שרה א Alfaqeeh ממומן על ידי Kind סעוד מכללת אוניברסיטה לרפואת שיניים, משרד להשכלה גבוהה, ממלכת ערב הסעודית.

1. להקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חידוד המכשירים לנתיחה (באמצעות אבן השחזה משומנת עם שמן מינרלים) ולעקר לפני השימוש לתרבות איבר באמצעות 70% תרסיס אתנול ועיקור יבש חום. לחדד את המחטים לנתיחה באמצעות אלקטרוליזה ב2 M נתרן הידרוקסידי באמצעות הספקה 12V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום התרבות המשמש לנתיחה והתרבות של איברים עובריים, בהיקף של F12 של מתקדם השתנה Dulbecco נשר בינוני (F12 DMEM) בתוספת 1% Glutamax ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין. </li></ol> 2. Dissection עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לברור נקבה בהריון הזדווגו מתוזמן באמצעות שיטת לוח זמנים אחד כפי שאושר על ידי משרד הפנים או גוף מנהל אחר. משם לנתח את העור באזור הבטן התחתון, וחתך את הבטן באמצעות מספריים. אתר את שתי קרנות הרחם, אשר מתחברות יחד על קו האמצע התחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הרחם ואת המקום בצינור מלא בינוני על קרח. When על קרח, הרקמה ניתן להשאיר לכמה שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרחם ומניחים בצלחת פטרי במדיום מתחת למיקרוסקופ. איפה יש לבצע ניתוחי עובר אפשריים במינרית זרימת מכסה המנוע כדי למזער את הזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את העוברים מהרחם ולשחרר אותם מרקמות extraembryonic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את העוברים באמצעות מחט טונגסטן ולהעביר את הראשים לתוך צלחת טרי של מדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הלסתות מראשי על ידי הצבת מחט לתוך חלל הפה ולחתוך לכיוון החלק האחורי של הראש (איורים 1 א ו 1 ב &#39;). לסתות מבודדות יכולות להיות מאוחסנות באופן זמני במדיום על קרח בעת שהמתינו לקיצוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרוסות לסת תחתונה כל שלבי E11.5-E15.5 הם אידיאלי עבור תרבות נבט שן. לאחר E15.5 העצם מתפתח בלסת התחתונה הוא קשה מדי לקיצוץ. פרוסות שיניים עדיין יכולות להתבצע אך העצם (עצם מכתשיים dentary ויוצרים) חייב להיות ראשון הוסר על ידינתיחה לפני קיצוץ 9. הסרת עצם בזהירות באמצעות מחטי טונגסטן ומלקחיים. </li></ol> 3. חיתוך עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פרוסות רקמת הלסת התחתונה באמצעות מסוק רקמת שולחן סטנדרטי (איור 1 ג). השתמש בלהב חדש לאחר כ 200 לסתות, ולוודא שהוא נמצא מיושר עם דיסק ההתקנה כאשר הוא נופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את תקליטור ההתקנה ולהב עם אתנול 70% לפני השימוש. יש לנקוט זהירות בעת שימוש במכונה, כפי שהלהב הוא חד מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המסוק במרחק חיתוך של בין 200-400 מיקרומטר בהתאם לגיל של הדגימה, ותלויים אם נדרש כל נבט השן. הגדר את כוח הלהב על מקסימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את לסת תחתונה לדיסק הרכבת הפלסטיק באמצעות פיפטה או מלקחיים. מסדרים את הלסת התחתונה על הדיסק כדי לוודא את הכיוון הוא עדיין ברור. לשון הפיתוח יכולה לשמש ציון דרך שימושית לקביעת כיוון. לaf שימוש טוחנותrontal / נטייה רוחבית (ראה מטוס של קיצוץ באיור 1 ב &#39;), ואילו לחותכות להשתמש פרוסה sagittal דרך הלסת התחתונה על מנת לשקף את הכיוון של שיניים אלה שונים כאשר הם גדלים (ראו מטוס של קיצוץ באיור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום העודף מרחבי הרקמות באמצעות נייר סינון על מנת לייבש את הלסת התחתונה על דיסק ההרכבה מעט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר ייבוש, הנח את הדיסק על שולחן הנירוסטה העגול של המסוק. הדלק את המכשיר ולחץ להתחיל. השולחן עובר באופן אוטומטי משמאל לימין ואילו באותו הזמן זרוע ביצוע קיצוץ הלהב עולה וירד במהירות של עד 200 משיכות / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את המחשב ברגע שהרקמה כבר פרוסות לחלוטין. ודא זרוע הלהב היא במצב המורם ולהסיר את הדיסק. אל תניח את אצבעות מתחת לזרוע הלהב או להשאיר את המכונה ללא השגחה כאשר קיצוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את דיסק ההרכבה ולהוסיף t הבינוני באופן מיידיo את הפרוסות על הדיסק על מנת למנוע ייבוש מוגזם. לעקור בזהירות את הרקמה הפרוס מהחלק התחתון של הדיסק באמצעות מחט טונגסטן ולאחר מכן טפטפת לתוך צלחת פטרי קטנה של מדיום (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הפרוסות באמצעות מחט ולאחר מכן בחר את פרוסות רקמה המכילות הרקמות של עניין תחת סטראו (1D דמויות, 1E, ו2B). מניחים פרוסות נבחרות בתרבות מנות טריות עם מדיום. </li></ol> 4. פורסים תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מנות התרבות מרכזיות היטב איבר מוכנות לתרבות על ידי הוספה כ 2 מיליליטר של מים autoclaved אל הבאר החיצונית על מנת למנוע התייבשות, ועל ידי מיצוב רשת מתכת על פני מרכז הצלחת (3A דמויות ו3B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את רשתות מתכת על ידי חיתוך רצועות כ 4 סנטימטר x 1.5 סנטימטר מיריעות של רשת הנירוסטה. השתמש ניקוב חורים לעשות חור במרכז ולכופףהצדדים כדי ליצור סוף מעד. הרשת צריכה להתאים שטוחה על פני הבאר המרכזית, שוכבת במקביל לתחתית הצלחת (3A דמויות ו3B). החיטוי הרשתות לעקר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי חתיכת קרום (PET) (גודל נקבובית 0.4 מיקרומטר) גדול מספיק כדי לכסות את החור ברשת של terephthalate פוליאתילן השקוף. מניחים את הקרום לחתוך לתוך הצלחת עם הפרוסה שנבחרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפרוסה על גבי הקרום ולאחר מכן הרם בזהירות את הקרום מבינוני, עם פרוסה שיטחה במרכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המסנן על הרשת מעל החור העגול במרכז, ולהוסיף כ 1 מיליליטר של מדיום תרבות היטב, עד לרמה של הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למניפולציות להוסיף חלבונים או מעכבי מולקולה קטנים לבינוניות (לדוגמא 8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלם את הפרוסה לשיא של מורפולוגיה ביום 0 של התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכלים באווירת humidified של 5% CO <sUB&gt; 2 על 37 מעלות צלזיוס בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלם את התרבויות במרווחי זמן קבועים בממוצע 7 ימים. לשנות את התרבות בינונית בכל שעה 48-72. לצילום להציג את הפרוסות עם מקור אור מלמטה (איורים 2C-E). </li></ol> 5. איתור שושלת אם נדרש איתור שושלת, ניתן להזריק לתוך נבט שן צבעי lipophilic כגון DiI או Dio לפני שלב 4, התרבות הפרוסה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך מחטי זכוכית נימים באמצעות חולץ מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את קצה המחט באמצעות מלקחיים ומניח את הקצה למטה לתוך תמיסת הצבע. השאר לכמה דקות בזמן שהצבע ממלא את הקצה על ידי פעולת נימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המחט מלאה לבעל ולצרף דרך צינורות אל aspirator מזרק או פה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את קצה המחט במדיום תרבות נגיעה באזור של הפרוסה בשל להיות מתויגים. החל לחץ אוויר כדי לתפוס כמות קטנה של צבע מתוך המחטד על גבי הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחט ולבדוק לתיוג תחת הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן להעביר פרוסות כותרתו בהצלחה למסננים ותרבותיים כפי שמתואר בשלב 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+dental+mesenchyme:+dynamic+development+of+the+dental+papilla+and+follicle.">Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle.</a> Developmental biology. 366, 244-254 (2012).</li><li>Ferguson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+is+an+essential+early+mesenchymal+signal+in+tooth+development+that+is+required+for+patterning+of+the+murine+dentition.">Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition.</a> Genes &amp; development. 12, 2636-2649 (1998).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium.">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental cell research. 16, 118-147 (1959).</li><li>Matalova, E., Antonarakis, G. S., Sharpe, P. T., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+of+primary+and+secondary+enamel+knots.">Cell lineage of primary and secondary enamel knots.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 754-759 (2005).</li><li>Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S., De Bari, C., Cobourne, M. T., Rice, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+relationship+between+Tbx1+and+FGF+signaling+during+tooth+morphogenesis+and+ameloblast+lineage+determination.">A regulatory relationship between Tbx1 and FGF signaling during tooth morphogenesis and ameloblast lineage determination.</a> Developmental biology. 320, 39-48 (2008).</li><li>Diep, L., Matalova, E., Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+tooth+bud+mesenchyme+to+alveolar+bone.">Contribution of the tooth bud mesenchyme to alveolar bone.</a> Journal of experimental zoology. Part B, Molecular. 312B, 510-517 (2009).</li><li>Rothova, M., Feng, J., Sharpe, P. T., Peterkova, R., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mesoderm+to+the+developing+dental+papilla.">Contribution of mesoderm to the developing dental papilla.</a> The International journal of developmental biology. 55, 59-64 (2011).</li><li>Buchtova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+patterning+of+the+snake+dentition+are+dependent+on+Sonic+hedgehog+signaling.">Initiation and patterning of the snake dentition are dependent on Sonic hedgehog signaling.</a> Developmental biology. 319, 132-145 (2008).</li><li>Buchtova, M., Stembirek, J., Glocova, K., Matalova, E., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+regression+of+the+dental+lamina+underlies+the+development+of+diphyodont+dentitions.">Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions.</a> Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).</li><li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primary+enamel+knot+determines+the+position+of+the+first+buccal+cusp+in+developing+mice+molars.">The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars.</a> Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).</li><li>Sakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+dynamics+in+cervical+loop+epithelium+during+transition+from+crown+to+root:+implications+for+Hertwig's+epithelial+root+sheath+formation.">Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig's epithelial root sheath formation.</a> Journal of periodontal research. , (2012).</li><li>Fisher, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+development+in+vitro+of+the+whole+and+halved+lower+molar+tooth+germ+of+the+mouse.">Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse.</a> Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).</li><li>Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+halved+embryonic+lower+first+mouse+molars:+correlation+with+the+distribution+pattern+of+non+dividing+IDE+cells,+the+putative+organizers+of+morphogenetic+units,+the+cusps.">Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps.</a> The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).</li><li>Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+evolutionary+patterns+of+mammalian+teeth+from+development.">Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development.</a> Nature. 449, 427-432 (2007).</li><li>Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tinkering+with+the+inductive+mesenchyme:+Sostdc1+uncovers+the+role+of+dental+mesenchyme+in+limiting+tooth+induction.">Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction.</a> Development. 136, 393-402 (2009).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

שיטה זו של תרבות שן יש את היתרון שהגישה לניבט השן הוא מצוין, המאפשר ייחוס מדויק באיתור מיקום של חרוזים בתוך האפיתל או mesenchyme. באזורים מוגדרים של נבט השן המתפתח יכולים להיות ממוקדים ולכן באופן ספציפי. במהלך תרבות המורפולוגיה המשתנות של נבט השן יכולה להיות אחריו, ואת ההש...

עבור מספר הניסויים חשוב להיות מסוגלים רקמות תרבות vivo לשעבר לעקוב אחר התפתחות. תרבות של פיתוח רקמה מספקת גישה בתקופות מוגדרות של פיתוח ומאפשרת מניפולציה של גנים על ידי התוספת של גורמים למדיום התרבות, או בחרוזים טעונים, ועל ידי השימוש בtransfection electroporation ו1. בניסויים רבים, חשוב להיות מסוגל לדמיין את הרקמה ככל שהוא גדל, לדוגמא, כדי לעקוב אחר גורלם של תאי שושלת מתויגת כרקמה עוברת המורפוגנזה. זה יכול להיות בעייתי במיוחד לרקמות המתפתחות עמוק בתוך העובר, שאינן ברורים כאשר בלוק של רקמות מן העובר הוא תרבותי. שיניים הן דוגמאות טובות לכך, כפי שהם מפתחים בתוך תהליך האף הלסת התחתונה, הלסת העליונה וקדמי. כאשר כל הלסת התחתונה היא בתרבית ניתן לראות המבנים השטחיים של השן אך ניתן לנתח שינויים במורפולוגיה רק ​​לאחר חתך של רקמה קבועה <sעד&gt; 2. יש לנו להתאים טכניקת תרבות פרוסה חיות ומאפשרת לנו לעקוב אחר התפתחות חיידקים בשיניים ובמתן גישה לחלקים השונים של השן במהלך פיתוח. תרבויות טכניקת פרוסות נבט שן בממשק גז הנוזלי, באמצעות שיטת Trowell שונה 3. תרבויות הפרוסה אלה היו מאוד שימושיות באופן ישיר הבא המורפוגנזה של השן, ומאפשר איתור שושלת של רכיבים שונים, כגון קשר האמייל ואת הגבשושיות וזקיק 1,4-7 שיניים. הטכניקה אינה מוגבלת לעוברי עכברים והצלחה כבר בשימוש לפרוסות תרבות חיות של חזיר ו8,9 רקמות שיניים נחש. בנוסף ליתרון של להיות מסוגל לדמיין התפתחות שן, שיטת פרוסה גם יש את היתרון שהפרוסות הדקיקות של רקמה הגדילו את הגישה לחומרים מזינים מבינונית ואוויר מהחממה. התוצאה היא צמיחה משופרת של חיידקי השן, אשר תואם את פיתוח in vivo, וinvas המופעיון של תאי האנדותל לפטמית 7. לעומת זאת, חיידקי שן בתרבויות לסת תחתונה כולו לפתח איטיים יותר מאלה in vivo ומרכז התרבות הוא לעתים קרובות נמקים בתרבויות לטווח ארוך. בתרבות הפרוסה, השן מתפתחת בתוך פרוסה של הלסת, והאינטראקציה שלה עם העצם מתפתח סביב ורקמות אחרות יכולה להיות במעקב. בשיטה שלנו הרקמה קצוצה ישר אחרי נתיחה ללא צורך להטביע במדיום תמיכת 10,11 ואין צורך בכל מערכת לצרף את הרקמה לקרש החיתוך. השיטה היא לכן לא פולשנית ומהירה, המאפשרת ללסתות רבות להיות מחולקים בפגישה אחת.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101077Y</td>
			<td>100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Advanced Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI (Molecular probes)</td>
			<td>Vybrant</td>
			<td>V-22885</td>
			<td>Cell-labeling solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Cell tracker CM-DiI, C-7000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO (Molecular probes)</td>
			<td>Vybrant</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geminator 500</td>
			<td>Thomas</td>
			<td>Thomas No. 3885A20</td>
			<td>Dry-heat sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain tissue chopper</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>10180</td>
			<td>Standard table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 &#956;m pore size)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>PET track-etched membrane, 6-well format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grids (Stainless Steel - AISI 304 - Mesh)</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>FE228710</td>
			<td>(Fe/Cr18/Ni10)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td>Intracel Ltd</td>
			<td>051-0500-900 0-100 psi</td>
			<td>Single channel picospritzer III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary with filament 1 mm</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire 0.1 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire 0.38 mm</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>W005155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td>Used for mouth aspiration lineage tracers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the slice culture method for following development of tooth germs in explant culture

תרבות explant מאפשרת מניפולציה של פיתוח איברים בנקודות זמן ספציפי ולכן שיטה חשובה לביולוג התפתחותי. לאיברים רבים שקשה לגשת לפיתוח רקמות על מנת לאפשר ניטור בזמן vivo התרבות לשעבר. שיטת התרבות הפרוסה מאפשרת גישה לרקמה, כך שיכולות להיות אחרי תנועות morphogenetic ואוכלוסיות תאים ספציפיות יכולות להיות ממוקדות עבור מניפולציה או התחקות שושלת. במאמר זה אנו מתארים שיטה של ​​התרבות הפרוסה שהייתה מוצלח מאוד לתרבות של חיידקי שן במגוון מינים. השיטה מספקת גישה מצוינת לחיידקי השן, אשר לפתח בקצב דומה לזה שנצפה בvivo, מוקף ברקמות לסת האחרות. זה מאפשר אינטראקציות רקמות בין השן והרקמה שמסביב כדי להיות במעקב. למרות שמאמר זה מתמקד בחיידקי שן, באותו הפרוטוקול ניתן ליישם כדי לעקוב אחר התפתחותם של מספרשל איברים אחרים, כגון בלוטות רוק, סחוס של מקל, בלוטות באף, בלשון, ובאוזן.

על מנת לעקוב אחר התנועה של זקיק השיניים טוחנת הראשון, נלקחו 250 מיקרומטר פרוסות קדמיות דרך לסת תחתונה בשיטה שתוארה לעיל. זקיק השיניים הוא השכבה של mesenchyme שמקיף את האפיתל האמייל החיצוני (OEE) של השן המתפתחת, ובעבר הוכח לקחת חלק בהיווצרות של רקמה של periodontium 6. לסתות נותח...

Watch this Scientific Journal Video about The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture at JoVE.com

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

כאן אנו פירוט שיטה לחיידקים שן תרבות בפרוסות לסת תחתונה באמצעות מסוק רקמות. שיטה זו מאפשרת גישה ייחודית לשן במהלך פיתוח, מתן הזדמנות מצוינת למניפולציה ושושלת מעקב, אינו זמין בשיטות תרבות מסורתיות יותר.

פורסים תרבות השיטה למעקב אחר ההתפתחות של חיידקים בשיני explant תרבות

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

the-slice-culture-method-for-following-development-tooth-germs

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  King's College London.  כאן אנו פירוט שיטה לחיידקים שן תרבות בפרוסות לסת תחתונה באמצעות מסוק רקמות. שיטה זו מאפשרת גישה ייחודית לשן במהלך פיתוח, מתן הזדמנות מצוינת למניפולציה ושושלת מעקב, אינו זמין בשיטות תרבות מסורתיות יותר. 

Video: The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed protocol for biolistic transfection of rat hippocampal slices, from the initial preparation of DNA coated bullets to the final shooting of the organotypic slice cultures using a gene gun. Gene gun transfection is an efficient and easy means of transfecting neurons and is especially useful for fluorescently labeling a small subset of cells in tissue slice. In this video, we first outline the steps required to coat gold particles with DNA. We next demonstrate how to line the inside of plastic tubing with the gold/DNA bullets, and how to cut this tubing to obtain the plastic cartridges for loading into the gene gun. Finally, we perform biolistic transfection of rat hippocampal slice cultures, demonstrating handling of the Bio-Rad Helios gene gun, and offering trouble shooting advice to obtain healthy and optimally transfected tissue slices.  

We describe a method for preparing DNA coated gold bullets and demonstrate the use of such bullets to biolistically transfect neurons in cultured hippocampal slices.

הכנת כדורי אקדח ין transfection Biolistic של נוירונים תרבות Slice

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

שיטה חדשה לתרבות והמקוטבת גירוי של רירית המעי Explants אדם

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

רומן<em&gt; Ex vivo</em&gt; שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Dissection של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; העצבי קרסט עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; Explant תרבות או<em&gt; In vivo</em&gt; השתלות

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

הקמת מערכת התרבות pH חומצי חוץ-תאית

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...