אני מודה לג'יני טי לי על הפיקוח על הפרויקט הזה כשהייתי במעבדה של לי וטיילר ברורינג על עריכת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי פרס בזיל אוקונור סטרטר מלומד מקרן מצעדת דימס ו- NIH Grant GM098605.

1.3D הכנת שקופיות
<ol><li>הכן את ריאגנטים הבאים:<ol>
<li>מאגר CSK: 100 mM NaCl, 300 מ"מ סוכרוז, 10 mM צינורות, 3 mM MgCl2. כוונן את ה-pH ל-6.8 עם 1 M NaOH. אחסן את מאגר CSK ב- 4 °C (69 °F).</li>
		<li>מאגר CSK עם 0.5% טריטון X-100: להוסיף 200 מיקרוליטר של טריטון X-100 כדי 40 מ"ל של מאגר CSK. מערבבים את הפתרון באמצעות stirrer מגנטי עד טריטון X-100 מומס לחלוטין. אחסן את מאגר CSK עם 0.5% טריטון X-100 ב 4 °C (69 °F).</li>
		<li>4% Paraformaldehyde (PFA)–PBS, pH 7.4: להמיס 4 גרם של PFA בכ 70-80 מ"ל של מים. על מנת לזרז את תהליך המסה, להוסיף כ 20 μl של 4 N NaOH ולשמור את הפתרון באמבט מים ב 60 מעלות צלזיוס עד PFA התמוסס לחלוטין ואת הפתרון הוא שקוף. תהליך זה אורך כשעה. לאחר PFA התמוסס לחלוטין, להוסיף 10 מ"ל של 10x PBS. כוונן את הנפח הסופי ל-100 מ"ל במים וצנן את הפתרון לטמפרטורת החדר (25°C). השתמש בפתרון מוכן טרי עבור כל ניסוי חדש. הערה: קבל אישור מוסדי לכל עבודה בבעלי חיים ופעל בהתאם להנחיות הרלוונטיות לטיפול בבעלי חיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>המתת חסד לעכברים זכרים. באמצעות מלקחיים ומספריים, בלו את האשכים מן העכבר. הנח את האשכים ב- PBS (או RPMI 1640). לאחר הסרת האשכים, בצע במהירות את השלבים הבאים 1.3-1.4 על מנת למנוע השפלה של RNA.</li>
	<li>קרע את האשכים על צלחת פטרי קטנה ולהסיר את אלבוגניאה טוניקה. לפענח את הצינוריות חצי-חופן ב- PBS על קרח באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, להעביר כמה tubules (כמה חתיכות של tubules כ 5-10 מ"מ אורך) לתוך באר אחת של צלחת 4-באר המכיל 500 מ"ל של חיץ CSK + 0.5% טריטון X-100 על קרח, ואת הדגירה במשך 6 דקות. חשיפת יתר למאגר CSK עלולה לגרום להפרעה לתאים.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים, מעבירים את כל הצינוריות לבאר אחת של צלחת של 4 בארות המכילה 4% פתרון PFA-PBS. שלב זה יכול להיות מעוצב מראש ללא סטריאומיקרוסקופ, אך באופן אופציונלי ניתן להשתמש בו. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. במקביל להתחיל להכין 12 תאי ציטוספין במהלך תקופות הדגירה.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים, מעבירים את כל הצינוריות לבאר אחת של צלחת של 4 בארות המכילה PBS. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>בחלק האחורי של מגלשת זכוכית, להעביר את כל tubules לתוך 30 μl של PBS (החלק העליון של השקופית יש להימנע עקב תשלום קטיוני). בעזרת קצות שתי מלקחיים, קורעים את הצינוריות לחתיכות. קוצצים את הצינוריות בכיוון אופקי על ידי גזירת צינוריות בין קצות של שני מלקחיים ומושך את המלקחיים אופקית. המשך בשלב זה במשך כ- 10-20 שניות.</li>
	<li>מערבבים את ההשעיה על ידי pipetting באמצעות פיפטה P20.</li>
	<li>מעבירים את ההשעיה לצינור מיקרוצנטריפוגה, מדללים עם PBS ל-1.3 מ"ל בקירוב. החל 100 μl של השעיה על כל אחד 12 תאי ציטוספין (1.2 מיליליטר בסך הכל). בשלב זה, אין צורך לקבוע את ריכוז התאים.</li>
	<li>ציטוספין הדגימות ב 2,000 סל"ד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ציטוספין, יבש שקופיות על ספסל המעבדה במשך כמה דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ששקופיות הורשו להתייבש לחלוטין למשך מספר דקות, עבור לשלב הבא.</li>
	<li>באמצעות צנצנת קופלין המכילה PBS, לשטוף את השקופיות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מעבירים שקופיות לצנצנת קופלין המכילה 70% אתנול ומחכים לפחות 2 דקות לפני תחילת RNA FISH. שקופיות יציבות במשך כמה שבועות ב 70% אתנול ב 4 מעלות צלזיוס. לאחסון ארוך טווח, לייבש שקופיות באמצעות טיפול סדרתי עם 80% ו 100% אתנול בצנצנות Coplin במשך 2 דקות כל אחד אוויר יבש לחלוטין לייבש את המגלשות. יש לאחסן ב-80°C בתיבת שקופיות.</li>
</ol>2. הכנת בדיקת DNA ע"ש קוט-1 על ידי פרימיום אקראי
<ol><li>הכן את ריאגנטים הבאים:<ol>
<li>מאגר הכלאה: מערבבים את הרכיבים המתקדמת כדי להכין 900 מ"ל של מלאי מאגר הכלאה; פתרון זה ישמש לבדיקות מלאי. מלאי חיץ הכלאה זה מאפשר תוספת של 10% נפח של פתרון מעכבי RNase (ריבונוקלוזיד ונדיל קומפלקס) לפני הכלאה.<table><tbody>
<tr>
<td>רכיב</td>
					<td>סכום (μl)</td>
					<td>ריכוז סופי</td>
				</tr>
<tr>
<td>פורמפיד (פירושונים)</td>
					<td>500</td>
					<td>50% (v/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>50% דקסטרן</td>
					<td>200</td>
					<td>10% (עם/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>20x SSC</td>
					<td>100</td>
					<td>פי 2</td>
				</tr>
<tr>
<td>1% BSA</td>
					<td>100</td>
					<td>0.1%</td>
				</tr>
</tbody></table>לפני הכלאה, להוסיף 1/10 vol של 200 מ"מ ריבונוקלוזיד Vanadyl קומפלקס או מים למלאי חיץ הכלאה כדי להתאים את הריכוז הסופי. ב -20 מעלות צלזיוס, תערובת זו יציבה במשך יותר משנה.</li>
		<li>20x SSC: להמיס 88.2 גרם של נתרן ציטראט ו 175.3 גרם של NaCl בכ 800 מ"ל של מים. כוונן את ה- pH ל- 7.0 באמצעות כמה טיפות של 1 M HCl. הוסף מים כדי להתאים את עוצמת הקול הסופית ל- 1 L. Sterilize על-ידי שיקום אוטומטי. לאחר ההכנה, ניתן לאחסן 20x SSC בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>50% (w / v) דקסטרן: מערבבים מים ולאט לאט מוסיפים 50 גרם של דקסטרן סולפט. המשיכו לבחוש לילה בטמפרטורת החדר. מוסיפים מים כדי להתאים את הנפח הסופי ל-100 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסף את המרכיבים הבאים המפורטים להלן לצינור PCR. באמצעות מכונת PCR, לערבב ולהדגיר את הפתרון במשך 5 דקות ב 95 °C (69 °F).<table><tbody>
<tr>
<td>רכיב</td>
				<td align="center">סכום לתגובה (μl)</td>
				<td align="center">הסופי</td>
			</tr>
<tr>
<td>קוט-1 דנ"א: 1 מ"ג/מ"ל</td>
				<td align="center">1</td>
				<td align="center">1 מיקרוגרם</td>
			</tr>
<tr>
<td>פריימר 9מר אקראי (מתוך ערכה)</td>
				<td align="center">10</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>מים</td>
				<td align="center">27</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>צנטריפוגה בקצרה ומניחים על קרח.</li>
	<li>הוסף את הרכיבים הבאים. מערבבים ומדגרים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמצעות מכונת PCR. (לפרטים על הערכה המשמשת ראו טבלת ריאגנטים וציוד).<table><tbody>
<tr>
<td>רכיב</td>
				<td align="center">סכום לתגובה (μl)</td>
				<td align="center">ריכוז סופי</td>
			</tr>
<tr>
<td>תערובת מוכנה משלב 2.2</td>
				<td align="center">38</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>מאגר נוקלאוטידים 5x (מערכת)</td>
				<td align="center">9.2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>Cy3-dUTP (1 מ"מ)</td>
				<td align="center">0.8</td>
				<td align="center">16 מיקרומטר</td>
			</tr>
<tr>
<td>קלנאו (מערכה)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>הוסף 2 μl של חוצץ עצירה (מתוך ערכה) כדי להפסיק את התגובה.</li>
	<li>לטהר את התגובה שנעצרה באמצעות עמודות microspin.</li>
	<li>הוסף 50 מיקרוגרם (5 μl) של DNA זרע הרינג (50 קיפול עודף של תבנית Cot-1 DNA) לשבר המטוהר.</li>
	<li>מדוד את הנפח הכולל באמצעות פיפטה. הוסף נפח 0.7x של 100% אתנול ונפח 0.1x של 3 M נתרן אצטט (pH 5.2), לערבב היטב, וצנטריפוגה במשך 15 דקות במהירות המרבית (17,000 x g) באמצעות microcentrifuge ב 4 °C (69 °F).</li>
	<li>הסר את הנוזל, ולהוסיף 200 μl של 70% אתנול, לערבב היטב צנטריפוגה במשך 5 דקות במהירות מקסימלית ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר את הנוזל העודף. יבש את המשקעים במשך 10 - 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להמיס את גלולה ב 20 μl של מלאי חיץ הכלאה. בגלל גלולה לעתים קרובות קשה להתמוסס, פיפטה שוב ושוב. כאפשרות חלופית, מערבל מערבולת יכול לשמש גם כדי להמיס ביעילות את גלולה. ניתן לשמור את הבדיקות ב-20°C עד לשימוש.</li>
</ol>3. קוט-1 RNA פיש
<ol><li>הוסף את הרכיבים המפורטים להלן לצינור PCR. באמצעות מכונת PCR, דגירה במשך 10 דקות ב 80 °C (60 °F), ואחריו צעד preannealing של כ 10-30 דקות ב 42 °C (69 °F). יש לשמור על 42°C עד להכלאה. מתחם ונדיל ריבונוקלוזיד הוא אופציונלי; זה יכול להיות מוחלף במים.<table><tbody>
<tr>
<td>רכיב</td>
				<td align="center">סכום לתגובה (μl)</td>
				<td align="center">הסופי</td>
			</tr>
<tr>
<td>בדיקת DNA של מעריסה 1 (50 ng/μl)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">100 ng</td>
			</tr>
<tr>
<td>מתחם ריבונוקלאוסייד ונדיל (200 מ"ר)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">20 מ"מ</td>
			</tr>
<tr>
<td>מאגר הכלאה</td>
				<td align="center">נוסף ל- 20</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>לייבש שקופיות בצנצנת Coplin המכיל 80% אתנול במשך 2 דקות, ואחריו צנצנת Coplin המכיל 100% אתנול במשך 2 דקות. יבש שקופיות לחלוטין על ספסל המעבדה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מחממים מראש תא תיבת קצה (מלא 2-3 ס"מ של מים) באינקובטור 42 מעלות צלזיוס מראש. מקם את השקופית בתא תיבת הקצה. בקצרה צנטריפוגה בדיקות preannealed ופיפט ישירות על שקופיות מיובשות. הימנע מהפיכת בועות. כסו בעדינות את השקופית בתעודת כיסוי.</li>
	<li>להכלאה למשך 6 שעות עד לילה (14-15 שעות) ב-42 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הכינו פתרונות שטיפה בצנצנות קופלין (שתי צנצנות עם 2x SSC ו-50% פורממיד, ושתי צנצנות עם 2x SSC). מחממים ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות באמבט מים.</li>
	<li>השתמש בסכין גילוח כדי להסיר את החלקת המכסה מקצה השקופית. הימנע מגרד דגימות. לשטוף שקופיות בצנצנת Coplin המכיל 2x SSC ו 50% formamide במשך 5 דקות ב 45 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה פעם אחת.</li>
	<li>לשטוף שקופיות בצנצנת Coplin המכיל 2x SSC במשך 5 דקות ב 45 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה פעם אחת.</li>
	<li>הוסף 20 μl של מדיה להרכבה על-ידי DAPI לשקופיות, וכסה באמצעות שובר כיסוי. לחץ בעדינות על זכוכית כיסוי כדי להסיר מדיית הרכבה נוספת. כתם מדיה הרכבה נוספת עם רקמת ניקוי. השקופיות מוכנות להערכת מיקרוסקופיה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice.">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li><li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nascent+RNA,+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos.">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li><li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis.">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li><li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells.">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li><li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos.">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li><li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line.">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li><li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+imprinted+X+inactivation:+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse.">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li><li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells.">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li><li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids.">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li></ol>

למחבר אין מה לחשוף.

בהכנת שקופיות תלת-ממדיות, שלב ההחלחלה מקדים את שלב הקיבעון. שלבים אלה מבוצעים ישירות על צינוריות חצי-חצי, ובכך משמרים את מבנה הכרומטין התלת מימדי. אפשרות חלופית לשימור מבנה הכרומטין עבור RNA / DNA FISH היא לבצע את שלב permeabilization ואת שלב הקיבעון בו זמנית. טכניקה חלופית זו בוצעה בתאי נבט כיס בעוברים ?...

באשכים, תאי נבט להבדיל זרע דיפלואידית דרך מיוזיס לתוך בוגר, זרע haploid. במהלך תהליך זה, מבנה הכרומטין הגרעיני של תאי נבט הוא שיפץ באופן רציף ודינמי. ממרחי פני השטח משמשים בדרך כלל לבדיקה ציטולוגית של תאי זרע בודדים. שיטה רווחת של התפשטות פני השטח מעסיקה טיפול היפוטוני שבאמצעותו תאים זרע בודדים מופצים ומשוטחים1. תנאים אלה הם אופטימליים לניתוח מפורט של כרומוזומים מיוטיים. תכונות כרומוזומליות כגון מצב סינפטי ומוקדי רקומביניזציה נצפו בקלות בשיטה זו. עם זאת, הטיפול ההיפוטוני משבש את ארכיטקטורת הכרומטין התת-גרעיני, ולכן טכניקה זו אינה מתאימה לניתוח מבני של גרעינים. כתוצאה מכך, שיטה משופרת תוכננה כדי לשמר את מבנה הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים. שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (3D) (איור 1). שיטת שקופית 3D אפשרה זיהוי של לוקליזציה RNA המתהווה בגרעינים כי זה היה אופטימיזציה בתחילה כדי לבחון ביטוי גנים מצבי כרומטין במהלך התמיינות תא נבט האשכים על ידי פלואורסצנטיות RNA בהכלאה situ (FISH)2,3. שיטה תלת-ממדית זו חלה גם על השילוב של כשל חיסוני, דנ"א ודגי RNA. בנוסף, שיטה זו סייעה בגילוי כרומטין מין פוסט-מיוטי (PMSC), תא שקט של כרומוזומי המין שנמצאו בזרעונים פוסט-מיוטיים2.
שיטת השקופית בתלת-ממד עברה אופטימיזציה במקור באמצעות שילוב של שני שלבים חיוניים של הכנת שקופיות המשמשים בדרך כלל לכתמים גרעיניים: שלב הקיבעון שנועד לתקן חומרים גרעיניים וצעד ההחלחלה שנועד להסיר חומרים ציטופלסמיים על מנת לשפר את הנגישות של ריאגנטים מכתימים, כגון נוגדנים ובדיקות FISH. כפי שתואר קודם לכן בפרסום אחר3, נקבע כי שלב permeabilization חייב להקדים את שלב הקיבעון על מנת להשיג תוצאות אופטימליות עם רקע ציטופלסמי נמוך. בשיטת שקופית תלת-ממדית זו, שלב ההחלחלה ושלב הקיבעון הבאים מבוצעים ישירות על צינוריות חצי-שנתיות ואחריהן הניתוק המכני של תאי נבט עם מלקחיים לפני ציטוספין על שקופיות. שיטה חלופית עבור דג RNA של תאים spermatogenic פותחה במעבדה אחרת4. בשיטה זו, בהתאם לשיטת 3D, שלב permeabilization חייב להקדים את שלב הקיבעון על מנת להשיג תוצאות אופטימליות של RNA FISH.
הפרוטוקול הבא מתאר את שיטת השקופית תלת-ממדית ומספק דוגמה ליישום אפשרי, Cot-1 RNA FISH לגילוי RNAs גרעיניים. דנ"א קוט-1 מורכב מאלמנטים שחוזרים על עצמו בגנום. כאן, גשוש DNA קוט-1 הוא היברידית אינטרון ו UTR של התמלילים המתהווים, ובכך לזהות את האזורים הפעילים שעתוק בגרעין5,6. שקופיות תלת מימד הן רב-תכליתיות וניתן ליישם אותן על שילוב של טכניקות כשל חיסוני, DNA ו- RNA FISH על מנת לקבל בדיקה מפורטת של יחסים מרחביים בין ארכיטקטורת הכרומטין.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cot-1 DNA&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18440-016</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit</td>
			<td style="width:147px;">Agilent</td>
			<td align="right" style="width:119px;">
			300380
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Herring sperm DNA Solution</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td>15634-017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 200 proof (absolute)</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td align="right">111000200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Formamide deionized</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600-00500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8532</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:147px;">Lifeblood Medical</td>
			<td style="width:119px;">77110-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10491-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">76240</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">221465</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:147px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ribonucleoside-vanadyl complex</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1402S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Illustra MicroSpin G-50 Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">27-5330-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5424</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">300-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:147px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3262-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cytospin 3</td>
			<td style="width:147px;">Shandon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:147px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-815</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-566-301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-544-G</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Air incubator</td>
			<td style="width:147px;">Revolutionary Science</td>
			<td style="width:119px;">RS-IF-203</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells

במהלך התמיינות תאי נבט האשכים, המבנה של כרומטין גרעיני משתנה באופן דינמי. להלן שיטה שנועדה לשמר את סידור הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים המצויים בעכברים; שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (תלת-ממדית). בשיטה זו, צינוריות האשכים מטופלים ישירות עם שלב חדירה שמסיר חומר ציטופלסמי, ואחריו שלב קיבעון שמתקן חומרים גרעיניים. לאחר מכן, הצינוריות מנותקות, השעיית התא היא ציטוספון, והתאים נצמדים לשקופיות. שיטה זו משפרת את הרגישות לגילוי מבנים תת-גרעיניים והיא ישימה עבור פלואורסצנטיות חיסונית, דנ"א ו- RNA בהכלאה במקום (FISH) והשילוב של שיטות זיהוי אלה. כדוגמה ליישום אפשרי של שיטת השקופית 3D, דג RNA Cot-1 מוצג כדי לזהות RNAs המתהווה. שיטת שקופית 3D תאפשר בדיקה מפורטת של יחסים מרחביים בין מבנה כרומטין, DNA, ו RNA במהלך התמיינות תא נבט האשכים.

תוצאה מייצגת של שקופית תלת-ממדית מוצגת באיור 2. בניסוי זה, Cot-1 RNA FISH בוצע כדי לזהות שעתוק המתהווה יחד עם immunostaining באמצעות נוגדנים נגד CBX1 ו γH2AX. כדי לשלב RNA FISH ו immunostaining, immunostaining בוצע ראשון, ואחריו RNA FISH כמתואר ב3. CBX1 הוא חלבון הטרוכרומטין הממוקם בהטרוכרומטין פריקנטרומרי וכרומוזומ?...

Watch this Scientific Journal Video about Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells at JoVE.com

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

החומר כאן מתאר שיטה שפותחה כדי לשמר את מבנה הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים. שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (תלת-ממדית). שיטה זו משפרת את הרגישות לגילוי מבנים תת-גרעיניים והיא ישימה עבור פלואורסצנטיות חיסונית, דנ"א ופלואורסצנטיות RNA בהכלאה במקום (FISH).

שיטת הכנת שקופיות לשמירה על ארכיטקטורת כרומטין תלת מימדית של תאי נבט האשכים

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

slide-preparation-method-to-preserve-three-dimensional-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Views.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. החומר כאן מתאר שיטה שפותחה כדי לשמר את מבנה הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים. שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (תלת-ממדית). שיטה זו משפרת את הרגישות לגילוי מבנים תת-גרעיניים והיא ישימה עבור פלואורסצנטיות חיסונית, דנ"א ופלואורסצנטיות RNA בהכלאה במקום ...

Video: Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabrication של שבב בגודל פיגומים לעיבוד תלת ממדי נייד

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

בידוד של תאים אפיתל החלב של תלת ממדי תאים משולבים תרבות משותפת אליפטית

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

שחזור תלת מימדי של הארכיטקטורה כלי הדם של השחלה העכבר בהירות-והפנים פסיבי

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular matrix. The ability of CSCs to participate in the development of endothelium constitutes an important characteristic that directly contributes to the general understanding of the mechanisms of tumorigenesis and tumor metastasis. The purpose of this work is to establish a reproducible methodology to investigate the tumor-initiation capability of ovarian cancer stem cells (OCSCs). Herein, we examined the neovascularization mechanism between endothelial cells and OCSCs along with the morphological changes of endothelial cells using the in vitro co-culture model NICO-1. This protocol allows visualization of the neovascularization step surrounding the OCSCs in a time course manner. The technique can provide insight regarding the angiogenetic properties of OCSCs in tumor metastasis.

Ovarian cancer stem cells (OCSC) are responsible for cancer initiation, recurrence, therapeutic resistance, and metastasis. The OCSC vascular niche is considered to promote self-renewal of OCSCs, leading to chemoresistance. This protocol provides the basis for establishing a reproducible OCSC vascular niche model in vitro.

הערכת התכונות האנגיוגנטיות של תאים דמויי גזע של סרטן השחלות באמצעות מערכת תרבית קו-תרבית תלת-ממדית, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...