבולם מצופה-בקטריאלי ביוטין מוכן בשלב 2.7.</li>
	<li>Incubate עבור h 1 ב RT ב thermoblock עם טלטול מתמיד ב- 350 סל"ד.</li>
	<li>למקם את הפתרון על מתלה מגנטי; לחכות 5 דקות ולאחר מכן להסיר עם פיפטה חיידקים לא מקפידים על גבי הקיר (לשמור את זה בצינור כאנטי &#34; החיידקים שאינם מצופים &#34;). השבר הקפדה על הקיר של הצינור בקשר עם המגנט נמצא החיידק ביוטין/streptavidin-מצופה.</li>
	<li>להסיר את הצינור המכיל חיידקים שכותרתו מהמדף מגנטי, resuspend ב 1 מ"ל של PBS סטרילי.</li>
	<li>למקם אותו שוב על מתלה מגנטי, להמתין 5 דקות ולהשתמש פיפטה כדי להסיר את PBS.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.13 ו 2.14 עוד פעמיים כדי להסיר את כל החיידקים הם לא מצופים beads מגנטי מצומדת streptavidin.</li>
	<li>לאחר השטיפה האחרונה resuspend החיידק מצופה ב- 500 µL ל- PBS סטרילי, שלוף את הצינור כמו &#34; מצופה חיידקים &#34;.</li>
	<li>נחשב המושבה יוצרי יחידות (cfu) של שני &#34; החיידקים שאינם מצופים &#34;, &#34; מצופה חיידקים &#34; פתרונות על ידי ציפוי דילולים טורית על פלטות אגר BHI. כ 2 x 10 8 cfu/mL של חיידקים מצופה התקבלו 20 מ"ל של השעיה חיידקי ראשוני עם יתר 600 של 1.0. לשמור על התליה מצופה-בקטריאלי ב 4 ° C כדי לשמש ביום שלמחרת, להדביק מקרופאגים.</li>
</ol> 3. זיהום של BDMDs <ol><li>באותו יום כאשר החיידקים הם מצופים ביוטין ו streptavidin מצומדת beads מגנטי, צלחת מלאה BMDMs 22 הבדיל במנות 6 ס מ על צפיפות של תאים 6 5 x 10 לכל תבשיל.</li>
	<li>ביום הבא, centrifuge התליה מצופה-בקטריאלי ב 15,000 g x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע, resuspend במדיום המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI), בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS)-ריכוז של 10 x 10 6 cfu/mL-</li>
	<li>להדביק מקרופאגים-ריבוי של זיהום (MOI) של 10, המדיום להסיר BMDMs ומוסיפים 5 מ של הבולם מצופה-בקטריאלי מוכן. MOI אופטימליים עשויים להידרש, עבור כל סוג התא או ניסיוני מטרת phagosomes מבודדים.</li>
	<li>Incubate-RT 10 דקות לסינכרון phagocytosis.</li>
	<li>Incubate-37 מעלות צלזיוס חממה 2 CO 5% למשך 30 דקות ליזום phagocytosis. סוגי תאים אחרים עשויים לדרוש פעמים הדגירה שונים כדי להבטיח הפנמה של החיידקים-</li>
	<li>להסיר המדיום המכיל חיידקים הכלים ולשטוף את התאים עם RPMI שלוש פעמים כדי להסיר חיידקים שאינם הפנימו.</li>
	<li>ולבסוף להוסיף 10 מ של RPMI המכיל 10% FBS ו µg 50/mL gentamycin להרוג את כל החיידקים הלא-phagocytized.</li>
	<li>דגירה של BMDMs נגוע ב 37 ° C עם 5% CO 2 עד נקודת הזמן המבוקש. נקודת הזמן הרצויים להיקבע השפעול לפי החיידקים ואת סוג התא המשמש את המטרה של ניתוח. לצורך המחקר האירועים פיוז'ן phagosome-אנדוזום מוקדם ס BMDMs נגועה Typhimurium, דגירה 30 דקות מומלץ. לניתוח של אירועים מאוחרים יותר, ניתן לחלץ phagosomes לאחר 2 h או 4 שעות של דגירה. דגירה ממושך של מקרופאגים עם ס Typhimurium מעבר 24 h תוצאות מות המקרופאגים. מורחב זיהום תאיים לפני החילוץ phagosome כנראה יכול להוביל השפלה של ביוטין מולקולות. עם זאת, לא נתבונן אובדן של ביוטין על חיידקים מצופה עד ה 24</li>
</ol> 4. בידוד של ס typhimurium-המכיל Phagosomes <ol><li>להכין עוצמת הקול של phagosome נדרש בידוד מאגר (50 מ מ צינורות, pH.7, 50 מ מ MgCl 2, 5 מ מ EGTA) על-ידי הוספת dithiothreitol (DTT) ריכוז סופי של 1 מ מ, Cytochalasin B להגמר ריכוז של מעכבי מיקרומטר, ואת פרוטאז פוספטאז 10 המומלצים ע י היצרן. 
	הערה: DTT ו- Cytochalasin B יש להוסיף למאגר בידוד phagosome A תמיד מיד לפני השימוש. Cytochalasin B משבשת את שלד התא, הקלת העלתה של קרום התא.</li>
	<li>בזמן הרצוי הצבע, להסיר את המדיום את התאים הנגועים, לשטוף עם PBS סטרילי חימם את RT.</li>
	<li>750 להוסיף µL של phagosomבידוד e מאגר A לכל תבשיל, דגירה 20 דקות על קרח. בעת שימוש מספרי הטלפון הנייד שונים, הנפח של בידוד מאגר A צריך להיות מותאם באופן פרופורציונלי.</li>
	<li>µL 250 להוסיף מאגר בידוד phagosome B (50 מ מ, pH.7, 50 מ מ MgCl 2, 5 מ מ EGTA, 220 מ"מ מניטול, וצינורות סוכרוז 68 מ מ). סלע הצלחת על מנת להבטיח כי המאגר מגיע לפני השטח המלא של המנה. בעת שימוש מספרי הטלפון הנייד שונים, הנפח של בידוד מאגר B צריך להיות מותאם באופן פרופורציונלי.</li>
	<li>להסיר התאים המנה על ידי גירוד בעדינות באמצעות שוטר גומי ומעבירים אותם אל צינור mL 1.5 טרום מקורר.</li>
	<li>עוברים התליה תא 26 גרם מחט באמצעות מזרק 1 מ"ל לפחות 15 פעמים (שאיפה אחת ועוד אחת הוצאה של הסעיפים התליה תא כמו פעם אחת). . זה מספיק כדי לשחרר את התוכן cytosolic של BMDMs. מספר עובר דרך המחט חייב להיות אופטימיזציה עבור כל סוג התא.</li>
	<li>מקום התליה תא על מתלה מגנטי ולא לחכות 5 דקות. החלקיקים קשור המגנט הן phagosomes המכיל מצופה - ס Typhimurium. ההשעיה מכיל את שאר מרכיבי התא.</li>
	<li>להעביר את המתלים לתוך צינור 1.5 mL כאנטי &#34; ציטוזול &#34;.</li>
	<li>להסיר את הצינור עם phagosomes מבודדים המדף מגנטי, resuspend אותם ב 1 מ"ל של PBS סטרילי.</li>
	<li>למקם את המתלים phagosome על מתלה מגנטי, לחכות 5 דקות והסר את PBS.</li>
	חזור על שלבים 4.9 ו- 4.10 לשטוף את מבודדת ס <li> typhimurium-המכיל phagosomes.</li>
	<li>לבסוף להסיר את PBS, resuspend את phagosomes במאגר הדרושים; לדוגמה, במאגר assay (ריפה) radioimmunoprecipitation לניתוח חלבון. כ- 50-200 µg החלבון מתקבל לדגימה בעקבות פרוטוקול זה, בהתאם הסכום הראשוני של תאים למשרד הפנים של זיהום.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).</li><li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+going+through+the+acid+test.">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).</li><li>Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+V-ATPase+along+the+Endocytic+Pathway+Occurs+through+Reversible+Subunit+Association+and+Membrane+Localization.">Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization.</a> Plos One. 3 (7), e2758 (2008).</li><li>Forgac, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+ATPases:+rotary+proton+pumps+in+physiology+and+pathophysiology.">Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).</li><li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-type+H+-ATPase+in+vesicular+trafficking:+targeting,+regulation+and+function.">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li><li>Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+delivery+of+procathepsin+D+to+phagosomes:+Implications+for+phagosome+biogenesis+and+parasitism+by+Mycobacterium.">Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium.</a> Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).</li><li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+Physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).</li><li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagosome:+Compartment+with+a+license+to+kill.">The phagosome: Compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).</li><li>Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+A+few+bugs+in+the+system.">Phagosome maturation: A few bugs in the system.</a> J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).</li><li>Turk, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+cathepsins:+From+structure,+function+and+regulation+to+new+frontiers.">Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers.</a> Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).</li><li>Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+II+MHC+molecules+and+peptide+complexes+appear+in+phagosomes+during+phagocytic+antigen+processing.">Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing.</a> Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).</li><li>Robinson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+Phenolic+Glycolipid+Inhibits+Phagosome+Maturation+and+Subverts+the+Pro-inflammatory+Cytokine+Response.">Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response.</a> Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).</li><li>Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+and+Legionella+pneumophila+phagosomes+exhibit+arrested+maturation+despite+acquisition+of+Rab7.">Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7.</a> Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).</li><li>Smith, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+distinct+phospholipases+C+of+Listeria+monocytogenes+have+overlapping+roles+in+escape+from+a+vacuole+and+cell-to-cell+spread.">The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread.</a> Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).</li><li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outsmarting+the+host:+bacteria+modulating+the+immune+response.">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).</li><li>Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+pathogenicity+island+2-encoded+type+III+secretion+system+mediates+exclusion+of+NADPH+oxidase+assembly+from+the+phagosomal+membrane.">Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane.</a> J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).</li><li>Ohl, M. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella:+A+model+for+bacterial+pathogenesis.">Salmonella: A model for bacterial pathogenesis.</a> Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).</li><li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages:+Y-pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded.">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).</li><li>Buchmeier, N. A., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Macrophage+Phagosome-Lysosome+Fusion+by+Salmonella-Typhimurium.">Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium.</a> Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).</li><li>Luhrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages.">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).</li><li>Steinhauser, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-labeling+facilitates+a+novel+magnetic+isolation+procedure+to+characterize+pathogen-containing+phagosomes.">Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes.</a> Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+and+intracellular+localization+of+Brucella+spp.+in+Vero+cells:+fluorescence+and+electron+microscopy.">Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy.</a> Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).</li><li>Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+trafficking+of+Brucella+abortus+in+J774+macrophages.">Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages.</a> Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).</li><li>Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+phagosomal+proteomes:+from+latex-bead+to+bacterial+phagosomes.">Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes.</a> Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).</li><li>Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+biology+approach+to+study+the+phagosomal+proteome+modulated+by+mycobacterial+infections.">A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections.</a> Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).</li><li>Rogers, L. D., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum.">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

שיטה חדשה עבור בידודו של ס typhimurium-המכילה phagosomes על-ידי ציפוי החיידק ביוטין, streptavidin מצומדת beads מגנטי מתואר כאן. לאחר הפרעה עדין של קרום התא, phagosomes המכיל חיידקים ניתן בקלות לחלץ באמצעות מתלה מגנטי. אנו מראים כי תיוג של החיידקים המשמרת את הקיבולת של המחלה כדי לגרום לדלקת, אינה משנה את ה?...

המקרופאגים הם מסתובבים תאים phagocytic מיוחדים לזהות, לבלוע, לבזות את כל החלקיקים הזרים נוכח ברקמות היקפיים, החל מוות תאים כדי מיקרואורגניזמים כגון חיידקים פולשים. על פני השטח קולטן בתיווך זיהוי של סמנים הפתוגן הספציפי הנוכחי בדרך כלל על פני השטח של מיקרואורגניזמים (המכונה פתוגן-הקשורים לתבניות מולקולרי או PAMPs), מקרופאגים ליזום ומורכב של הממברנה התאית ב סדר כדי להקיף את הפתוגן1phagocytize.
הפתוגן אפף נכלל אז על ידי מקרופאג ב שלפוחית תאיים המכונה phagosome. דרך סדרה של פיוז'ן ואירועים ביקוע עם שלפוחית אחרים כגון endosomes ו- lysosomes, phagosome פתוגן המכיל רוכש ערכה של חלבונים הדרושים עבור חיסול של התוכן phagosomal. לכן, ההרכב אנזימטי של phagosome זה משתנה מאוד במהלך תהליך זה, המכונה ההבשלה phagosome2.
זמן קצר לאחר phagocytosis, multimeric ATPase vacuolar מורכבים (v-ATPase) הוא שולב קרום phagosome על ידי היתוך עם endosomes3. מתחם זה מנצל ATP כדי משאבת הפרוטונים מ ציטוזול כדי לומן של phagosome4. לחומצי phagosome חיוני עבור האירועים פיוז'ן עם אחרים שלפוחית5 , הפעלת מספר רב של אנזימים degradative תלויי-pH6. עוד מתחם אנזימטי multimeric במהירות שמתארגנת על קרום phagosome הוא המתחם nadph לאוקסידאז (NOX). NOX מורכבים מתחמצן nadph על מנת לייצר מינים חמצן תגובתי (ROS) זה מופרשים לתוך לומן phagosome ואשר תורמות באופן משמעותי הריגתו של מיקרואורגניזמים אפף7.
במהלך השלבים הראשונים של התבגרות, phagosomes להציג סמני בדרך כלל כגון Rab5 ו- Rab7 של endosomes מוקדמות ומאוחרות בהתאמה יחד עם יחידת משנה0 V של v-ATPase8. פיוז'ן של phagosomes עם lysosomes ו- endosomes מאוחר תוצאות חשיפת המחלה phagocytized למגוון רחב של אנזימים hydrolytic כגון cathepsin פרוטאזות, lipases וβ-galactosidase9. לחומצי לומן נדרש גם ההפעלה של אנזימים אלה. לדוגמה, המחשוף של cathepsin D כדי לייצר טופס קצר פעיל הוא תלוי-pH10. אנזימים אלה לבזות את הפתוגן ולסיים את הייצור של פפטידים קצרים, נגזר הפתוגן מוצגים על ידי מקרופאג histocompatibility הגדולות מורכבות (MHC) class II מולקולות בתאי T כדי לעורר תגובה חיסונית אדפטיבית11.
לפיכך, phagosome ההבשלה הוא קריטי עבור התגובה החיסונית מולדת וקישורים הזרועות מולדת, גמישים של המערכת החיסונית. . זה לא מפתיע כי פתוגנים התפתחו אסטרטגיות כדי להתגבר על חיסול על ידי מקרופאגים לאורך התהליך המתואר לעיל של התבגרות phagosome... לדוגמה, החיידק תאיים שחפת Mycobacterium , הלגיונלה pneumophila למנוע ההבשלה phagosome על ידי מעכבים v-ATPase הרכבה ו לומן הסוגר acidification12,13 . חיידקים אחרים, כגון ליסטריה או שיגלה flexneri זירוז היווצרות נקבובית ממברנה phagosome להימלט אל ציטוזול ה-14,15. לעומת זאת, serovar enterica סלמונלה typhimurium (S. typhimurium) הוא מסוגל לשנות את המאפיינים של phagosome בתוך חלולית להפכו במיקום מתאים עבור שכפול שלו16. יכולת זו גורם S. typhimurium מודל מאוד מעניין ללמוד בתיווך הפתוגן הפרעה של התבגרות phagosome.
ס typhimurium הוא חיידק תאיים עיצוב גבות הגורמת דלקת הקבה והמעים בבני אדם. לאחר הפלישה פרופריה. מוסקולריס, ס חיידקים Typhimurium במהירות זוהה, phagocytized על ידי מקרופאגים, הנכלל phagosomes17. כמה דיווחים בעבר תיארו את ס typhimurium-phagosomes המכיל להציג למקבלי הן endosomes והן lysosomes18, מחקרים אחרים מצאו ליזוזום phagosome פיוז'ן מנעה על ס זיהום Typhimurium19.
בתחילה, phagosome ההבשלה על ס זיהום typhimurium נחקר על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. התפתחות טכניקות בידודו של המכילים חיידקים phagosomes התומך מחקר מדויק יותר של התוכן phagosome במונחים של סמנים אנדוזום, ליזוזום. נכון להיום, שיטת העיקרי המשמש את ניתוקה של המכילים חיידקים phagosomes הוא fractionation subcellular18,מעברי צבע של סוכרוז שלב20. עם זאת, שיטה זו דורשת מספר השלבים צנטריפוגה זה יכול לגרום לנזק מכני phagosomes, יכול להשפיע על היציבות של רכיבים phagosomal (חלבונים ושומנים), הוא זמן רב. יתר על כן, זה דורש את השימוש ultracentrifuge: פיסת ציוד מיוחד שאינו נגיש עבור כל מעבדה.
לאחרונה הוחל גישה חדשה את בידודה של בקטריאלי המכיל phagosomes, שבו פתוגנים חיידקיים מסומנות עם biotinylated lipopetide (Lipobiotin) ומאוחר יותר חילוץ באמצעות streptavidin מצומדת beads מגנטי21 . אנו מציעים שיטה משלימה חלופית על-ידי תיוג חיידקי משטח המכיל amine מקרומולקולות עם NHS-ביוטין ואחריו streptavidin מצומדת beads מגנטי. Phagosomes המתקבלות בשיטה זו מאוד מועשרים בסמני אנדוזום, ליזוזום והוא יכול לשמש למגוון רחב של מבחני, מניתוח חלבון טכנולוגיות לניתוח. בנוסף, זה אינו מצריך ציוד מיוחד כגון ultracentrifuges. יתר על כן, על ידי ביטול השלבים צנטריפוגה, הנזק מכני phagosomes והן את כמות הזמן המועסקים הם מופחת במידה ניכרת. בשיטה זו ניתן להתאים בקלות בידוד של phagosomes המכילה חיידקים אחרים, כגון גראם חיוביים Staphylococcus aureus, כללה גם כתב יד זה. לסיכום, שיטה זו עבור בידודו של ס typhimurium-המכיל phagosomes הוא משחק פשוט, חסכוני, חינוך, פחות זמן רב יותר הבידוד קלאסית מאת סוכרוז הדרגתי-ultracentrifugation, עיבוד מאוד המכיל חיידקים phagosomes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluidMag Streptavidin</td>
			<td>Chemicell</td>
			<td>4205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A537.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4175.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYNAL or DynaMag Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial loop (10&#181;l)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1562.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SA1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-beta-actin antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-47778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mCherry antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-34974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rab5 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-46692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rab7 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-10764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-v-ATPase (V0) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-v-ATPase (V1) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-20943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cathepsin D antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tomm20 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-calnexin antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-46669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-20357</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages

סלמונלה typhimurium הוא חיידק תאיים עיצוב גבות הגורמת דלקת הקבה והמעים בבני אדם. לאחר הפלישה פרופריה. מוסקולריס, S. חיידקים typhimurium במהירות זוהה, phagocytized על ידי מקרופאגים, הכלול שלפוחית המכונה phagosomes על מנת להיות מושפל. בידוד של ס typhimurium-phagosomes המכיל היה בשימוש נרחב כדי ללמוד איך ס זיהום typhimurium משנה את תהליך ההבשלה phagosome כדי למנוע השפלה חיידקי. באופן קלאסי, בידודו של המכילים חיידקים phagosomes בוצעה על ידי צנטריפוגה הדרגתיות סוכרוז. עם זאת, תהליך זה זמן רב, דורש מידה מסוימת של מיומנות וציוד מיוחדים. המתוארים כאן היא שיטה פשוטה ומהירה על בידודו של ס typhimurium-המכילה phagosomes של מקרופאגים על-ידי ציפוי החיידקים עם ביוטין-streptavidin-מצומדת beads מגנטי. יכול להיות מושעים phagosomes המתקבלות בשיטה זו כל מאגר של בחירה, המאפשר הניצול של phagosomes מבודדים למגוון רחב של מבחני, כגון חלבון, מטבוליט ו ליפיד לניתוח. לסיכום, שיטה זו עבור בידודו של ס typhimurium-המכיל phagosomes ספציפיים, יעיל, מהיר, דורש ציוד מינימלי, תכליתי יותר מאשר השיטה הקלאסית של בידוד מאת סוכרוז הדרגתי-ultracentrifugation.

בידוד של המכילים חיידקים phagosomes על ידי פרוטוקול זה מחייב את biotinylation של החיידקים כצעד ראשון. אנחנו ולכן העריך את האפקטיביות של ס typhimurium biotinylation על ידי ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית BMDMs נגוע biotinylated mCherry -S. typhimurium המסומנת Cy5-Streptavidin. בקצרה, BMDMs נדבקו כפי שמתואר פ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages at JoVE.com

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

נתאר כאן שיטה פשוטה ומהירה בידודו של סלמונלה typhimurium-המכילה phagosomes של מקרופאגים על-ידי ציפוי החיידקים עם ביוטין ו streptavidin.

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

isolation-salmonella-typhimurium-containing-phagosomes-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

10.5K Views.  University of Cologne. נתאר כאן שיטה פשוטה ומהירה בידודו של סלמונלה typhimurium-המכילה phagosomes של מקרופאגים על-ידי ציפוי החיידקים עם ביוטין ו streptavidin.

Video: Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

שימוש של<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; כדי לחקור אינטראקציות Autophagy-נוגדנים

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Assay תפוקה גבוהה להפנוטיפ<em&gt; Enterica סלמונלה</em&gt; Typhimurium איגוד, פלישה, ושכפול בהמקרופאגים

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

כימות של Cytosolic לעומת vacuolar<em&gt; סלמונלה</em&gt; ביסודי המקרופאגים על ידי דיפרנציאל permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

אפיון פנוטיפי של מקרופאגים כליה עכברוש ידי cytometry זרימה

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

בידוד, אפיון, טיהור של מקרופאגים רקמות מושפעות על ידי דלקת הקשורות להשמנת יתר

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and dysregulated repair. In inflammatory bowel disease (IBD), fibrosis leads to recurrent stricture formations for which there is no effective therapy other than surgical resection. Due to its late onset, the processes that drive fibrosis is less studied and largely unknown. Therefore, fibrotic complications represent a major challenge in IBD. In this protocol, a robust in vivo model of intestinal fibrosis is described where streptomycin pre-treatment of C57Bl/6 mice followed by oral gavage with vaccine grade Salmonella Typhimurium &#916;AroA mutant leads to persistent pathogen colonization and fibrosis of the cecum. Methodologies for preparing S. Typhimurium &#916;AroA for inoculation, quantifying pathogen loads in the cecum and spleen, and evaluating collagen deposition in intestinal tissues are explained. This experimental disease model is useful for examining host factors that either enhance or exacerbate CD-like intestinal fibrosis.

This protocol describes a mouse model of Salmonella driven intestinal fibrosis that resembles key pathological hallmarks of Crohn&#8217;s disease including transmural inflammation and fibrosis. This method can be used to evaluate host factors that alter fibrotic outcomes using mutant mice maintained on a C57Bl/6 genetic background.

סלמונלה כרונית זיהום דלקת מעיים פיברוזיס

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key players in health and disease, acting as phagocytes during immune defense and mediating trophic, maintenance, and repair functions. Although it has been possible to study some of the molecular processes involved in human macrophage function, it has proved difficult to apply genetic engineering techniques to primary human macrophages. This has significantly hampered our ability to interrogate the complex genetic pathways involved in macrophage biology and to generate models for specific disease states. An off-the-shelf source of human macrophages that is amenable to the vast arsenal of genetic manipulation techniques would, therefore, provide a valuable tool in this field. We present an optimized protocol that allows for the generation of macrophages from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) in vitro. These iPSC-derived macrophages (iPSC-DMs) express human macrophage cell surface markers, including CD45, 25F9, CD163, and CD169, and our live-cell imaging functional assay demonstrates that they exhibit robust phagocytic activity. Cultured iPSC-DMs can be activated to different&#160;macrophage states that display altered gene expression and phagocytic activity by the addition of LPS and IFNg, IL4, or IL10. Thus, this system provides a platform to generate human macrophages carrying genetic alterations that model specific human disease and a source of cells for drug screening or cell therapy to treat these diseases.

This protocol describes the robust generation of macrophages from human induced pluripotent stem cells, and methods for their subsequent characterization. Cell surface marker expression, gene expression, and functional assays are used to assess the phenotype and function of these iPSC-derived macrophages.

הפקה ואפיון של מקרופאגים האדם מ Pluripotent תאי גזע

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...