המחברים רוצים להכיר איגוד לב האמריקאי הלאומי מדען הפיתוח גרנט (10SDG2600001), סטנפורד Bio-X הבינתחומי יוזמת תכנית, וחוקרי הרפואה של אוניברסיטת סטנפורד תכנית מחקר למימון.

1. פולימר סינתזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף, לשקול את 3,523 מ&quot;ג של diacrylate butanediol (C) ולהעביר לבקבוקון נצנץ זכוכית המכיל בר ומערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חום 5-אמינו-1-pentanol (32) ל90 ° C לsolubilize מלח, ולאחר מכן במנדף, לשקול את 1,533 מ&quot;ג 32 ולהוסיף לבקבוקון הנצנץ המכיל ג שיטה זו תגרום ליחס טוחנת של C: 32 = 1:1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד מניח את הבקבוקון המכיל את שני הפתרונות על גבי צלחת ומערבבים. הגדר את מהירות ומערבבים ב600 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את בקבוקון הנצנץ לתנור ב90 ° C. מהירות ערבוב מוגדר 1,000 סל&quot;ד במשך 4 שעות. אם בר והמערבב נתקע, להנמיך את המהירות. לאחר 4 שעות, מהירות נמוכה יותר כדי 300 סל&quot;ד ולשמור על 90 מעלות צלזיוס עוד שעה 12-16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 גרם של C32 ל10 מיליליטר של tetrahydrofuran נטול מים (THF) בבקבוקון נצנץ זכוכית המכיל בר ומערבב. עוטף בנייר כסף ועל מערבולת גבוהה עד שהיא נמסה באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בconta בקבוקון נצנץ זכוכית נפרדining בר ומערבב, מוסיף 10 מ&quot;מ של Tetraethyleneglycoldiamine (122). הוסף 40 מיליליטר של THF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שני הבקבוקונים (C32 ו122) על צלחת ומערבבים במשך 5 דקות לאחר מכן לשלב ביחד. כסה בנייר כסף ומשאיר בטמפרטורת חדר תוך ערבוב ב400 סל&quot;ד 24 שעות. המוצר הסופי נקרא C32-122. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 5 x 50 צינורות מיליליטר פלקון עבור כל אצווה 5 גרם של C32-122. שים לב למסה של כל צינור במחברת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 30 מיליליטר של אתר diethyl נטול מים לכל צינור פלקון 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 10 מיליליטר של C32-122 לכל צינור פלקון 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות פלקון וורטקס במרץ אז צנטריפוגות ב 2,500 סל&quot;ד במשך 2 דקות. הערה: הפולימר המופק יאסוף בבסיס של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הפתרון העליון וחזור על שלבים 1.9 ו1.11 עוד פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות הפתוחים המכילים C32-122 חולצו בייבוש וואקום הלילה. ודא כי כל הצינורות מוגנים מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את כל הצינורות המכילים C32-122 כדי לקבוע את המסה הסופית שלפולימר שחולץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את הפולימר המופק בDMSO נטול מים בריכוז של 100 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הפולימר המומס ב -20 ° C המוגנים מפני אור ולחות. </li></ol> 2. זריעת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מעיל הבסיס של בקבוק תרבות רקמת T-150 עם ג&#39;לטין 0.1% (wt / כרך). ג&#39;לטין צריך להישאר בבקבוק במשך 30-45 דקות. ציפוי ג&#39;לטין עוזר הידבקות של ADSCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;לטין לשאוב מהבקבוק T-150 המצופה מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 x 10 6 ADSCs (≤ קטע 3) לבקבוק ב20 מיליליטר של DMEM המכיל 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו10 ng / ml bFGF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את בקבוק T-150 בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתחיל בהליך transfection ביום המחרת. </li></ol> 3. Nanoparticle הכנה וTransfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההליך הבא הוא עבור ההכנה של חלקיקים המכילים DNA פלסמיד 16.1 מיקרוגרם ל1.0 x 10 6 תאים בפולימר לפלסמיד יחס משקל של 30:1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פלסמיד דנ&quot;א (1 מ&quot;ג / מיליליטר, pVEGF165, Aldevron, ND, ארה&quot;ב) לריכוז סופי של 120 מיקרוגרם / מיליליטר בנתרן אצטט (25 מ&quot;מ) בצינור פלקון 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל C32-122 (100 מ&quot;ג / מיליליטר) לריכוז סופי של 3.6 מ&quot;ג / מיליליטר בנתרן אצטט (25 מ&quot;מ) בצינור פלקון שני 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב את התוכן של כל צינורות פלקון לתוך צינור אחד 15 מיליליטר בז ומערבולת באופן מיידי על גבוה עבור 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הצינור לשבת בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות להיווצרות nanoparticle להתרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד דוגרים, להחליף בינוני בבקבוק תרבות רקמות עם DMEM בתוספת 7.8 מיליליטר מלא ל1.0 x 10 6 תאים transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את פתרון nanoparticle לבקבוק תרבית הרקמה ולהטות קדימה ואחורה כדי להתפשט באופן שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הבקבוק בתרבית רקמה בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שעות, החלף את nanoparticle מכיל תקשורת עם DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות דגירה 2 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, התאים מוכנים in vivo הזרקה. </li></ol> 4. Hindlimb איסכמיה נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות אוניברסיטת סטנפורד הטיפול בבעלי חיים ועדת שימוש ופרוטוקולי APLAC אושרו. יצירת המודל העכברי של איסכמיה hindlimb מתבצע כפי שתואר לעיל. 8 אנא עיינו בהתייחסות להוראות מפורטות. תיאור קצר מסופק בהמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר תחת הרדמה עם 1-3% isoflurane מינון על ידי שאיפה וקצב זרימת חמצן של 1 ליטר / דקה. ודא עומק הרדמה על ידי קמצוץ הבוהן, ירידה בקצב נשימה, ועייפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר שיער מאזור הבטן ושני אזורי hindlimb של העכבר עם קצף גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך במרכז המדיאלי ירך לכיוון קו האמצע ולאחר מכן חתך את כרית שומן שמעליה לשעברלהוות עורק הירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולקשור את העורק בשני אתרים: אתר הדיסטלי (קרוב לברכיים) ואתר הפרוקסימלי (דיסטלי רק לרצועה מפשעתי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור ligations, להפריד את העורק מהווריד וחוט תפר משי 5-0 סביב העורק. לקשור את העורק עם שני קשרים כדי להפוך את קשירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העורק בין שתי נקודות קשירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את אזור הניתוח עם PBS ולאחר מכן תפר את החתך נסגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן להסיר בהרדמה עכשיו. שמור חם העכבר עד ההתעוררות מחודשת. לטיפול שלאחר ניתוח, ניתן להזריק 2-4 מ&quot;ג / קילוגרם לידוקאין תת עורי באתר החתך לפני מחדש התעוררות. ניהול כאב נוסף עשוי לכלול משלוח תת עורית של 0.05-0.1 מ&quot;ג / קילוגרם עצירות ב12 ו24 שעות. לנטר את מצב בריאותם של העכברים פעם ביום למשך שבעה ימים על ידי התבוננות שינויים בדפוס נשימה, כאב או מצוקה גלוי, וצבע עור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר איסכמיה hindlimb ידי ההדמיה זלוף דופלר לייזר.</li></ol> 5. זריקות תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאי transfected והעכברים מוכנים, לשטוף תאי transfected עם PBS, trypsinize, צנטריפוגה, ולאחר מכן לספור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים בצפיפות של 10 x 10 6 תאים למ&quot;ל ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיות תא צריכה להיות מופרדות לתוך צינורות Eppendorf נפרדים בהיקף של 110 μl. זה יבטיח כי כל עכבר מקבל כמות שווה של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל עכבר תחת הרדמה (isoflurane 2.5%, קצב זרימת L 1 / חמצן דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את אזור ההזרקה עם מגבוני אלכוהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניצול מזרק טוברקולין 27 G, לצייר את התאים למעלה ולמטה לתוך המזרק כדי להבטיח השעיה הומוגנית מושגת. צייר את תא ההשעיה הנפח 100 μl לתוך המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק מחצית ההשעיה התא לאזור השרירים adductor ואז מזריק את החצי השני לאזור שריר שוק. לאחר הזרקה, השאר את המזרק במקום לפחות 15-30 שניות ללמנוע דליפה של ההשעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרות נאותות למחקר בבעלי החיים כוללות: 1) תאים transfected עם פלסמיד ללא קידוד (למשל פלסמיד ללא פעילות ביולוגית); 2) תאים לבד: 3) PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר זריקות הושלמו, הסר את העכבר מההרדמה ולהתחמם עד מחדש Awakes העכבר. </li></ol> 6. הדמיה פליטת אור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל הדמיה פליטת אור (BLI), להרדים עכברים כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את אזור ההזרקה עם מגבוני אלכוהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק ניצול אינסולין, 15 D-וציפרין מ&quot;ג / מיליליטר (המצע לגחלילית בלוציפראז) עומס 100 μl. שמור על מצע מהאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע זריקות intraperitoneal, להחזיק עכברים בעור הגב שלהם כדי למשוך את העור הקדמי שלהם מתוח. הכנס מחט intraperitoneally לאזור הבטן ולהזריק של מצע 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר בחדר ההדמיה לוציפראז IVIS תחת הרדמה. </li><li&gt; תמונת העכברים עם זמן חשיפה של 1.0 דקות. כאשר פרמטרים מוגדרים, להתחיל לרכוש תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התמונה שנרכשה, לסמן את האזור של עניין על מנת למדוד את אות לוציפראז. במקרה זה, תסמן את איבר איסכמי באתר תא ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך למדוד את אות לוציפראז כל דקות 3-5 עד האות מגיע לשיא ומתחיל לרדת. זהו הערך מנוצל להשוואה על פני עכברים ועל פני כמה נקודות זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר יושלמו, להסיר את העכברים מהאולם וההרדמה. שמור על עכברים חמים עד ההתעוררות מחודשת. </li></ol> 7. לייזר דופלר זלוף הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההדמיה זלוף דופלר הלייזר מתבצעת כפי שתואר לעיל. 8 ההליך מתואר כאן בקצרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני דופלר הדמיה העכבר צריך להיות נקי ומגולח באזורים שמעל שניהם hindlimbs ואזור הבטן כדי למנוע חפץ בשל שיער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשהכין לתמונת דופלר, mouצריך להיות מורדם se כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את העכבר כדי 36 ° C על צלחת חמה תוך ניטור טמפרטורת גוף על ידי מדחום רקטלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר על משטח שחור שאינו רעיוני ולשמור בהרדמה על ידי חרטום. העכבר צריך להיות ממוקם על פני השטח הגבי שלה עם איבריה החשופים באופן שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את חיישן הלייזר דופלר בערך 15 ס&quot;מ מעל העכבר ולכוון את מצביע הלייזר מהחיישן כלפי אזור המפשעה של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר סמן העכבר וחיישן דופלר נמצאים בעמדה, ניתן למצוא תמונות של ניצול תוכנת LDPIwin ידי לחיצה על הכפתור &#39;התחל&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידות זלוף יחסית יכולים להילקח על ידי המצביע על שתי hindlimbs (איסכמי וללא איסכמי) כאזור של אינטרסים (ROI). היחס של זלוף הממוצע של איסכמי לhindlimb אינו איסכמי יציין זלוף היחסי. </li></ol> 8. רקמת קציר נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוכן tis עכבר קצירלתבוע היסטולוגיה ו / או עיבוד ביוכימיים, צריך להיות מורדמים בעכבר. הנה, את העכבר הוא מורדמים על ידי החשיפה לisoflurane 5% ל3-5 דקות, ולאחר מכן הרדמת חסד העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העור שמעל מקיף את hindlimb circumferentially באזור הדיסטלי הבטן ופרוקסימלי לhindlimb. העור נחתך מהגחון למשטחי הגב, כך שהעור יכול להיות אסוף מעל hindlimb לכף הרגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מושך את עור גב, הגפיים יכולים להיות קטועים על ידי ניצול מספריים לנתיחה בוטים לחתוך במפרק האגן וירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתי רקמות עיקריות נלקחות לניתוח: שרירי adductor המדיאלי ושרירי הגסטרוקנמיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדיקת רקמות, כדי לשבץ את הרקמות אחת או בשתי בטמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) לcryosectioning. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאנליזה ביוכימית, לאסוף רקמות אחד או שני למיליליטר Eppendorf 1.5 ולצלול לתוך אמבט של חנקן נוזלי לפחות 2 דקות. הדגימות יכולות להיותמאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס במשך עיבוד עתיד. </li></ol>

<ol>
	<li>Deveza, L., Choi, J., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+angiogenesis+for+treating+cardiovascular+diseases.">Therapeutic angiogenesis for treating cardiovascular diseases.</a> Theranostics. 2, 801-814 (2012).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+stem+cells+for+enhanced+angiogenesis+using+biodegradable+polymeric+nanoparticles.">Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3317-3322 (2010).</li><li>Mangi, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+modified+with+Akt+prevent+remodeling+and+restore+performance+of+infarcted+hearts.">Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts.</a> Nat Med. 9, 1195-1201 (2003).</li><li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+bone+healing+based+on+ex+vivo+gene+therapy+using+human+muscle-derived+cells+expressing+bone+morphogenetic+protein+2.">Enhancement of bone healing based on ex vivo gene therapy using human muscle-derived cells expressing bone morphogenetic protein 2.</a> Hum. Gene Ther. 13, 1201-1211 (2002).</li><li>Park, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+may+be+uniquely+suited+for+combined+gene+therapy+and+cell+replacement:+Evidence+from+engraftment+of+Neurotrophin-3-expressing+stem+cells+in+hypoxic-ischemic+brain+injury.">Neural stem cells may be uniquely suited for combined gene therapy and cell replacement: Evidence from engraftment of Neurotrophin-3-expressing stem cells in hypoxic-ischemic brain injury.</a> Exp. Neurol. 199, 179-190 (2006).</li><li>Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+polymer+library+approach+yields+insight+into+nonviral+gene+delivery.">A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery.</a> Acc Chem Res. 41, 749-759 (2008).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+human+adult+and+embryonic+cell-derived+stem+cells+using+biodegradable+nanoparticulate+polymeric+vectors.">Gene delivery to human adult and embryonic cell-derived stem cells using biodegradable nanoparticulate polymeric vectors.</a> Gene Ther. 16, 533-546 (2009).</li><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+hindlimb+ischemia.">Murine model of hindlimb ischemia.</a> J. Vis. Exp. , e1035 (2009).</li><li>Ceradini, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cell+trafficking+is+regulated+by+hypoxic+gradients+through+HIF-1+induction+of+SDF-1.">Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1.</a> Nat. Med. 10, 858-864 (2004).</li><li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+of+mesenchymal+stem+cell+tropism+for+tumor+and+wounding+microenvironments+using+in+vivo+bioluminescent+imaging.">Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging.</a> Stem Cells. 27, 2614-2623 (2009).</li><li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+end-groups+of+linear+polymer+determine+cell-type+gene-delivery+efficacy.">Small-molecule end-groups of linear polymer determine cell-type gene-delivery efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947-4951 (2009).</li><li>Sunshine, J. C., Akanda, M. I., Li, D., Kozielski, K. L., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+base+polymer+hydrophobicity+and+end-group+modification+on+polymeric+gene+delivery.">Effects of base polymer hydrophobicity and end-group modification on polymeric gene delivery.</a> Biomacromolecules. 12, 3592-3600 (2011).</li><li>Lynn, D. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradable+poly(&#946;-amino+esters):+Synthesis,+characterization,+and+self-assembly+with+plasmid+DNA.">Degradable poly(&#946;-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).</li><li>Eltoukhy, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+molecular+weight+of+amine+end-modified+poly(beta-amino+ester)s+on+gene+delivery+efficiency+and+toxicity.">Effect of molecular weight of amine end-modified poly(beta-amino ester)s on gene delivery efficiency and toxicity.</a> Biomaterials. 33, 3594-3603 (2012).</li><li>Glover, D. J., Lipps, H. J., Jans, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+safe,+non-viral+therapeutic+gene+expression+in+humans.">Towards safe, non-viral therapeutic gene expression in humans.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 299-310 (2005).</li><li>Dave, U. P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+insertional+mutagenesis+insights.">Gene therapy insertional mutagenesis insights.</a> Science. 303, 333 (2004).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנו מדווחים שיטה לתכנת תאי גזע בוגרים לביטוי יתר גורמים טיפוליים באמצעות חלקיקים שאינם נגיפיים, מתכלים. פלטפורמה זו שימושית במיוחד לטיפול במחלות בו תאי גזע באופן טבעי יכולים בבית, כגון איסכמיה וסרטן. 9-10 כמו כן, פלטפורמת מסירת הגן אינו נגיפית מאפשרת לביטוי י...

המטרה הכללית של טכניקה זו היא לקדם אנגיוגנזה הטיפולית שימוש בתאי גזע שאינו באופן ויראלי מתוכנת ביתר גורמים טיפוליים באתר של איסכמיה. תאי גזע שונו vivo לשעבר ראשון באמצעות חלקיקים מתכלים מסונתזים במעבדה, ולאחר מכן הושתלו במודל עכברי של איסכמיה hindlimb כדי לאמת את הפוטנציאל שלהם לשיפור אנגיוגנזה והצלה רקמות. צמיחת כלי דם נשלט היא מרכיב חשוב של התחדשות רקמות מוצלחת, כמו גם לטיפול במחלות איסכמי שונים, כגון שבץ, איסכמיה איבר, ואוטם שריר הלב. מספר אסטרטגיות פותחו כדי לקדם את הצמיחה של כלי דם, כוללים משלוח גורם גדילה וטיפול מבוסס תאים. 1 למרות היעילות שנצפתה במודלים של בעלי החיים המחלה, שיטות אלה עדיין עומדות בפני מגבלות כגון צורך במינוני supraphysiological למסירת גורם גדילה, או לא מספיק אוטוקרינילשחרר על ידי תאים בלבד. אסטרטגיה פוטנציאלית אחד כדי להתגבר על המגבלות הנ&quot;ל היא לשלב טיפול בתאי גזע וריפוי גנטי, לפיה תאי גזע מתוכנתים גנטי vivo לשעבר לפני השתלה לביטוי יתר גורמים טיפוליים רצויים. גישה זו באה לביטוי במודלים של מחלה שונות, כולל hindlimb איסכמיה 2, מחלות לב 3, ריפוי עצם 4 ופגיעה עצבית 5, וכו &#39;. עם זאת, רוב טכניקות ריפוי גנטי מסתמכות על וקטורים ויראליים, אשר קשור עם חששות בטיחות, כגון immunogenicity הפוטנציאל וmutagenesis insertional. Biomaterials תיווך מסירת הגן אינו נגיפית יכול להתגבר על המגבלות האלה, אבל לעתים קרובות סובלים מיעילות transfection נמוכה. כדי לזרז את הגילוי של חומרים ביולוגיים חדשניים למסירת גן אינו נגיפית יעילה, מחקרים שנעשו לאחרונה הועסקו כימיה קומבינטורית וגישת הקרנת תפוקה גבוהה. ספריות פולימר מתכלים כגון פולי (es β-אמינוters) (PBAE) פותחו והוקרן, שהוביל לגילוי של פולימרים מובילים ביעילות transfection המשופרת במידה ניכרת בהשוואה לעמיתיהם וקטור פולימרים הקונבנציונלי. 6-7 במסמך זה, אנו מתארים את הסינתזה של PBAE והאימות של היכולת שלהם transfect תאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs) במבחנה, ואחרי ההשתלה הבאה של ADSCs גנטי שונה overexpressing כלי דם גורם אנדותל צמיחה (VEGF) במודל עכברי של איסכמיה hindlimb . התוצאות הוערכו על ידי מעקב אחר גורל תא באמצעות הדמיה פליטת אור, הערכת reperfusion רקמות באמצעות ההדמיה זלוף לייזר דופלר (LDPI), וקביעת ההצלה אנגיוגנזה ורקמה על ידי היסטולוגיה.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
				Name of the Reagent</td>
			<td>
				Company</td>
			<td>
				Catalogue Number</td>
			<td>
				Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				DMEM</td>
			<td>
				Invitrogen</td>
			<td>
				11965</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Fetal Bovine Serum</td>
			<td>
				Invitrogen</td>
			<td>
				10082</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>
				Invitrogen</td>
			<td>
				15070</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>
				Peprotech</td>
			<td>
				100-18B</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				1,4-Butanediol Diacrylate (90%)</td>
			<td>
				Sigma Aldrich</td>
			<td>
				411744</td>
			<td>
				Acronym: C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				5-amino-1-pentanol (97%)</td>
			<td>
				Alfa Aesar</td>
			<td>
				2508-29-4</td>
			<td>
				Acronym: 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Tetraethyleneglycoldiamine &gt;99%)</td>
			<td>
				Molecular Biosciences</td>
			<td>
				17774</td>
			<td>
				Acronym: 122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Sodium Acetate</td>
			<td>
				G-Biosciences</td>
			<td>
				R010</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>
				Invitrogen</td>
			<td>
				14190-144</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Tetrahyofuran Anhydrous (&gt;99.9%)</td>
			<td>
				Sigma Aldrich</td>
			<td>
				401757</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Diethyl Ether Anhydrous (&gt;99%)</td>
			<td>
				Fisher Scientific</td>
			<td>
				E138-4</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				DMSO Anhydrous (&gt;99.9%)</td>
			<td>
				Sigma Aldrich</td>
			<td>
				276855</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Gelatin</td>
			<td>
				Sigma Aldrich</td>
			<td>
				G9391</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Trypsin-EDTA</td>
			<td>
				Invitrogen</td>
			<td>
				25200</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				D-luciferin</td>
			<td>
				GoldBio</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Optimal Cutting Temperature (O.C.T)</td>
			<td>
				Tissue-Tek</td>
			<td>
				4583</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Rat anti-Mouse CD31</td>
			<td>
				BD Pharmingen</td>
			<td>
				550274</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Alexa Fluor 594 anti-rat IgG</td>
			<td>
				Invitrogen</td>
			<td>
				A11007</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

	&nbsp;

programming stem cells for therapeutic angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles

צמיחת כלי דם מבוקרת היא קריטית עבור התחדשות רקמות מוצלחת וריפוי פצעים, כמו גם לטיפול במחלות איסכמי כגון שבץ, התקף לב או מחלות עורקים היקפיים. מסירה ישירה של גורמי גדילת angiogenic יש הפוטנציאל לעורר צמיחת כלי דם חדשה, אבל קשורה לעתים קרובות עם מגבלות כגון חוסר המיקוד וזמן מחצית חיים קצרים בגוף חי. ריפוי גנטי מציע גישה חלופית על ידי אספקת הגנים מקודדים גורמי angiogenic, אבל לעתים קרובות דורש שימוש בוירוס, והוא מוגבל על ידי חששות בטיחות. כאן אנו מתארים את האסטרטגיה שפותחה לאחרונה לעידוד צמיחת כלי דם על ידי תאי גזע תכנות לביטוי יתר גורמי angiogenic באתרו באמצעות חלקיקים פולימריים מתכלים. באופן ספציפי את האסטרטגיה שלנו מנוצל בתאי גזע כאספקת כלי רכב על ידי ניצול של היכולת שלהם נודדות לעבר רקמות איסכמי in vivo. שימוש בווקטורים פולימריים אופטימיזציה, נגזר שומןתאי גזע שונו כדי overexpress גן angiogenic קידוד כלי דם גורם אנדותל צמיחה (VEGF). אנחנו תיארתי את התהליכים לסינתזת פולימר, היווצרות nanoparticle, transfecting תאי גזע במבחנה, כמו גם שיטות לאימות היעילות של תאי גזע המבטא-VEGF לקידום אנגיוגנזה במודל איסכמיה hindlimb עכברי.

לאחר ערבוב יחד, הפולימר החיובי טיעונים (C32-122) וטעון שלילי עצמי מרכיב פלסמיד דנ&quot;א לתוך חלקיקים. היווצרות Nanoparticle ניתן לאשר באמצעות ניתוח אלקטרופורזה כלומר complexation בין C32-122 ופלסמיד דנ&quot;א ימנע התגייסות של ה-DNA באלקטרופורזה. הפולימר משמש כמגיב transfection כדי להקל על ספ?...

Watch this Scientific Journal Video about Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles at JoVE.com

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

אנו מתארים את השיטה של ​​תאי גזע תכנות לביטוי יתר גורמים טיפוליים לאנגיוגנזה באמצעות חלקיקים פולימריים מתכלים. תהליכים שתוארו כוללים סינתזת פולימר, transfecting בתאי גזע שמקורם בשומן במבחנה, ומאמת את היעילות של תאי גזע מתוכנתים לקדם אנגיוגנזה במודל איסכמיה hindlimb עכברי.

תאי גזע תכנות טיפולי אנגיוגנזה שימוש אורגניים פולימריים חלקיקים

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

programming-stem-cells-for-therapeutic-angiogenesis-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.0K Views.  Stanford University.  אנו מתארים את השיטה של ​​תאי גזע תכנות לביטוי יתר גורמים טיפוליים לאנגיוגנזה באמצעות חלקיקים פולימריים מתכלים. תהליכים שתוארו כוללים סינתזת פולימר, transfecting בתאי גזע שמקורם בשומן במבחנה, ומאמת את היעילות של תאי גזע מתוכנתים לקדם אנגי?...

Video: Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale (nanoparticles). Nanoparticles can be engineered in a precise fashion where their size, composition and surface chemistry can be carefully controlled. This enables unprecedented freedom to modify some of the fundamental properties of their cargo, such as solubility, diffusivity, biodistribution, release characteristics and immunogenicity. Since their inception, nanoparticles have been utilized in many areas of science and medicine, including drug delivery, imaging, and cell biology1-4. However, it has not been fully utilized outside of "nanotechnology laboratories" due to perceived technical barrier. In this article, we describe a simple method to synthesize a polymer based nanoparticle platform that has a wide range of potential applications. 
The first step is to synthesize a diblock co-polymer that has both a hydrophobic domain and hydrophilic domain. Using PLGA and PEG as model polymers, we described a conjugation reaction using EDC/NHS chemistry5 (Fig 1). We also discuss the polymer purification process. The synthesized diblock co-polymer can self-assemble into nanoparticles in the nanoprecipitation process through hydrophobic-hydrophilic interactions.
The described polymer nanoparticle is very versatile. The hydrophobic core of the nanoparticle can be utilized to carry poorly soluble drugs for drug delivery experiments6. Furthermore, the nanoparticles can overcome the problem of toxic solvents for poorly soluble molecular biology reagents, such as wortmannin, which requires a solvent like DMSO. However, DMSO can be toxic to cells and interfere with the experiment. These poorly soluble drugs and reagents can be effectively delivered using polymer nanoparticles with minimal toxicity. Polymer nanoparticles can also be loaded with fluorescent dye and utilized for intracellular trafficking studies. Lastly, these polymer nanoparticles can be conjugated to targeting ligands through surface PEG. Such targeted nanoparticles can be utilized to label specific epitopes on or in cells7-10.

This article describes a nanoprecipitation method to synthesize polymer-based nanoparticles using diblock co-polymers. We will discuss the synthesis of diblock co-polymers, the nanoprecipitation technique, and potential applications.

גיבוש חלקיקים פולימריים Diblock באמצעות טכניקה Nanoprecipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

משלוח ין transfection ב אדם בתאי סרטן הלבלב באמצעות גורם גדילה עוריות קולטן במיקוד לטין מבוסס Nanovectors מתוכנן

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

ייצור מערך microneedle פולימרית יתוגרפיה

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

בודה חומרים פולימריים עבור יישומים ביו-הידרופובי

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

ססגוניות קרינת איתור עבור מיקרופלואידיקה אגל באמצעות סיבים אופטיים

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

פלאש NanoPrecipitation בשביל העטיפה של תרכובות הידרופוביות, הידרופילית חלקיקים פולימרים

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

ספיגת של חלקיקים חדשים מצופים השומנים, המכיל Falcarindiol על ידי גזע אנושי Mesenchymal

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...