1. הכנת אלקטרודות ותמיסת מלח הפתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסת מלח ואלקטרודות פיסיולוגיות לפני החיה גזור. הפתרון של העלוקה רינגר מורכב מהפעולות הבאות: 115.3 mM NaCl, 1.8 מ&quot;מ CaCl 2, 4.0 מ&quot;מ KCl, 10 מ&quot;מ טריס / חומצת maleic או HEPES. התאם את ה-pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חוט Ag-Cl על ידי טבילת חוטי כסף ניקו לכמות קטנה של אקונומיקה ל20 דקות או עד לחוט יש לסיים אפור כהה חלק. לשטוף את החוט במים מזוקקים לפני השימוש. לאחר מכן הנח את החוט לתוך בעל micropipette המתחבר למגבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אלקטרודת זכוכית חדה של זכוכית בורוסיליקט באמצעות חולץ פיפטה. התנגדות אלקטרודה צריכה להיות על סדר 20 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגבות את פיפטה עם 3 פתרון אצטט M אשלגן ולהכניס בלתוך מחזיק micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאלקטרודה תאית להכין פיפטה זכוכית חדה כפי שתואר לעיל, לשבור את הקצה לאחור על ידישפשוף אחר פיפטה חדה ליד הקצה החד. אז אפטור ללטש את הקצה, כך שזה לא לקרוע את connectives. אלקטרודות תאי פלסטיק יעבדו גם כל עוד יש קשר טוב בין האלקטרודה והעצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את האלקטרודה ההקלטה תאית לבעל micropipette (עם חוט Ag-Cl) שמצוידת בצינור גומי ומזרק לשאיבה. השתמש במזרק לצייר מלוח לתוך האלקטרודה לפחות לרמה של חוט הכסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את החומרה (מגבר ומבודד גירוי) ופרמטרי הקלטת תוכנה על ידי ביצוע המדריך ליחידת הקלטת אות הספציפית שלך. ראה Leksrisawat et al. 22 כדי להציג פרטים על ציוד המשמשים בניסויים שתוארו להלן. </li></ol> 2. הגחון גנגליון Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את העלוקה בצלחת גדולה מרופד אלסטומר סיליקון עם הפתרון של העלוקה רינגר. אם בעל החיים נמתח longitudinally זהיהיה קל יותר להסיר את חוט עצב הגחון (ראה איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם 10 # או # 11 אזמל גודל, לעשות חתך אורכי עם חתכים רדודים מאוד בקו אמצע הגחון. כ 2/3rd אמצע לחתוך הגחון מוצג באיור 1 ב. נסה לא לחתוך את הגרב השחור (סינוס דם הגחון) עד שהחיה נפתחה באופן מלא וסינוסים הדם נמתח ללא סטיות. סינוס דם זו מפעיל את אורכו של בעל החיים לאורך קו האמצע הגחון. VNC הוא הכיל בתוכו של כלי דם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העור נחתך לכל אורכו של בעל החיים להשתמש במספרי איריס הקנס לכינוי סינוס הדם (איור 2). Slip להב אחד איריס המספריים בסדר תחת סינוס ומעט להעלות את הלהב כדי להפריד אותו מרקמת העצב. חותכים את הסינוס האורך של VNC, תוך הימנעות שורשי עצבים, עצבים מגזרי, או connectives בין הגרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, להסיר חלק מעצב בחוט הגחון על ידיחיתוך שורשי דיסטלי למקום שבי כלי הדם מצטרפים לשורשים. חזור על תהליך זה עבור כל הגנגליון לאורכו של חוט עצב הגחון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הקטע של גרעיני אחד או שתיים לצלחת פטרי קטנה יותר. הגרעינים או גנגליון אחד צריך להיות מוצמדים מתוח עם קצת רפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את connectives ושורשים כך נדן גליה הגנגליון נמתח מעט כדי למנוע את גופי תא נוירון לנוע סביב כאשר impaling דרך נדן גליה ואל תוך תא העצב של עניין. צריכה להיות ממוקמות הסיכות דרך סינוס השחור לשורשים ובאמצע שני connectives כדי למזער את הנזק של האקסונים (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי עם הכנה מתחת למיקרוסקופ ולאבטח אותו עם שעווה בתחתית המנה, כדי למנוע תנועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתמקד בזהירות את אלומת האור באמצעות מראה וקבל אור כדי לראות את הנוירונים כמו באיור 4 א (מוצג באופן סכמטי באיור 4 </strong&gt;). שים לב שני תאי Retzius גדולים במרכז גנגליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את ההקלטה תאית של Rz, T, P, ונוירונים N, הנח בזהירות את קצה האלקטרודה מעל התא של עניין ובעדינות להוריד את הקצה עד גומה נתפס בנדן גליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש על בעל אלקטרודה או מניפולטור (בזהירות רבה), כך ש&quot; אבא &quot;קצה האלקטרודה לתא של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק פולסים קצרים (30-40 אלפיות שנייה) של זרם חיובי (1-10 NA) לתוך התא לעורר פוטנציאל פעולה. </li></ol> 3. נוירונים Culturing מגחון גנגליון ההכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את הצד הגחוני הגרעינים בצלחת נקייה המכילה L-15 עם סרום עוברי עגל (FCS) (איור 3). הצמד את השורשים כך שגרעיניהם מעט מתוחים כפי שנעשה לעיל עבור הקלטות תאיים. עם מספריים עדינים, ניק כמוסת גליה בקצה אחד, להחליק להב מספריים אחת מתחת לכמוסה, ולאחר מכן חצה את הקפסולה גליהכפי שמוצג באיור 5 א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 aliquot μl של Collagenase / Dispase לצלחת ומניחים על שייקר ל15 דקות. בחן את התאים על ידי העברת התקשורת בתרבות סביב גופי תא החשופים. להחזיר את התאים לייקרו לעוד דקות 15 או יותר עד שהתאים לצאת עם יניקה מינימאלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה מצורפת מזרק כדי לחלץ בעדינות תאי גנגליון. אש ללטש קצה פיפטה כך שהוא מעט גדול יותר מקוטר גוף תא. לתאי Rz בעלוקה מבוגר, הקוטר צריך להיות כ 50 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מגוון של טפטפות עם קטרים ​​שונים ללא חוט להט כמו זה מקטין את הסיכויים של תאי דבק בתוך פיפטה. אחסן את טפטפות בבקבוק המכיל 80% אתנול (EtOH) באמצעות כדור צמר גפן בתחתית כדי להגן על הטיפים מסתתים. זכור לשטוף את EtOH מתוך פיפטה עם מדיום לפני aspirating תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טיפול אנזים, לשטוף החוצהבינוני עם L-15 (עם FCS) 2x המכיל אנזים. זהה את התאים של עניין ובעדינות למשוך אותם לתוך פיפטה ידי משיכת המזרק (איור 6 א). פריקת התאים להישאף לתוך צלחת אחרת המכילה L-15 (עם FCS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עד עכשיו, כל ההליכים היו לא סטרילי. בצע את השלבים הבאים במנדף סטרילי. הנח 3-4 טיפות גדולות של L-15 סטרילי (עם FCS) במיקומים שונים בתוך צלחת פטרי סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את התאים לתוך אחד את הטיפות לפני שהוזכרו, נושבת סביבם בטיפה לשטוף אותם. חזור על פעולה זו בסדרה ב 3 או 4 טיפות של מדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום תאים בצלחת פטרי נקייה מלאה L-15 (עם FCS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עבור 1-24 שעה בטמפרטורת חדר. לאחר מכן יכולים להיות מצופים התאים נקיים. מאת עוזב את התאים לכמה שעות או לילה המטריצה ​​תאית יורדת בקלות. פלייט התאים באופן מיידי כדי ליצור תהליכים ארוכים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במצע סטרילי למעייל di microwell<html> sh ולאפשר לו להתייבש לחלוטין (לילה) לפני culturing ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הצלחת כבר מצופה, לשטוף את הצלחת בעדינות עם מים סטריליים ולאחר מכן עם כמות קטנה של מדיום L-15. זכור להשתמש בפתרון L-15 ללא FCS נוספו כדי לאפשר לתאים לדבוק הצלחת. הבינוני ניתן לשנות בעדינות כדי L-15 עם FCS אחרי התאים יש דבק למצע. אם התאים הם לשמש כמה שעות לאחר ציפוי, אז מיתוג הבינוני עד L-15 עם FCS אינו הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את התאים סמוכים זה לזה בעת ציפוי כדי לגרום synaptogenesis המהירה (איור 6). לאחר פעילות פיזיולוגית 24 מדד שעות בזיווגים של נוירונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקות אלקטרו תאיים להקליט RP או תגובות הסינפטי בזוגות בתרבית של תאים (לעורר נוירון 1 עד תגובות האלקטרודה ושיא תאית מהתא לזווג באמצעות אלקטרודה תאית 2). </li></ol>&quot;כותרת&gt; 4. גנגליון הגוף וול הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את צד גב העלוקה למטה בצלחת מרופדת אלסטומר כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את העור לצד אחד עם שורשים בצד השני של הגנגליון הכרות האחר (איור 7 א, מוגדלים באיור 7 ב) או להפוך את חלון בהיבט הגחון של העלוקה מעל הגנגליון (איור 7C) עם כל השורשים לגוף קיר שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קבלת הקלטה תאית יציבה באחד מתאי החישה (T, P, N) להשתמש במוט זכוכית קטן שכבר אש מלוטשת כדי לגעת בעור באותו הקטע באורח קל. אם נוירון מוקלט מהוא תא N אז לחץ יותר יצטרך להיות מיושם על העור. ברוב המקרים, תא N רק להגיב אם העור הוא צבט עם פינצטה. מסיבה זו יש לנסות תאים אלה האחרונים כאחד עלול לגרום נזק לעור או לעקור את הקידוד מחדש תאיים על ידי הפרעה להכנה בצורה כזאת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחד צריך להיותתוכל לשרטט את העור וגנגליון עם פרטים די מספיק מהר, כי מפה של שבו נגע בם ניתן להשתמש כדי לקבוע את השדה פתוח לנוירון מסוים. לאחר הקלטה מכמה T ו-P תאים ככל האפשר משני צידי גנגליון לנסות תאי N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לבחון אם יש העצב סנסורי תהליכים שעוברים דרך connectives באופן מקורי או הזנב ולאחר מכן את השורשים במגזר הצמוד לעור, ניתן לחתוך connectives בין הגרעינים והשדות פתוחים מחדש לגבי התפשטות של זיהוי. בעיקרון אחד בוחן אם חלה ירידה כלשהי בשדה פתוח. </li></ol> 5. הזרקת פלורסנט צבעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הגנגליון עלוקה כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא microelectrode עם פתרון של צהוב-CH לוציפר (3.0%) וליתיום כלוריד (300 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדקור את אחד מתאי חישה או תאי Rz בצד הגחון של גנגליון כפי שתוארלעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק צבע לתוך התא על ידי העברת זרם שלילי (3nA) באמצעות אלקטרודה ל15 דקות. הגדר את משך הדופק ל100 אלפית שניים ואת התדירות עד 2 הרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את הנוירונים צבע מלא על ידי מרגש לצבוע עם מנורת כספית ומערכת סינון FITC / ה-GFP. </li></ol>

<ol>
	<li>Fuchs, P. A., Nicholls, J. G., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+and+selective+connexions+of+identified+leech+neurones+in+culture.">Membrane properties and selective connexions of identified leech neurones in culture.</a> J Physiol. 316, 203-223 (1981).</li><li>Ready, D. F., Nicholls, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+neurones+isolated+from+leech+CNS+make+selective+connections+in+culture.">Identified neurones isolated from leech CNS make selective connections in culture.</a> Nature. 281, 67-69 (1979).</li><li>Blackshaw, S. E., Muller, K. J., Nicholls, J. G., Stent, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurobiology of the Leech. , 51-78 (1981).</li><li>Drapeau, P., Sanchez-Armass, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+and+selection+of+the+responses+to+serotonin+during+reinnervation+of+an+identified+leech+neuron.">Parallel processing and selection of the responses to serotonin during reinnervation of an identified leech neuron.</a> J Neurobiol. 20, 312-325 (1989).</li><li>Garcia, U., Grumbacher-Reinert, S., Bookman, R., Reuter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Na++and+K++currents+in+soma,+axons,+and+growth+cones+of+leech+Retzius+neurones+in+culture.">Distribution of Na+ and K+ currents in soma, axons, and growth cones of leech Retzius neurones in culture.</a> J. Exp. Biol. , 1-17 (1990).</li><li>Cooper, R. L., Miguel Fernandez, d. e., Adams, F., B, W., Nicholls, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+inhibits+expression+of+calcium+currents+in+purely+postsynaptic+cells.">Synapse formation inhibits expression of calcium currents in purely postsynaptic cells.</a> Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 217-222 (1992).</li><li>Liu, Y., Nicholls, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steps+in+the+development+of+chemical+and+electrical+synapses+by+pairs+of+identified+leech+neurons+in+culture.">Steps in the development of chemical and electrical synapses by pairs of identified leech neurons in culture.</a> Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 236-253 (1989).</li><li>Fernandez de Miguel, F., Cooper, R. L., Adams, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+and+calcium+current+distribution+in+cultured+leech+neurons.">Synaptogenesis and calcium current distribution in cultured leech neurons.</a> Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. 247, 215-221 (1992).</li><li>Briggman, K. L., Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+pattern-generating+circuits.">Multifunctional pattern-generating circuits.</a> Annu. Rev. Neurosci. 31, 271-294 (2008).</li><li>Macagno, E. R., Muller, K. J., Deriemer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+axons+and+synaptic+connections+by+touch+sensory+neurons+in+the+leech+central+nercoys+system.">Regeneration of axons and synaptic connections by touch sensory neurons in the leech central nercoys system.</a> J. Neurosci. 5, 2510-2521 (1985).</li><li>Becker, T., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+control+of+a+critical+period+for+peripheral+induction+of+central+neurons+in+the+leech.">CNS control of a critical period for peripheral induction of central neurons in the leech.</a> Development. 116, 427-434 (1992).</li><li>Marin-Burgin, A., Kristan, W. B., French, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Synapses+to+behavior:+Development+of+a+sensory-motor+circuit+in+the+leech.">From Synapses to behavior: Development of a sensory-motor circuit in the leech.</a> Dev. Neurobiol. 68, 779-787 (2008).</li><li>Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurobiology+of+Swimming+in+the+leech.">The Neurobiology of Swimming in the leech.</a> Trends Neurosci. 6, 84-88 (1983).</li><li>Brodfuehrer, P. D., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+stimulation+to+undulation:+a+neuronal+pathway+for+the+control+of+swimming+in+the+leech.">From stimulation to undulation: a neuronal pathway for the control of swimming in the leech.</a> Science. 234, 1002-1004 (1986).</li><li>Arbas, E. A., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+oscillations+of+membrane+potential+in+interneurons+that+control+heartbeat+in+the+medicinal+leech.">Slow oscillations of membrane potential in interneurons that control heartbeat in the medicinal leech.</a> J. Neurosci. 7, 3953-3960 (1987).</li><li>Ching, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Synaptogenesis between identified neurons. , (1995).</li><li>Kristan, W. B., Eisenhart, F. J., Johnson, L. A., French, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+neuronal+circuits+and+behaviors+in+the+medicinal+leech.">Development of neuronal circuits and behaviors in the medicinal leech.</a> Brain Res. Bull. 53, 561-570 (2000).</li><li>French, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+expression+is+required+for+normal+chemical+synapse+formation.">Gap junction expression is required for normal chemical synapse formation.</a> J. Neurosci. 30, 15277-15285 (2010).</li><li>Li, Q., Burrell, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+forms+of+long-term+depression+in+a+polysynaptic+pathway+in+the+leech+CNS:+one+NMDA+receptor-dependent+and+the+other+cannabinoid-dependent.">Two forms of long-term depression in a polysynaptic pathway in the leech CNS: one NMDA receptor-dependent and the other cannabinoid-dependent.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 195, 831-841 (2009).</li><li>Nicholls, J. G., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+modalities+and+receptive+fields+of+sensory+neurons+in+CNS+of+the+leech.">Specific modalities and receptive fields of sensory neurons in CNS of the leech.</a> J. Neurophysiol. 31, 740-756 (1968).</li><li>Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptive+fields,+geometry+and+conduction+block+of+sensory+neurones+in+the+central+nervous+system+of+the+leech.">Receptive fields, geometry and conduction block of sensory neurones in the central nervous system of the leech.</a> J. Physiol. 263, 513-538 (1976).</li><li>Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+receptor+organs+in+the+crayfish+abdomen:+a+student+laboratory+exercise+in+proprioception.">Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception.</a> J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).</li><li>Crisp, K. M., Mesce, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+central+pattern+generator:+amine+modulation+of+decision-making+neural+pathways+descending+from+the+brain+of+the+medicinal+leech.">Beyond the central pattern generator: amine modulation of decision-making neural pathways descending from the brain of the medicinal leech.</a> J. Exp. Biol. 209, (2006).</li><li>Puhl, J. G., Mesce, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+activates+the+motor+pattern+for+crawling+in+the+medicinal+leech.">Dopamine activates the motor pattern for crawling in the medicinal leech.</a> J. Neurosci. 28, 4192-4200 (2008).</li><li>Crisp, K. M., Gallagher, B. R., Mesce, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+contributing+to+the+dopamine+induction+of+crawl-like+bursting+in+leech+motoneurons.">Mechanisms contributing to the dopamine induction of crawl-like bursting in leech motoneurons.</a> J. Exp. Biol. 215, 3028-3036 (2012).</li><li>Macagno, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+medicinal+leech+transcriptome+database+and+its+application+to+the+identification+of+leech+homologs+of+neural+and+innate+immune+genes.">Construction of a medicinal leech transcriptome database and its application to the identification of leech homologs of neural and innate immune genes.</a> BMC Genomics. 11, 407 (2010).</li><li>Kandarian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medicinal+leech+genome+encodes+21+innexin+genes:+different+combinations+are+expressed+by+identified+central+neurons.">The medicinal leech genome encodes 21 innexin genes: different combinations are expressed by identified central neurons.</a> Dev. Genes Evol. 222, 29-44 (2012).</li><li>Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+RNAi+and+ectopic+gene+expression+in+the+medicinal+leech.">Localized RNAi and ectopic gene expression in the medicinal leech.</a> J. Vis. Exp. (14), e697 (2008).</li><li>Firme, C. P., Natan, R. G., Yazdani, N., Macagno, E. R., Baker, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+select+innexins+in+individual+central+neurons+couples+them+to+pre-existing+neuronal+or+glial+networks+that+express+the+same+innexin.">Ectopic expression of select innexins in individual central neurons couples them to pre-existing neuronal or glial networks that express the same innexin.</a> J. Neurosci. 32, 14265-14270 (2012).</li><li>Siddall, M. E., Trontelj, P., Utevsky, S. Y., Nkamany, M., Macdonald, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+molecular+data+demonstrate+that+commercially+available+medicinal+leeches+are+not+Hirudo+medicinalis.">Diverse molecular data demonstrate that commercially available medicinal leeches are not Hirudo medicinalis.</a> Proc. Biol. Sci. 274, 1481-1487 (2007).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

המטרה של קבוצה זו של ניסויים הייתה 1) ללמד ולהציג את עקרונות היסוד של הקלטות תאיים מתא עצב הניתן לזיהוי ו2) להכיר בצורות האופייניות של אותות חשמליים שיכול לנבוע מסוגים עצביים בפרט אלה באמצעות עלוקות מבוגרים. יש היסטוריה עשירה של חקירות באמצעות העלוקה לחקירות נוירופיזיולוגיות ומחקר מתמשך בהתמודדות עם שאלות של מעגלים עצביים וויסות הגנים במהלך התפתחות, כמו גם במהלך תיקון והתחדשות 10 הסינפטי. Neuromodulation, במיוחד דרך מסלולים האמינים ביוגני, הייתה גם כיוון מחקר מוצלח בעלוקה. על ידי הוספת דופמין וסוכנים תרופתיים אחרים למערכת העצבים דרך תמיסת מלח, זה כבר הוכיח כי דופמין מודולציה רשתות עצביות מעורבות ב23 ודפוסים מוטוריים לזחילת התנהגות 24,25 קבלת החלטות. גישה ניסויית זה היא פתיle דרך לשלב אפנון למעבדה ההוראה (ולא יקר), והתאמת האיפור היוני של תמיסת מלח היא דרך יעילה ללמד משוואות נרנסט וגולדמן הודג&#39;קין כץ. כדי להצליח עם הכנות הגנגליון חשוב לי הגנגליון מתוח לפני שתנסה לתקוע סומה עם אלקטרודה תאית. אחרת סומה תעבור כאשר דוחף כלפי מטה על מנות גליה. בנוסף, כאשר desheathing הגנגליון להסרת תאי עצב לתרבות, להימנע מהאזור של עניין, כאשר חוצה את הגנגליון כך somas אינם פגומים כפי שהם יוסרו. כמו כן, דגירה מוגזמת באנזימים עלולה לגרום לתאי העצב להיות שבירים מדי כדי להסירו. זה דורש קצת ניסוי וטעייה כדי להגיע לזמן דגירה אידיאלי כי כל מנה של אנזימים שונה במקצת במעשיהם. חקירה נוספת כדי לייעל את התקשורת והתרבות יכולה לשפר את הטכניקה הזו. ואריגורמים מפוקפקים, כגון הנוכחות של אינסולין, סוכרים, או גורמי גדילה יכולים להיבחן לתחזוקה ארוכה יותר של תרבויות. כדי לקבוע אם תאים לשמור על כושר שלהם כדי לסנתז משדרים, כגון סינתזת סרוטונין בתאי Rz, מכתים אדום ניטראלי יכול להיות מיושם על תווית תהליכי serotonergic. פלישה גם microglial לרקמה פגועה והתחדשות ניתן לכמת על ידי ימי כתמים גרעיניים לאחר פציעה. למרות שיש הכנה זו יתרונות רבים להציע בבחינת התחדשות ותיקון, כמו גם מעגלים עצביים, זיהוי התרופתי ומולקולרי של תת קולט השונים בסינפסות לא היה מאופיין במלואו. ספריית תג רצף הביעה נגיש 26, והגנום העלוקה הרפואי בימים אלה התאספו 27, אך המגבלה העיקרית בעלוקה בהשוואה לכמה הכנות מודל היא היכולת לשנות את הגנום לגנים סלקטיבית בתאים מסוגים מסוימים. בt עובריםהגבלתו טופלה על ידי הזרקת DNA או dsRNA לווסת ביטוי גנים 28. לאחרונה טכניקת אקדח הגן נעשתה שימוש כדי להביע connexin חסר חוליות (innexin) חלבונים בתאי עצב עלוקה. ביטוי של innexin מHirudo verbana (hve-inx6) מספיק להיווצרות של צמתים פער מחוץ לרחם בעלוקה הרפואית 29. העלוקה או המרפא H. ורבנה כפי שהיו 30 הוא בטוח כדי לקדם את הבנת הפיסיולוגיה והאבולוציה של סינפסות חשמליות בשנים הבאות שלנו.

הכנת העלוקה היא שימושית חוקר את הפונקציה של זיהוי, מוטורי (חושית ובין תאי עצב במערכת העצבים המרכזי של בעלי החיים (CNS). הרכוש שימושי של נוירונים עלוקה הוא שהצורה של פוטנציאל הפעולה שלהם ומאפייני biophysical אופייניות עבור נתנו סוג התא ניתן להסיר (כלומר P, N, T, Rz). נוירונים יתר על כן מבעלי החיים והתרבית במדיום מתאים שבו התאים לשמור על המאפיינים החשמליים שלהם במשך זמן רב ככל 45 ימים 1,2. יתרון בולט של הגנגליון העלוקה ללימוד איך לעשות קלטות אלקטרו הוא שתאים אופייני ובאמינות מסודר בגנגליון בצורה שמאפשרת זיהוי של סוגי תאים שונים מהגנגליון לגנגליון ומבעלי החיים לבעלי חיים. המיקום והמורפולוגיה של תאי עצב בגרעיני עלוקה הייחודיים צוינו על ידי Retzius כבר 1891 3. ידע של הזהות אלקטרוני ותפקוד של הנוירון הוא יתרון עבור חוקרים מעגלים עצביים ועל ביצוע ניסויים בסוג תא נתון. בשל somata הגדול יחסית של תאי העצב בתוך הגנגליון הם נראים עם מיקרוסקופ לנתח, וsomata יכול להיות משופד באופן סלקטיבי עם microelectrodes להקלטת התכונות החשמליים שלהם. צבעים ומולקולות גדולות יהיו ניתן להזריק לתוך תאים בודדים ומאפייני ערוץ שנחקרו על ידי מהדק תיקון. זרמים יוניים שיוצרים צורות השונות של פוטנציאל הפעולה האופייני בתאי עצב שונים זוהו 4-7. מחקירות בדפוס של עצבוב והסתעפות של נוירונים בודדים בתוך מערכת העצבים המרכזית, הקשרים סינפטיים שוחזרו בתרבות עם נוירונים שזוהו 2,8. מחקרים בגרעיני העלוקה סיפקו תובנה הפיתוח של מעגלים פונקציונליים שניתן למדוד עם אלקטרופיזיולוגיה, כמו גם עם וולדואר התנהגות בעלי חיים לימודים. CNS העלוקה כיהן גם כהכנה חשובה לחקר מנגנונים מעורבים עם תיקון עצבי והתחדשות בכל בעלי החיים ובתרבות 4-6,9-12. במוחם של יונקים הוא משימה מרתיעה כדי להסביר את ההתנהגות במונחים של התכונות וקשרים של נוירונים שזוהו פרט. באופן עקרוני אפשר לקוות שהמחקר של מערכות מורכבות פחות כגון העלוקה יכול לעזור להגדיר את המנגנונים בסיסיים המשמשים בבעלי חיים גבוהים יותר. הקשרים המשמשים שעומדים בבסיס דפוס לשחות 13,14 וקצביות של הלב 15 היו מאופיינים גם בעלוקה. היכולת של נוירונים מסוימים עלוקה כדי ליצור שתי תקשורת החשמלית וכימית היא מסקרן. קשרים חלקם דו כיוונית ואילו אחרים הם חד כיווני כימיים אבל כיוונית חשמלי 7. הבנת הקשרים סינפטיים בתוך בעלי החיים, כמו גם ליצור מחדש את אותו typדואר של חיבורים בצלחת תרבות הם כלים רבי עוצמה לחקירת synaptogenesis 16-18, כמו גם פרופיל תרופתי של סינפסות 19. טכניקות ההקלטה וגירוי תאיים המתוארות כאן לספק בסיס למבחנים תרופתיים ומחקר בneuroethology ופיתוח. בנוסף, חוט עצב הגחון המגזרי יכול להיות גזור עם פיסת עור מעוצבבים. עם היכולת לשמור על פיסת עור ותאי העצב בחיים, יכולים להיות נחקר שדות פתוחים חושיים על ידי הקלטת אותות חשמליים מהגוף התא (כלומר סומה) של נוירונים חושיים בתוך הגנגליון בטן המתאים במערכת העצבים המרכזית. וכך אפשר להעריך את הרגישות של הסופים חושיים על ידי יישום בדרגות שונות של כוח על העור ולמפות שדות פתוחים: מגע קל, לחץ, ורעיל (כואב) גירויים 20,21. יתרון של הכנת עור הגנגליון עלוקה זו הוא כי ca אחדn לצייר אנטומית את מפת השדה פתוחה ולעקוב אחר התהליכים עצביים לנוירון זיהה מייד את תגובות החשמל מתועדות. שלושה ניסויי העלוקה מתוארים להלן כולם יכולים להיות סיימו מספר פעמים עם דגימה אחת, מה שהופך את מודול הוראה זו עלות אפקטיבית למעבדות אקדמיות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="256">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td style="width:64px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:64px;">&#160;182 silicone kit</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;P9333&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C5670&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris/maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bleach&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>To chloride silver wire</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;221465&#160;</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">CULTURING MATERIALS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Collagenase/Dispase</td>
			<td>Boehringer Mannheim&#160;</td>
			<td>&#160;269-638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Leibovitz L-15 with L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>041-01415H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Ready Systems Ag&#160;</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">04-001</td>
		</tr>
		<tr height="102">
			<td height="102" style="height:102px;">D-Glucose-Monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gentamycin sulfate&#160;</td>
			<td>any&#160; supplier</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>043-0503H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3375</td>
			<td>Free acid, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Concanavalin A Type IV</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C 2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Poly-L-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P 7890</td>
			<td>MW 15-30,000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">&#160;Microwell plate, 60 x 10 &#956;l</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3034</td>
			<td>Flat bottom, 10 in a bag</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dissecting tools</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;assortment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Intracellular electrode probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc</td>
			<td>&#160;26001-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dissecting microscope (100X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fiber optic lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Small adjustable mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To direct light beam toward the preparation.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass electrodes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;CLS7095B5X</td>
			<td>Box of 200, Suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;MD4-M3-R</td>
			<td>&#160;Can fix for base or on a metal rod</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Raised preparation stand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Silver wire (10/1,000 inch)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>&#160;782500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Computer</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AC/DC differential amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PowerLab 26T</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>&#160;27T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Head stage</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Comes with AC/DC amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">LabChart7</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Electrical leads</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass tools&#160;</td>
			<td>make yourself</td>
			<td></td>
			<td>For manipulating nerves</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cable and connectors</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Pipettes with bulbs&#160;</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;13-711-7</td>
			<td>Box of 500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Beakers</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Wax or modeling clay</td>
			<td>any company or local stores</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Stimulator</td>
			<td>Grass Instruments</td>
			<td>SD9 or S88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;">Plastic tip for suction electrode</td>
			<td rowspan="2">local hardware store (Watt&#8217;s brand)</td>
			<td rowspan="2">&#188; inch OD x 0.170 inch ID</td>
			<td>Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intracellular recording, sensory field mapping, and culturing identified neurons in the leech, hirudo medicinalis

העלוקה המים המתוקים, Hirudo medicinalis, הוא אורגניזם מודל צדדי כי נעשה שימוש כדי לענות על שאלות מדעיות בתחומים של נוירופיזיולוגיה, neuroethology, וביולוגיה התפתחותית. מטרת דו&quot;ח זה היא לבסס את ניסיוני בטכניקות ממערכת העלוקה למאמר אחד שיהיה שימוש לפיזיולוגים עם מומחיות בהכנות מערכת עצבים אחרות, או לסטודנטים לביולוגיה עם ניסיון אלקטרופיזיולוגיה קטן או לא. אנו מדגימים כיצד לנתח את העלוקה להקלטת intracellularly ממעגלים עצביים שזוהו בגנגליון. הבא אנו מראים כיצד תאים בודדים של פונקציה ידועה ניתן להסיר מהגנגליון להיות מתורבת בצלחת פטרי, ואיך להקליט מאלו נוירונים בתרבית. ואז אנחנו מדגימים כיצד להכין פיסת עור מעוצבבים לשמש למיפוי שדות חושיים או מוטוריים. הכנות עלוקה אלה עדיין נמצאים בשימוש נרחב לטיפול בתכונות חשמליות בסיסיות של רשתות תקשורת עצביותKS, התנהגות, synaptogenesis, ופיתוח. הם גם מודול הכשרה מתאים למעבדות הוראת מדעי המוח או פיזיולוגיה.

הקלטות תאית מתא העצב חושי בגנגליון העלוקה מתאפיינות עקבות מתח זמנם ברורות שמוצגים באיור 4C. פוטנציאל קרום תא נח בתאי הגנגליון עלוקה בריאים הוא -45 ל-60 mV. אם פוטנציאלים הם (פחות שליליים) קטנים אחד צריך לשנות את אלקטרודת הזכוכית, או אם הפוטנציאל הוא עדיין נמוך, לעבור לחלק אחר של חוט העצב. פוטנציאל פעולה ספונטני עם משרעת קטנה עשוי להצביע על כך שהאלקטרודה היא בהנוירון מוטורי. אם זה קורה בקיר הגנגליון גוף הזרקה נוכחית יכולה לשמש כדי לקבוע אם תא העצב מעצבב את כל השרירים עדיין מחוברים לעור. נוירון ספינאה annulus המוטורי (AE) הוא בצד הגחון של גנגליון (איור 4) וזה יגרום לannuli (רכסים או מגזרים) לעלות על ידי הפעלת שריר ספינאה annulus. הזרקה נוכחית לתאי חישה צריכה לעורר פוטנציאל פעולהים עם צורות הגל האופייניים שמוצגים באיור 4C. אם הגל נראה שונה זה יכול להיות בגלל גשר לא מאוזן או פיצוי קיבול לקזז. יש להתייעץ במדריך שמלווה את יחידת רכישת אות לקבלת פרטים על איך לאזן את הגשר בתוך תא. שים לב לחפצי הגירוי בתחילת והסיום של פולסים הנוכחיים באיור 4C. כך החפצים נראים כאשר הגשר הוא מאוזן. תרבויות עיקריות של נוירונים מהגנגליון העלוקה יוצרות סינפסות חשמליות וכימיות בצלחת. בתחילה את התכונות חשמליות של התאים בתרבית הם לא בדיוק אותו דבר כמו שהם in vivo. עם זאת, לאחר כמה ימי הדחפים הם כמעט שאין להבחין בין אלו שנרשמו בגנגליון. זו באה לידי הביטוי באיור 6C עם זוג תאי Rz. לאחר 7 שעות בתרבות משרעת של פוטנציאלים סינפטיים הייתה 1-2 mV. לאחר 56 שעות בסאי תרבותפוטנציאלי naptic היו גדולים יותר מאשר 10 mV (עקבות עליונה באיור 6C). צורתו של פוטנציאל הפעולה משתנה גם לאחר 56hr בתרבות. בתנאים שתוארו תאים אלה הם בת קיימא במשך כמה ימים. תקשורת בין תאית ניתן להדגים על ידי גירוי שורש עצבים או connectives והקלטה מתא העצב בגנגליון. גירוי עצבים אלה יוצר פוטנציאל חזק סינפטי ופוטנציאל פעולה בתאי הגנגליון שונים. עקבות באיור 8B נרשמו מתא Retzius בגנגליון שהוסר מהחיה והצמיד את בצלחת. העקבות שחורות מעוררות על ידי גירוי התת מיושם עם אלקטרודה תאית לחיבור. הגדלת מתח הגירוי גרמה לתא לירות פוטנציאל פעולה (זכר אדום). ניתן להזריק ניאון צבעים או peroxidase צנון סוס לתוך תאים אלה ללמוד המורפולוגיה שלהם. הצהוב לוציפר הוזרק לRzנוירון על ידי העברת זרם שלילי באמצעות אלקטרודה. אלטרנטיבה היא להזריק את הצבע באמצעות נשיפות של לחץ אוויר. איור 9 א מציג את צבען זמן קצר לאחר ההזרקה התחילה. שלושים דקות לאחר מכן לצבוע כבר מתפזר לתוך שורשי עצבים (איור 9 ב). הסוג של צבע תלוי ביישום, צבעי משקל מולקולריים לדוגמא קטנות שיכול לעבור דרך צמתים פער משמשים לזיהוי סינפסות חשמליות. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig1.jpg" width="600px" /> איור 1. . נתיחת עלוקה הגחון () החיה הוא ניצח ביסודיות צד גחון בצלחת מרופדת אלסטומר מלא מלוח עלוקה חתך רדוד פורש הקדמי (ב &#39;):. ציר אחורי נעשה רק לרוחב קו האמצע כדי למנוע נזק לעצבים כבל. סינוס הדם השחור (שcontaiNS בקלות ניתן לראות את חוט עצב הגחון). שים לב לגנגליון נחשף אחד שהוא לבן בהשוואה לנדן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig2.jpg" width="600px" /> איור 2. Dissection של סינוס השחור. כלי הדם (חץ) יש לחתוך בזהירות בצד אחד כדי לחשוף את חוט עצב הגחון (חץ כפול). עזוב את הקטעים של כלי הדם שלמים סביב השורשים מגזרי לשימוש כידית כדי לתפעל את חוט עצב הגחון בעת העברה בין הנתיחה ומנות הקלטה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3"עבור: תוכן width = &quot;3in&quot; רוחב src = &quot;/ files/ftp_upload/50631/50631fig3.jpg&quot; = /&gt; &quot;400px&quot; איור 3. סעיף בודד של חוט עצב הגחון. הצמדת חוט עצב הגחון על ידי שברי כלי דם שנותרו על השורשים המגזריות ובקצות connectives המגזרי חושף את הגרעינים עבור קלטות אלקטרו. מתוח מתיחה של הגרעינים מאפשר לאדם לראות את גופי תא הניתנים לזיהוי ויאפשר חדירה קלה יותר של נדן גליה עם אלקטרודת זכוכית חדה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig4.jpg" width="600px" /> איור 4. האנטומיה סלולרית של הגנגליון העלוקה. (א) באופן אידיאלי תאי Retzius (R) וגופים אחרים גדולים תא (P-עיתונותיור, T-Touch, ספינאה N-nociceptive, AE-annulus) יהיה גלוי לעין אם מיקרוסקופ וקבל אור מוגדרים כראוי. (ב &#39;) בתצוגה סכמטית של תאים בגנגליון. הבדלים קלים במיקום של somas יתרחשו בכל גנגליון עקב איך הגנגליון נמתח והצמיד מתוח. יש פוטנציאלי פעולה (ג) נרשמו מסומה של הנוירונים האלה צורות גל אופייניות. קוצים אלה עוררו על ידי הזרקה נוכחית חיובי לתוך התא (הדופק המרובע שכיסה את עקבות מתח פעמית). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig4highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig5.jpg" width="600px" /> איור 5. Desheathing הגנגליון להסיר גופי תא בודדים. () נדן גליהיש לחתוך בזהירות מעבר לגנגליון, כדי למנוע פגיעה בתאים של עניין. הקו האדום מציין לחתוך כדי להימנע מפגיעת סומה של הנוירונים Rz. פתיחת הנדן נותנת אנזימי העיכול לגשת למטריצת רקמת חיבור. (ב) גופי תא בריאים הבולטים מחוץ לגנגליון לאחר נדן גליה כבר נפתח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig5highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig6.jpg" width="600px" /> תאי איור 6. Culturing נוירונים מהגנגליון העלוקה. () הם להישאף מגנגליון באמצעות micropipette והועברו לצלחת המכילה תקשורת ותרבות. (ב) הצבת מספר תאים סמוכים זה לזה יגדיל את שיעור synaptogenesis בין הנוירונים הניתנים לזיהוי. הנה סטוחברי פרלמנט של שני נוירונים יצרו סינפסה. (C) נוירונים בתערוכת תרבות תכונות חשמליות שונות במקצת. העקבות העליונים להראות פוטנציאלים סינפטיים עוררו על ידי גירוי תא 7 שעות הסמוכות ו56 שעות לאחר התאים היו מצופים. העקבות התחתונה היו מעוררות על ידי הזרקה נוכחית ישירות לתוך אחד תאי Rz. שים לב לעלייה במשרעת פוטנציאל הסינפטי ולשנות בצורת גל פוטנציאל הפעולה לאחר 56 שעות בתרבות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig6highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig7.jpg" width="600px" /> איור 7. קיר הכנת הגנגליון גוף העלוקה לשדות פתוחים מיפוי. () גישה אחת היא להסיר את הקטע שלם של קיר הגוף יחד עם 1-3 הגרעינים. כאן השורשים בצד אחד יש בלחתוך een וגנגליון כבר ניצח בחוץ בצד. (ב &#39;) ניצח את הגנגליון בהגדלה גבוהה יותר. (C) גישה נוספת היא ליצור חלון קטן בקיר הגוף והשיא מהגרעינים שלמים תוך מיפוי שדה פתוח . (DG) לכל אחד מתאי העצב התחושתיים מפגין תגובה אופיינית לגירוי מכאני. (ד &#39;) במגע קל מעורר פעילות בתאי T, אך לא בתאי P או N. (ה&#39;) בתגובת תא T מכבה בתגובה לחזקה יותר גירויים, נותן דרך הפעלה של תא P. כגירוי מקבל תאי N חזקים יותר הופך להיות פעיל (FG). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig7highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig8.jpg" width="600px" /> Figurדואר 8. עורר פעילות בגנגליון העלוקה. גירוי תאי של connectives ניתן להשתמש כדי לנהוג בשידור סינפטי בחוט העצב. (א) הדבר נעשה על ידי הצמדת האלקטרודה יניקה לאחד connectives והחלת מתח קטן. אלקטרודת הזכוכית החדה (חץ) ניתן לראות impaling תא Retzius בגנגליון. (ב) עקבות מתח בזמן מראים את חפץ הגירוי ואחריו הסינפטי פוטנציאלי (שחור) ופוטנציאל פעולה (אדום). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig8highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה גדולה יותר תמונה.</a> <img alt="איור 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig9.jpg" width="600px" /> איור 9. הזרקת צבע לתוך הנוירונים עלוקה. () צהוב לוציפר יהיה ניתן להזריק לתוך סומה ידי העברת thro הנוכחיאיכס microelectrode ההקלטה. מנורת כספית ולהגדיר מסנן FITC לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להמחיש את הקרינה. דיי (ב) יש מתפזר לתוך Rz אקסונים על 30 דקות לאחר ההזרקה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig9highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis at JoVE.com

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

מאמר זה מתאר שלוש הכנות מערכת עצבים באמצעות עלוקות: הקלטה תאית מהנוירונים בגרעיני הגחון, culturing נוירונים מגרעיני הגחון, והקלטה מתיקון של עור מעוצבבים למפה שדות חושיים.

תאית הקלטה, חושי שדה מיפוי, ונוירונים שזוהו Culturing בעלוקה, Medicinalis Hirudo</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

intracellular-recording-sensory-field-mapping-culturing-identified

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

19.5K Views.  University of Kentucky.  מאמר זה מתאר שלוש הכנות מערכת עצבים באמצעות עלוקות: הקלטה תאית מהנוירונים בגרעיני הגחון, culturing נוירונים מגרעיני הגחון, והקלטה מתיקון של עור מעוצבבים למפה שדות חושיים. 

Video: Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב Electroolfactogram

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

פלאש Photolysis של תרכובות כלואה צילה של עצב סנסורי חוש הריח

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

הקלטת פעילות חשמלי מתא העצב מזוהה במוח שלם של דג מהונדס

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

מדריך ל<em&gt; בשנת vivo</em&gt; הקלטה חד-יחידה מקליפת המוח המעכבת interneurons המזוהות Optogenetically

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.