1. Preparação de eletrodos e Solução Salina <ol><li> Prepare uma solução salina fisiológica e eléctrodos antes de o animal é dissecado. Solução de Ringer sanguessuga consiste do seguinte: NaCl 115,3 mM, 1,8 mM de CaCl2, KCl 4,0 mM, Tris 10 mM / ácido maleico ou HEPES. Ajustar o pH para 7,4. </li><li> Preparar um fio de Ag-Cl mergulhando um fio de prata limpos em uma pequena quantidade de lixívia de 20 min ou até que o fio tem um acabamento liso cinzento escuro. Lava-se a fios com água destilada antes de usar. Em seguida, coloque o fio em um suporte micropipeta que se conecta ao amplificador. </li><li> Prepare um eletrodo de vidro cortante de vidro de borosilicato usando um extrator pipeta. A resistência do eléctrodo deve ser da ordem de 20 mohms. </li><li> Backfill a pipeta com a solução de acetato de potássio 3 M e cole em no suporte da micropipeta. </li><li> Para um eletrodo extracelular preparar uma pipeta de vidro afiada como descrito acima, quebrar a ponta de volta poresfregando outra pipeta afiada perto da borda afiada. Então fogo polir a ponta para que ele não rasgue os conectivos. Eletrodos extracelulares de plástico também irá funcionar, desde que haja um bom contato entre o eletrodo eo nervo. </li><li> Insira o eletrodo extracelular gravação em um suporte micropipeta (com fio de Ag-Cl), que está equipado com um tubo de borracha e uma seringa para sucção. Usar a seringa para extrair solução salina no eléctrodo pelo menos ao nível do fio de prata. </li><li> Configure o hardware (amplificador e isolador de estímulo) e parâmetros de gravação de software, seguindo o manual da sua unidade de gravação de sinal específico. Veja Leksrisawat et al. 22 para ver os detalhes sobre os equipamentos utilizados nos experimentos descritos abaixo. </li></ol> 2. Ventral Ganglion Dissection <ol><li> Dissecar a sanguessuga em um grande silicone forrada de elastômero prato com solução de Ringer sanguessuga. Se o animal é esticada longitudinalmente que vaiser mais fácil remover o cordão nervoso ventral (ver Figura 1A). </li><li> Com N º 10 ou n º 11 tamanho bisturi, faça uma incisão longitudinal com cortes muito superficiais na linha média ventral. Sobre o meio 2/3rd do corte ventral é mostrado na Figura 1B. Tente não cortar a meia preta (o seio de sangue ventral) até que o animal está totalmente aberto eo seio de sangue é esticado, sem dobras. Este seio de sangue percorre todo o comprimento do animal ao longo da linha média ventral. O VNC está contido dentro deste vaso sangüíneo. </li><li> Após a pele foi cortada do comprimento total do animal use as tesouras finas a íris nick o seio do sangue (Figura 2). Deslize uma lâmina da tesoura de íris finas sob o seio e aumentar ligeiramente a lâmina para separá-lo do tecido nervoso. Cortar o seio do comprimento do VNC, evitando as raízes nervosas, nervos segmentares, ou conectivos entre gânglios. </li><li> Em seguida, remova parte do cordão nervoso ventral porcortando as raízes distais ao local onde o vaso sanguíneo se junta as raízes. Repetir este processo para cada gânglio ao longo do comprimento do cordão nervoso ventral. </li><li> Transferir um segmento de um ou dois gânglios a um menor placa de Petri. Os gânglios ou o único gânglio deve ser fixado tenso com alguma folga. </li><li> Pin os conectivos e as raízes para que a bainha gânglio glial é um pouco esticado para evitar que os corpos celulares dos neurônios de se movimentar quando espetando através da bainha glial e no neurônio de interesse. Os pinos devem ser colocados através do seio preto para as raízes e no meio dos dois conectores para minimizar os danos dos axónios (Figura 3). </li><li> Colocar a placa de Petri com uma preparação sob o microscópio e fixá-lo com cera no fundo do recipiente para impedir o movimento. </li><li> Cuidadosamente concentrar o feixe de luz através de um espelho e um condensador de luz para ver os neurónios, como na Figura 4A (esquematicamente mostrado na Figura 4B </strong&gt;). Repare nas duas grandes células Retzius no centro do gânglio. </li><li> Para fazer uma gravação intracelular do Rz, T, P e N neurónios, colocar cuidadosamente a ponta do eléctrodo sobre a célula de interesse e baixar suavemente a ponta até uma covinha é visto na bainha glial. </li><li> Toque porta-eletrodo ou manipulador (com muito cuidado), de modo que a ponta do eletrodo &quot;pops&quot; na célula de interesse. </li><li> Injectar pulsos curtos (30-40 ms) de corrente positiva (1-10 nA) para dentro da célula para provocar potenciais de acção. </li></ol> 3. Neurônios Cultivar do gânglio ventral Preparação <ol><li> Pin gânglios lado ventral para cima num prato limpo contendo G-15 com soro fetal de vitelo (FCS) (Figura 3). Pin as raízes para que os gânglios são um pouco esticado como foi feito acima para gravações intracelulares. Com uma tesoura fina, entalhe da cápsula da glia em uma extremidade, uma tesoura de deslizamento sob a lâmina da cápsula, em seguida, cortadas em toda a cápsula glialcomo mostrado na Figura 5A. </li><li> Adicionar 100 uL de aliquota de colagenase / Dispase para o prato e lugar num agitador durante 15 min. Examine as células movendo o meio de cultura em torno dos corpos celulares expostas. Retorne as células para o agitador por mais 15 minutos ou mais até que as células saem com sucção mínima. </li><li> Usar uma pipeta ligada a uma seringa para extrair suavemente as células a partir do gânglio. Fogo polir a ponta da pipeta de modo que é ligeiramente maior do que o diâmetro do corpo da célula. Para as células de Rz em um adulto de sanguessuga, o diâmetro deve ser de aproximadamente 50 mm. </li><li> Prepara-se uma variedade de pipetas com diferentes diâmetros, sem um filamento, tal como o que diminui as possibilidades de as células que furam para dentro da pipeta. Armazenar as pipetas num frasco contendo 80% de etanol (EtOH) com uma bola de algodão no fundo para proteger as pontas de lascar. Lembre-se de lavar o EtOH para fora da pipeta com o meio antes de aspirar as células. </li><li> Depois do tratamento enzimático, lavagem dameio com L-15 (com FCS) 2x contendo a enzima. Identificar as células de interesse e desenhá-los suavemente para dentro da pipeta puxando a seringa (Figura 6A). Descarga as células aspirados em um outro prato que contém L-15 (com FCS). </li><li> Até agora, todos os procedimentos eram não-estéril. Execute as seguintes etapas em uma capa estéril. Coloque 3-4 grandes gotas de estéril L-15 (com FCS) em diferentes locais dentro de uma placa de Petri estéril. </li><li> Pipetar as células para uma das gotas antes mencionados, soprando-os em torno da gota para lavá-los. Repetir esta em série em três ou quatro gotas de meio. </li><li> Colocar as células em uma placa de Petri limpa preenchido com L-15 (com FCS). </li><li> Incubar as células durante 1-24 horas à temperatura ambiente. Em seguida, as células limpas pode ser revestida. Ao deixar as células durante algumas horas ou durante a noite a matriz extracelular sai facilmente. Placa as células imediatamente para gerar processos mais longos. </li><li> Use substrato estéril para revestir uma microplaca di<html> sh e deixe-o secar completamente (durante a noite) antes de cultura experimentos. </li><li> Após o prato foi revestido, lava-se a louça suavemente com água estéril e em seguida, com uma pequena quantidade do meio L-15. Recorde usar a solução de G-15 sem FCS adicionado para permitir que as células aderem ao prato. O meio pode ser suavemente mudada de G-15 com FCS após as células terem aderido ao substrato. Se as células são para ser usadas algumas horas após o plaqueamento, o meio de interrupção, então a L-15 com FCS não é necessário. </li><li> Posicionar as células ao lado do outro no momento de plaqueamento para induzir sinaptogénese rápida (Figura 6B). Após 24 hr medida atividade fisiológica em pares de neurônios. </li><li> Use técnicas eletrofisiológicos intracelulares para gravar RP ou respostas sinápticas em pares em cultura de células (estimular um neurônio através de um eletrodo e gravar intracelulares respostas do celular emparelhado usando um eletrodo intracelular 2). </li></ol>título &quot;&gt; 4. gânglio-corpo parede Preparação <ol><li> Pin lado dorsal da sanguessuga para baixo num prato revestido de elastómero como descrito acima. </li><li> Pin a pele de um dos lados com raízes no outro lado do gânglio cortada (Figura 7A, ampliado na Figura 7B) ou fazer uma janela na face ventral da sanguessuga ao longo de um gânglio (Figura 7C), com todas as raízes para o organismo parede intacta. </li><li> Depois de obter uma gravação intracelular estável em uma das células sensoriais (T, P, N) usam um pequeno bastão de vidro que foi fogo polido para tocar levemente a pele no mesmo segmento. Se o neurónio a ser gravada a partir de uma célula é N então mais pressão terá de ser aplicado sobre a pele. Na maioria dos casos, a célula de N só irá responder se a pele é comprimida com uma pinça. Por esse motivo estas células devem ser tentados último como se poderia danificar a pele ou deslocar a recodificação intracelular por perturbar a preparação de uma tal maneira. </li><li> Deve-se tercapaz de esboçar rapidamente na pele e no gânglio com detalhes suficientes que um mapa do local onde uma tocado pode ser usado para determinar o campo de recepção para um neurónio particular. Depois de gravar a partir de tantas células quanto possível T e P em ambos os lados de um gânglio tentar as células N. </li><li> A fim de examinar se os neurônios sensoriais têm processos que percorrem os conectivos de uma maneira rostral ou caudal e, em seguida, as raízes do segmento adjacente à pele, os conectivos entre gânglios pode ser cortado e os campos receptivos reexaminados em relação ao propagação de detecção. Basicamente se está examinando se houve qualquer perda no campo receptivo. </li></ol> 5. Injetando fluorescente Corantes <ol><li> Preparar um gânglio sanguessuga como descrito acima. </li><li> Encher um microeléctrodo com uma solução de Lucifer amarelo-CH (3,0%) e cloreto de lítio (300 mM). </li><li> Empalar uma das células sensoriais ou células de Rz no lado ventral do gânglio como descritoacima. </li><li> Injectar corante para dentro da célula, passando a corrente negativa (3NA) através do eléctrodo, durante 15 min. Defina a duração do pulso de 100 ms ea freqüência de 2 Hz. </li><li> Visualize os neurônios cheios de corante por emocionante o corante com uma lâmpada de mercúrio e um conjunto de filtros FITC / GFP. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

O objectivo deste conjunto de experimentos foi de 1) para ensinar e expor os princípios fundamentais de gravações intracelular de neurônios identificáveis ​​e 2) a reconhecer as formas características de sinais elétricos que podem surgir a partir desses tipos de neurônios específicos usando sanguessugas adultos. Há uma rica história de investigações usando o sanguessuga para investigações neurofisiológicas e investigação está em curso para abordar questões de circuitos neurais e regulação de genes durante o desenvolvimento, bem como durante a reparação e regeneração sináptica 10. Neuromodulação, principalmente através de vias de aminas biogênicas, também tem sido uma direção da investigação, de sanguessuga. Pela adição de dopamina e outros agentes farmacológicos para o sistema nervoso através da solução salina, foi demonstrado que a dopamina modula redes neurais envolvidos em 23 e os padrões motores para rastrear 24,25 comportamento de tomada de decisão. Esta abordagem experimental é uma simple (e barata) maneira de incorporar a modulação para o laboratório de ensino, e ajustando a composição iônica da solução salina é uma forma eficaz de ensinar as equações de Nernst e Goldman-Hodgkin-Katz. Para serem bem sucedidas com as preparações ganglionares é importante para que o gânglio tenso antes de tentar a picar uma soma com um eléctrodo intracelular. Caso contrário, a soma vai passar quando empurrando para baixo o pacote glial. Além disso, quando o gânglio desheathing para a remoção de neurónios por cultura, evitar a região de interesse, quando o corte através do gânglio assim somas não são danificadas à medida que são removidos. Além disso, a incubação excessiva nas enzimas podem resultar nos neurónios ser demasiado frágil para ser removido. Ele requer alguma tentativa e erro para obter um tempo de incubação ideal porque cada lote de enzimas é ligeiramente diferente nas suas acções. Outras investigações para otimizar meios de cultura poderia melhorar esta técnica. Various factores, tais como a presença de insulina, de açúcares, ou factores de crescimento, pode ser examinada por um período de manutenção de culturas. Para determinar se as células a manter a sua capacidade de síntese de transmissores, tais como a síntese de serotonina em células Rz, de coloração de vermelho neutro pode ser aplicado para identificar processos serotonérgicos. Também a invasão da microglia tecido lesionado e regeneração pode ser quantificado por manchas nucleares dias após uma lesão. Embora esta preparação tem muitos benefícios a oferecer ao examinar a regeneração e reparação, bem como circuitos neurais, a identificação farmacológica e molecular dos vários subtipos de receptores nas sinapses não foram totalmente caracterizados. Uma biblioteca de tag seqüência expressa está disponível 26, e do genoma sanguessuga medicinal está sendo montado 27, mas a principal limitação na sanguessuga em comparação com alguns preparativos modelo é a capacidade de modificar o genoma de genes seletivos em tipos específicos de células. Em embriões tsua limitação foi abordada pela injeção de DNA ou dsRNA para regular a expressão do gene 28. A técnica arma gene foi recentemente usada para expressar conexina invertebrados (innexin) proteínas em neurônios sanguessuga. Expressão de uma innexin de Hirudo verbana (Hve-inx6) é suficiente para a formação de junções de hiato ectópica no sanguessuga medicinal 29. A sanguessuga medicinal ou H. verbena como se fosse 30 é certo para avançar nossa compreensão da fisiologia e evolução de sinapses elétricas ao longo dos próximos anos.

A preparação sanguessuga é útil para investigar a função de identificação (sensorial, motora e inter-neurónios no sistema nervoso central do animal (CNS). A propriedade útil dos neurónios sanguessuga é que a forma dos seus potenciais de acção e propriedades biofísicas são característicos para uma determinado tipo de célula (isto é, P, N, T, Rz). neurónios Além disso pode ser removido a partir do animal e cultivadas num meio adequado, no qual as células de manter as suas características eléctricas durante o tempo até 45 dias 1,2. A vantagem do gânglio sanguessuga para aprender a fazer gravações eletrofisiológicas é que as células são caracteristicamente e confiável dispostos no gânglio em um padrão que permite a identificação de tipos de células distintas do gânglio para gânglio e de animal para animal. A localização única e morfologia de neurônios em sanguessuga gânglios foram anotados por Retzius já em 1891 3. Conhecimento do the a identidade e função de um neurónio é vantajoso para investigar circuitos neurais e para fazer experiências com um determinado tipo de célula. Devido à relativamente grande somata dos neurónios dentro de um gânglio serem visíveis com um microscópio de dissecação, e a somata pode ser empalado selectivamente com microeléctrodos para gravar as suas propriedades eléctricas. Corantes e moléculas grandes podem ser injectados em células individuais e as propriedades do canal estudados por sujeição do emplastro. Correntes iónicas que dão origem às várias formas dos potenciais de acção característicos em diferentes neurónios foram identificadas 4-7. A partir de investigações no padrão de inervação e ramificações dos neurônios individuais dentro do CNS, as conexões sinápticas foram reproduzidas em cultura com os neurônios identificados 2,8. Os estudos em gânglios da sanguessuga forneceram uma visão sobre o desenvolvimento de circuitos funcionais que pode ser medido com a electrofisiologia, bem como com cordãe estudos do comportamento animal. A sanguessuga CNS também serviu como uma preparação valiosa para a investigação de mecanismos envolvidos com a reparação e regeneração neuronal em todo o animal e na cultura 4-6,9-12. Em cérebros de mamíferos é uma tarefa difícil para explicar o comportamento em termos de propriedades e conexões de neurônios identificados individuais. Em princípio, pode-se esperar que o estudo de sistemas menos complexos, como a sanguessuga pode ajudar a definir mecanismos básicos usados ​​em animais superiores. As ligações que são usados ​​que sustentam um padrão de mergulho e 13,14 ritmicidade do coração 15, têm sido bem caracterizadas na sanguessuga. A capacidade de alguns neurônios sanguessuga para formar tanto a comunicação elétrica e química é intrigante. Algumas conexões são bidirecionais, enquanto outras são unidirecionais quimicamente, mas bidirecional eletricamente 7. Compreender as conexões sinápticas dentro do animal, bem como a recriação da mesma type de conexões em um prato de cultura são ferramentas poderosas para investigar synaptogenesis 16-18, bem como perfis farmacológico das sinapses 19. As técnicas de gravação e de estimulação intracelulares descritos aqui fornecer uma base para ensaios farmacológicos e pesquisas em neuroethology e desenvolvimento. Além disso, o cordão nervoso ventral segmentar pode ser dissecada com um pedaço de pele inervados. Com a capacidade de manter um pedaço de pele e os neurônios vivos, campos receptivos sensoriais podem ser sondado por gravar os sinais elétricos do corpo celular (ou seja, soma) de neurônios sensoriais no respectivo gânglio abdominal no SNC. Deste modo, pode-se avaliar a sensibilidade das terminações sensoriais, aplicando diferentes graus de força sobre a pele e mapear campos receptivos: leve toque, pressão, e nocivos (doloroso) estímulos 20,21. Uma vantagem desta sanguessuga preparação gânglio-da pele é que um can desenhar anatomicamente o mapa do campo receptivo e traçar os processos neuronais para o neurônio identificado uma vez que as respostas elétricas estão sendo gravados. As três experiências sanguessuga descritos abaixo podem ser completado várias vezes com um único espécime, o que torna este um módulo de ensino de baixo custo para laboratórios acadêmicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="256">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td style="width:64px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:64px;">&#160;182 silicone kit</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;P9333&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C5670&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris/maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bleach&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>To chloride silver wire</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;221465&#160;</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">CULTURING MATERIALS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Collagenase/Dispase</td>
			<td>Boehringer Mannheim&#160;</td>
			<td>&#160;269-638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Leibovitz L-15 with L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>041-01415H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Ready Systems Ag&#160;</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">04-001</td>
		</tr>
		<tr height="102">
			<td height="102" style="height:102px;">D-Glucose-Monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gentamycin sulfate&#160;</td>
			<td>any&#160; supplier</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>043-0503H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3375</td>
			<td>Free acid, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Concanavalin A Type IV</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C 2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Poly-L-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P 7890</td>
			<td>MW 15-30,000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">&#160;Microwell plate, 60 x 10 &#956;l</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3034</td>
			<td>Flat bottom, 10 in a bag</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dissecting tools</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;assortment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Intracellular electrode probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc</td>
			<td>&#160;26001-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dissecting microscope (100X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fiber optic lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Small adjustable mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To direct light beam toward the preparation.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass electrodes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;CLS7095B5X</td>
			<td>Box of 200, Suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;MD4-M3-R</td>
			<td>&#160;Can fix for base or on a metal rod</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Raised preparation stand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Silver wire (10/1,000 inch)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>&#160;782500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Computer</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AC/DC differential amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PowerLab 26T</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>&#160;27T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Head stage</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Comes with AC/DC amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">LabChart7</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Electrical leads</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass tools&#160;</td>
			<td>make yourself</td>
			<td></td>
			<td>For manipulating nerves</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cable and connectors</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Pipettes with bulbs&#160;</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;13-711-7</td>
			<td>Box of 500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Beakers</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Wax or modeling clay</td>
			<td>any company or local stores</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Stimulator</td>
			<td>Grass Instruments</td>
			<td>SD9 or S88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;">Plastic tip for suction electrode</td>
			<td rowspan="2">local hardware store (Watt&#8217;s brand)</td>
			<td rowspan="2">&#188; inch OD x 0.170 inch ID</td>
			<td>Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intracellular recording, sensory field mapping, and culturing identified neurons in the leech, hirudo medicinalis

A sanguessuga de água doce, Hirudo medicinalis, é um organismo modelo versátil, que tem sido usado para tratar de questões científicas nos campos da neurofisiologia, neuroethology e biologia do desenvolvimento. O objetivo deste relatório é o de consolidar técnicas experimentais do sistema de sanguessuga em um único artigo que será de utilidade para os fisiologistas, com experiência em outras preparações do sistema nervoso, ou para estudantes de biologia, com pouca ou nenhuma experiência em eletrofisiologia. Demonstramos como dissecar a sanguessuga para gravação intracelular de circuitos neurais identificados no gânglio. A seguir, mostram como as células individuais de função conhecida pode ser removido a partir do gânglio a ser cultivadas numa placa de Petri, e como gravar a partir desses neurónios em cultura. Então nós demonstrar como preparar um pedaço de pele inervada a ser utilizado para o mapeamento de campos sensoriais ou motoras. Estas preparações sanguessuga ainda são amplamente utilizados para tratar as propriedades elétricas básicas de networ neuralks, comportamento, sinaptogênese e desenvolvimento. Eles também são um módulo de formação adequada para a neurociência ou fisiologia laboratórios de ensino.

Gravações intracelulares de neurónios sensoriais do gânglio da sanguessuga são caracterizados pelos seus traços de tempo de tensão distintas mostradas na Figura 4C. O potencial de repouso da membrana celular em células ganglionares da sanguessuga saudáveis ​​é -45 para -60 mV. Se potenciais são menores (menos negativo) deve-se mudar o eletrodo de vidro, ou se o potencial ainda é baixo, passar para outro segmento do cordão nervoso. Potenciais de ação espontânea, com pequena amplitude pode indicar que o eletrodo está em um neurônio motor. Se isto acontece na parede do corpo de um gânglio-injecção de corrente pode ser utilizado para determinar se o neurónio inerva qualquer dos músculos ainda ligado à pele. O neurônio motor anel montador (AE) está no lado ventral do gânglio (Figura 4B) e vai fazer com que a anéis (sulcos ou segmentos) a subir pela ativação do músculo eretor anel. A injeção de corrente para as células sensoriais deve evocar potencial de açãos com as formas de onda característicos mostrados na Figura 4C. Se as formas de onda de um aspecto diferente que poderia ser devido a uma ponte desequilibrado ou compensação de capacitância offset. Deve-se consultar o manual que acompanha a unidade de aquisição de sinais para obter detalhes sobre como equilibrar a ponte dentro de uma célula. Observe os artefatos de estímulo no início e no fim dos pulsos de corrente na Figura 4C. Esta é a forma como os artefatos olhar quando a ponte está equilibrada. As culturas primárias de neurônios do gânglio sanguessuga formar sinapses elétricas e químicas no prato. Inicialmente as propriedades elétricas das células em cultura não são exatamente o mesmo que eles estão em vivo. No entanto, depois de alguns dias, os impulsos são quase indistinguíveis dos registrados no gânglio. Isto é demonstrado na Figura 6C com um par de células de Rz. Depois de 7 horas na cultura da amplitude de potenciais sinápticos foi de 1-2 mV. Após 56 h em cultura sypotenciais naptic eram maiores do que 10 mV (traços principais da Figura 6C). A forma do potencial de acção também muda depois 56hr em cultura. Sob as condições descritas estas células são viáveis ​​durante vários dias. Comunicação intercelular pode ser demonstrado por estimular as raízes nervosas ou conectivos e gravar a partir de neurônios do gânglio. Estimulando estes nervos gera potenciais sinápticos robustos e potenciais de ação em células ganglionares diferentes. Traços na Figura 8B foram registados a partir de uma célula de um gânglio Retzius em que tinha sido retirado do animal e fixado num prato. O traço preto foi evocado por um estímulo subliminar aplicado com um eletrodo extracelular para o conjuntivo. Aumentando a tensão estímulo causado a célula para disparar um potencial de ação (traço vermelho). Corantes ou peroxidase de raiz forte fluorescente pode ser injetado essas células para estudar a sua morfologia. Lúcifer amarelo foi injectada uma Rzneurônio passando uma corrente através do eletrodo negativo. Uma alternativa consiste em injectar o corante utilizando sopros de pressão de ar. Figura 9A mostra o corante pouco depois da injecção começou. Trinta minutos mais tarde, o corante já tinha migrado para as raízes nervosas (Figura 9B). O tipo de corante depende da aplicação, por exemplo, corantes pequenos pesos moleculares que podem passar através de junções de hiato são utilizados para identificar as sinapses eléctricas. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. . Dissecção sanguessuga ventral (A) O animal é completamente preso lado ventral para cima em um prato forrado de elastômero preenchido com sanguessuga salina (B) A incisão pouco profunda que abrange o anterior:. Eixo posterior é feita imediatamente lateral à linha média, para evitar danificar o nervo cabo. O seio sangue negro (que contains o cordão nervoso ventral) pode ser facilmente visto. Note-se a um gânglio exposto que é branca em comparação com a bainha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Dissecção do seio preto. O vaso sanguíneo (seta) deve ser cuidadosamente cortada de um lado para expor o cordão nervoso ventral (seta dupla). Deixe segmentos da embarcação de sangue intactas ao redor das raízes segmentares para uso como um identificador para manipular o cordão nervoso ventral durante a transferência entre dissecção e pratos de gravação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3"fo: content-width = &quot;3 pol&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50631/50631fig3.jpg&quot; width = &quot;400px&quot; /&gt; Figura 3. Secção isolada do cordão nervoso ventral. Fixando o cordão nervoso ventral por os fragmentos de vaso sanguíneo restantes sobre as raízes segmentares e nas extremidades dos conectivos segmentares expõe os gânglios para registos electrofisiolicos. A tenso alongamento dos gânglios permite ver os corpos celulares identificáveis ​​e permitirá uma mais fácil penetração da bainha glial com um eletrodo de vidro afiada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. Anatomia celular do gânglio sanguessuga. (A) O ideal é que as células Retzius (R) e de outros organismos de células grandes (P-imprensaure, T-touch, N-nociceptiva, instalador AE-anel) será claramente visível se o microscópio e condensador de luz estão configurados corretamente. (B) Representação esquemática de células no gânglio. Ligeiras diferenças na localização das somas ocorrerá em cada gânglio devido à forma como o gânglio é esticado e preso tenso. Potenciais (C) Ação gravadas da soma desses neurônios têm formas de onda característicos. Estes picos foram evocados pela injeção de corrente positiva para dentro da célula (pulso quadrado sobrepondo os traços em tempo de tensão). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig5.jpg" width="600px" /> Figura 5. Desheathing gânglio para remover corpos celulares individuais. (A) A bainha glialdevem ser cuidadosamente cortadas em todo o gânglio para evitar danificar as células de interesse. A linha vermelha indica um corte para evitar bater a soma dos neurônios Rz. Abrindo a bainha dá as enzimas digestivas acessar a matriz de tecido conjuntivo. (B) os corpos celulares saudáveis ​​saltados para fora do gânglio após a bainha glial foi aberto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig6.jpg" width="600px" /> Figura 6. Cultivar neurónios do gânglio da sanguessuga. (A) As células são aspirados a partir do gânglio usando uma micropipeta e transferido para uma placa contendo meio de cultura. (B) Colocar várias células próximas uma da outra irá aumentar a taxa de sinaptogénese entre neurónios identificáveis. Aqui o stumps de dois neurônios formaram uma sinapse. (C) Os neurônios em cultura exposição ligeiramente diferentes propriedades elétricas. Os melhores traços mostram potenciais sinápticos evocados por estimulação da célula adjacente 7 horas e 56 horas após as células foram plaqueadas. Os traços de fundo foram evocados pela injeção de corrente diretamente em uma das celas Rz. Observe o aumento da amplitude do potencial sináptico e mudar no potencial de ação de forma de onda após 56 horas em cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig7.jpg" width="600px" /> Figura 7. A sanguessuga gânglio-corpo preparação de parede para o mapeamento de campos receptivos. (A) Uma abordagem é para remover uma seção inteira da parede do corpo, juntamente com 1-3 gânglios. Aqui as raízes de um lado têm bcorte een eo gânglio foi preso para o lado. (B) Um preso fora gânglio em maior ampliação. (C) Outra abordagem é a criação de uma pequena janela na parede do corpo e gravar a partir dos gânglios intacta, enquanto o mapeamento de um campo receptivo . (DG) Cada um dos neurônios sensoriais exibe uma resposta característica a um estímulo mecânico. (D) Um leve toque evoca atividade nas células T, mas não em P ou N células. (E) A resposta das células T desliga em resposta à forte estímulos, abrindo caminho para a ativação da célula P. À medida que o estímulo se fortalece as células N torna-se ativado (FG). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig7highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig8.jpg" width="600px" /> Figure 8. Evoked actividade no gânglio da sanguessuga. estimulação extracelular dos conectivos pode ser utilizado para dirigir a transmissão sináptica no cordão nervoso. (A) Isto é feito ligando um eléctrodo de sucção de um dos conectivos e aplicando uma pequena tensão. O eletrodo de vidro cortante (seta) pode ser visto espetando uma célula Retzius no gânglio. (B) os traços de tensão em tempo mostrando o artefato de estímulo seguido por um potencial sináptico (preto) e um potencial de ação (vermelho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig8highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ampliar imagem</a> . <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig9.jpg" width="600px" /> Figura 9. Injetando corante nos neurônios sanguessuga. (A) Lucifer amarela pode ser injetada no soma passando corrente through o microeletrodos gravação. A lâmpada de mercúrio e conjunto de filtros FITC pode então ser usado para visualizar a fluorescência. (B) Dye tem difundido na Rz axônios cerca de 30 minutos após a injeção. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig9highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

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Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Este artigo descreve três preparações do sistema nervoso usando sanguessugas: gravação intracelular de neurônios no gânglio ventral, cultivando neurônios do gânglio ventral, e gravar a partir de um pedaço de pele inervados para mapear campos sensoriais.

Intracelular de gravação, Sensorial Campo Mapping, e cultivando neurônios identificados nos Sanguessuga, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

intracellular-recording-sensory-field-mapping-culturing-identified

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

19.5K visualizações.  University of Kentucky.  Este artigo descreve três preparações do sistema nervoso usando sanguessugas: gravação intracelular de neurônios no gânglio ventral, cultivando neurônios do gânglio ventral, e gravar a partir de um pedaço de pele inervados para mapear campos sensoriais. 

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Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Respostas análise de rato Olfactory neurônios sensoriais Usando a gravação Electroolfactogram Air fase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Neurociência

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Live-imagem de translocação da PKC em células Sf9 e em neurônios sensoriais Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

De gravação simultânea de sinais de cálcio dos neurônios identificados e comportamento alimentar de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Registro da atividade elétrica dos neurônios identificados no cérebro intacto de peixes transgénicos

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Monte todo imunomarcação de Neurônios Receptores Olfatórios no<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Um Guia para<em&gt; In vivo</em&gt; Gravação única unidade de Optogenetically Identificado Cortical Inibitória Interneurônios

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em