אנו מודים לפרופ &#39;JP פאץ (מחלקה לכימית Biophysical, אוניברסיטת היידלברג ומחלקת לחומרים חדשים וBiosystems, מכון מקס פלאנק למערכות נבונות, שטוטגרט) לתמיכה מהסוג שלו. התמיכה הכספית ממכון מקס פלנק-Gesellschaft וForschungsgemeinschaft דויטשה (DFG SFB/TR79 לEAC-.) גם הם הכירו באופן משמעותי.

1. סינתזה של 11-Mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimide אסתר (MU-NHS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת dropwise פתרון של 500 מ&quot;ג N-hydroxysuccinimide ו30 מ&quot;ג 4 - פירידין (dimethylamino) ב10 מיליליטר אצטון (PA) עד 1 גרם חומצת 11-mercaptoundecanoic ב40 מיליליטר dichloromethane (PA) בטמפרטורת חדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב התגובה ל0 מעלות צלזיוס ולהוסיף N 1.1 גרם dropwise, N &#39;-dicyclohexylcarbodiimide ב10 מיליליטר dichloromethane (תחת אווירת חנקן). שמור את התגובה בטמפרטורה נמוכה במשך שעה 1 ולאחר מכן מערבבים ב RT הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את המשקע ולייבש אותו תחת לחץ מופחת. לטהר את המוצר על ידי הבזק כרומטוגרפיה עם בנזין נפט ואתיל אצטט (PA) ביחס של 1:1. </li></ol> 2. הכנת שכבות זהב אחידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips זכוכית נקי עם מגבוני דיוק וsonicate למשך 5 דקות בתמיסה המכילה תערובת 1:1 של אתיל אצטט (הרשות) ומתנול (PA). Rinsמצעי דואר עם מתנול ולהתנגב תחת זרם חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מצעים נקיים במכשיר ציפוי גמגום. לפנות את החדר. הסר את שכבת תחמוצת כרום העליונה מהיעד כרום ידי מקרטעת ל60 שניות. מניחים את הדגימות מתחת לקורת המתכת ומעיילם עם שכבת כרום 10 ננומטר, ואחריו על ידי ציפוי בשכבת זהב 40 ננומטר. </li></ol> 3. קיבוע פני השטח של BMP-2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים MU-NHS בN, N-dimethlyformamide (DMF) לריכוז סופי של כ 1 מ&quot;מ ודגירת מצעי זהב בפתרון MU-NHS ב RT במשך 4 שעות תחת אווירת חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משטחי Sonicate בDMF למשך 2 דקות, לשטוף עם DMF וMeOH ולהתנגב תחת זרם חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של rhBMP-2 בסטרילית 4 מ&quot;מ HCl בריכוז של 100 מיקרוגרם / מיליליטר (aliquots חנות ב -80 מעלות צלזיוס). לדילולים עובדים (3.5 מיקרוגרם / מיליליטר), לדלל את פתרון המניות ב-PBS / NaCl (PBS המכיל 1 M NaCl) וdjust ל-pH 8.5 מייד לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה משטחים פונקציונליות MU-NHS בפתרון עובד rhBMP-2 על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הסר supernatant דגירה. משטחי Sonicate ב-PBS / NaCl למשך 2 דקות ולשטוף 3x עם PBS סטרילי / NaCl. </li></ol> 4. אפיון פני השטח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחסום ספיחה לא ספציפית של נוגדן, דגירה משטחים עם BSA 5% (w / v) בפתרון PBS עבור שעה 1 ב RT, ואחריו דגירה עם נוגדן אנטי BMP-2 (1:100 ב1% (w / v ) פתרון BSA / PBS) במשך שעה 1 ב RT. שטוף משטחים פעמיים עם PBS sonicate במשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מצעים עם נוגדן HRP-מצומדות המשני (1:1,000 ב1% (w / v) פתרון BSA / PBS) במשך 30 דקות ב RT, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש assay האדום Ampliflu כדי למדוד את הפעילות האנזימטית HRP ב 570 ננומטר עם קורא צלחת. </li></ol> 5. ניתוח של פעילות ביולוגית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרעים 1 x 10 myoblasts C2C12 5 עכבר לכל טוב ב6 גם plאטס במדיום גידול, בהיקף של DMEM גלוקוז גבוהה המכיל פירובט בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ומדגיר אותן 24 שעות על 37 ° C / 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרעיב את התאים בסרום ללא DMEM ל3-5 שעות לפני זריעה על גבי המשטחים מעוצבים עם BMP-2 המשותק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחקירה של אינדוקציה איתות לטווח קצר, להחליף את המדיום בסרום ללא DMEM הטרי 200 μl ולמקם את BMP-2 משטחים משותקים מעל התאים. המשטח צריך להיות מטופלים עם פינצטה קצה קנס כדי להימנע מגירוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בעדינות משטחים ולשאוב את המדיום עם טפטפת, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. המשך לניתוח של תגובות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח של פעילות ביולוגית ארוך טווח, תאי צלחת על גבי משטחים ותרבותם על 37 ° C / 5% CO 2 בתנאים נמוכים בסרום (2% FBS) במשך שישה ימים. </li></ol>

<ol>
	<li>Helm, G., Andersson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+statement:+Bone+morphogenetic+proteins:+Basic+science.">Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science.</a> Spine. 27 (16S), S9 (2002).</li><li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins:+multifunctional+regulators+of+vertebrate+development.">Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development.</a> Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).</li><li>Reddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs:+from+bone+morphogenetic+proteins+to+body+morphogenetic+proteins.">BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).</li><li>Rengachary, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins:+basic+concepts.">Bone morphogenetic proteins: basic concepts.</a> Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).</li><li>Schlunegger, M., Gru&#776;tter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+feature+revealed+by+the+crystal+structure+at+2.2+&#197;;+resolution+of+human+transforming+growth+factor-&#946;2.">An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 &#197;; resolution of human transforming growth factor-&#946;2.</a> Nature. 358, 430-434 (1992).</li><li>Scheufler, C., Sebald, W., Hu&#776;lsmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+bone+morphogenetic+protein-2+at+2.7+&#197;+resolution.">Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 &#197; resolution.</a> J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).</li><li>Nimni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polypeptide+growth+factors:+targeted+delivery+systems.">Polypeptide growth factors: targeted delivery systems.</a> Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).</li><li>Wozney, J., Rosen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein+and+bone+morphogenetic+protein+gene+family+in+bone+formation+and+repair.">Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair.</a> Clin. Orthop. Related Res. 346, 26 (1998).</li><li>Rosen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+and+BMP+inhibitors+in+bone.">BMP and BMP inhibitors in bone.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).</li><li>Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+BMP-2-BRIA+ectodomain+complex.">Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex.</a> Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).</li><li>Keller, S., Nickel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+recognition+of+BMP-2+and+BMP+receptor+IA.">Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).</li><li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+receptor+signaling:+transcriptional+targets,+regulation+of+signals,+and+signaling+cross-talk.">BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).</li><li>Nohe, A., Hassel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mode+of+bone+morphogenetic+protein+(BMP)+receptor+oligomerization+determines+different+BMP-2+signaling+pathways.">The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways.</a> J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).</li><li>Sieber, C., Kopf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling.">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li><li>Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+review+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+trials+in+spinal+surgery:+emerging+safety+concerns+and+lessons+learned.">A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned.</a> Spine J. 11, 471-491 (2011).</li><li>Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+delivery+of+growth+factors+for+bone+repair.">Localized delivery of growth factors for bone repair.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).</li><li>Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+immobilization+of+epidermal+growth+factor+onto+culture+substrates+for+the+selective+expansion+of+neural+stem+cells.">Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells.</a> Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).</li><li>Gon&#231;alves, R., Martins, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactivity+of+immobilized+EGF+on+self-assembled+monolayers:+Optimization+of+the+immobilization+process.">Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).</li><li>Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+immobilization+of+bone+morphogenetic+protein+2+via+a+self-assembled+monolayer+formation+induces+cell+differentiation.">Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation.</a> Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).</li><li>Love, J., Estroff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+of+thiolates+on+metals+as+a+form+of+nanotechnology.">Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).</li><li>Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-2+converts+the+differentiation+pathway+of+C2C12+myoblasts+into+the+osteoblast+lineage.">Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage.</a> J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).</li><li>Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+release+from+tissue+engineering+scaffolds.">Growth factor release from tissue engineering scaffolds.</a> J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).</li><li>Uludag, H., D'Augusta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+proteins+with+biomaterial+carriers:+a+correlation+between+protein+pharmacokinetics+and+osteoinduction+in+the+rat+ectopic+model.">Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model.</a> J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).</li><li>Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+BMP-2+for+functionalization+of+titanium+surfaces.">Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces.</a> Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).</li><li>Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-2+decorated+silk+fibroin+films+induce+osteogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells.">Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells.</a> J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).</li><li>Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+systems+for+bone+growth+factors+-+the+new+players+in+skeletal+regeneration.">Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration.</a> J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).</li><li>Masters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+growth+factor+immobilization+strategies+for+tissue+repair+and+regeneration.">Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration.</a> Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).</li><li>Crouzier, T., Fourel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presentation+of+BMP-2+from+a+soft+biopolymeric+film+unveils+its+activity+on+cell+adhesion+and+migration.">Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration.</a> Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).</li><li>Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+morphogenetic+protein+2+contains+a+heparin-binding+site+which+modifies+its+biological+activity.">Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity.</a> European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).</li><li>Love, J., Estroff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+of+thiolates+on+metals+as+a+form+of+nanotechnology.">Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).</li><li>Kato, K., Sato, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+histidine-tagged+recombinant+proteins+onto+micropatterned+surfaces+for+cell-based+functional+assays.">Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays.</a> Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).</li><li>Martins, M., Curtin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecularly+designed+surfaces+for+blood+deheparinization+using+an+immobilized+heparin-binding+peptide.">Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide.</a> J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).</li><li>Limbut, W., Kanatharana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+capacitive+immunosensors+based+on+self-assembled+monolayers+formed+from+thiourea,+thioctic+acid,+and+3-+mercaptopropionic+acid.">A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid.</a> Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).</li><li>Patel, N., Davies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+protein+molecules+onto+homogeneous+and+mixed+carboxylate-terminated+self-assembled+monolayers.">Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).</li><li>Hu, J., Duppatla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+PEGylation+of+bone+morphogenetic+protein-2+cysteine+analogues.">Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues.</a> Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).</li><li>Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGD+modified+polymers:+biomaterials+for+stimulated+cell+adhesion+and+beyond.">RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond.</a> Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).</li><li>Cao, T., Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+spacer+length+effect+on+immobilized+Escherichia+coli+pili-antibody+molecular+recognition+by+AFM.">Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM.</a> Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).</li><li>Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+to+immobilize+bioactive+proteins,+including+bone+morphogenetic+protein-4+(BMP-4),+on+titanium+alloy.">A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy.</a> Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).</li></ol>

יש מחברים אין לחשוף.

בפרוטוקול זה אנו מתארים את הכנת המשטחים פונקציונליות עם rhBMP-2 ביו. גישה זו כוללת שני שלבים: 1) היווצרות הראשונית של monolayer הרכבה עצמית (SAM) של מקשר bifunctional על משטח הזהב, 2) קיבוע קוולנטי של חלבון rhBMP-2. בעבודה קודמת, שתוקפים יעיל מחייב של מקשר bifunctional וגורם הגדילה, והוכחתי כי משותק משטח rhBMP-2 שומר על הפעילות הביולוגית שלו 19. הפעילות הביולוגית של גורמי גדילה המוצגים בצורה משותקת גם הוכח במחקרים אחרים, מצביעה על כך ששחרורו של החלבונים וההפנמה הבאה שלהם אינם חיוניים לתא גירוי 24,25. למעשה, חוסר התנועה קוולנטיים של גורמי גדילה מאפשרת גירוי המתמשך של תאי היעד, תוך שמירה על מינון יעיל בגלל שיעור התפוסה משופרת סוגים שונים של קולטנים בקרום התא 22,23,26-28. להכנת משטחי הצגה משותקת rhBMP-2, יש להיזהר בטיפול במשטחים לאורך ההליך כולו, ובהכנת פתרון rhBMP-2. Coverslips הזכוכית צריך להיות נקי ויבש ואין סימנים של פגם או זיהומים צריכים להיות גלויים. מגרד את פני השטח עם פינצטה וטפטפות יש להימנע. עבור שלב functionalization שטח באמצעות rhBMP-2, זה הכרחי להשתמש בחלבון רקומביננטי ללא ספק, כלומר ללא אלבומין בסרום השור הוסיף בהכנה, כדי למנוע חוסר תנועה לא רצויה של המוביל על פני השטח. RhBMP-2 המניות (100 מיקרוגרם / מיליליטר) היא מומס ב4 מ&quot;מ HCl. כאשר משטחים מודגרת עם פתרון rhBMP-2, ה-pH צריכה להיות מותאם לניטראלי לpH בסיסי הקל כדי לשפר את התגובה של קבוצת אמינו של החלבון עם קבוצת שירותי הבריאות של המקשר מחויב פני השטח. אם ה-pH נמוך מדי, קבוצת שירותי הבריאות יכולה להיות הידרוליזה לפני שהוא יכול להגיב בשנינותשעות קבוצות אמינו של החלבון. אנו משתמשים PBS המכילים 1 M NaCl 29 ולהוסיף rhBMP-2 ממניות ולאחר מכן להתאים את ה-pH עם KOH (10 מ&quot;מ). עם פרוטוקול זה שהשגנו קיבוע המוצלח של rhBMP-2 ביו על משטחים כי: 1) הקמנו גישת שני שלבים; 2) השתמשנו במקשר מתאים כדי להשיג מרחק מהמשטח ולקשור את החלבון ללא הפרעות גדולות עליה אינטראקציה עם קולטן. Alkanethiol האמין-reactive, אסתר 11-mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimide (MU-NHS), היה קשור למצע הזהב בצעד הראשון. כalkanethiols עצמי להרכיב על מתכות כמו זהב, ויצר monolayer הורה מאוד, הם להקל על הקישוט של משטחים עם מגוון רחב של מולקולות מקשר 30-32. SAM מגן ביומולקולות ממגע ישיר עם משטח מוצק, ובכך לצמצם את הסיכון של denaturation 32. יתר על כן, אורכו של מקשר גם קובע את ריאהctivity של SAM. קבוצות NHS של linkers בהיקף של לפחות עשר אטומים פחמן, כמו MU-NHS, נגישות יותר, וכתוצאה מכך חוסר תנועת חלבון מוגבר בהשוואה לקשירה לlinkers הקצרה 34. חוסר התנועה של rhBMP-2 מתרחשת באמצעות התזוזה של קבוצת שירותי הבריאות על ידי השאריות ליזין של החלבון 34. שוקל רק את הסביבה סטרית, התגובה של קבוצות NHS-משותק פני השטח הסביר ביותר מתרחשת בשאריות N-המסוף גמיש 35. עם זאת, כפי שמוצגים לligands אחר, לאורכה ואת הגמישות של מקשר עשוי לאפשר אינטראקציה עם אחרת sterically הפריע אתרי קישור, ובכך מפצים על נטייה שלילית 36,37. בעבודה שלא פורסמה לנו בהשוואה צעד אחד עם אסטרטגיה של קיבוע שני שלבים. ההשוואה בין שימוש בתמיסה המכילה חלבון וגם linkers, ועל פני השטח הרציף המחייבים של מקשר והחלבון, הראתה כי רק שניאסטרטגית צעד הביאה לחוסר תנועה ליגנד ביו. זה יכול להיות בגלל השפעת מיגון של SAM, אשר מעכבת חלבון denaturation כי אחר יכול להתרחש בזהב. יתר על כן, מאז מקשר כבר מעוגן אל פני השטח, הצמדה צולבת בין חלבונים באמצעות קבוצות סופו של מקשר והאיון וכתוצאה מכך שלהם לעקוף 38. לניסויים עם תאי מגורה עם משותק משטח rhBMP-2, זה הוא חיוני כדי לקבוע מראש שC2C12 לא בצורת myotubes בבקבוק התרבות לקראת זריעתם על המצע. לכן, תאים צריכים להישמר subconfluent בתרבות. הקבוצה של סרום שור עוברי המשמש לculturing ולניסויים יש להיבדק כדי לוודא ששום גירויי osteogenic נוכחים. זו מבוצעת על ידי באמצעות assay Quantikine לגילוי של חלבוני morphogenetic עצם ועל ידי בדיקת התאים לסמני בידול osteogenic, למשל alkal<html> ביטוי phosphatase ine. בעת טיפול במצעים לגירוי מהחלק העליון של תרבויות, זה שוב חשוב להימנע מסריטות עם פינצטה. ייבוש של התרבות והסחיטה של ​​התאים יש להימנע בכל מקרה, אחרת עיוות תא והמוות תהיה להשפיע לרעה על התגובה לBMP-2 גירוי. אנו ממליצים pipetting כ 100 μl של DMEM לבאר כל צלחת 6 היטב שבו התאים בתרבית לפני יישום המצע על גבי התאים. תאים צריכים להיות שנצפו תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שלא חלה שינויים מורפולוגיים מופעלים על ידי הנוכחות של המשטחים על גבי התרבויות. לבסוף, בעת הסרת מצעים, צד אחד הוא הרים בזהירות עם פינצטה והמצע הוא קילף בעדינות. בדיקה מיידית לכל נזק לתאים במיקרוסקופ שדה בהיר יש לבצע, כמו גם סימון של מצעים כדי לקבוע אם כל רצועות תא או זיהומים עיקריים הם הווה. _content &quot;&gt; לסיכום, ההליך בן שני שלבים שהוצג מספק כלי שימושי כדי לשתק rhBMP-2 על גבי מצעים באמצעות השאריות האמינים שלה כדי ללמוד את השפעתה על תגובות תאיות. האסטרטגיה שתוארה משלבת יתרונות רבים. מצד אחד, זה לא מוגבל ל BMP-2, אבל זה יכול להיות מיושם גם לגורמי גדילה אחרים של משפחת BMP, שכן הם מציגים את מבנה חומצת אמינו שמור ביותר. מצד השני, על ידי מניעת ספיחה לא ספציפית, גישה זו מאפשרת ממוקדת חקירה של BMP-2 , תוך הפחתת הכמות של גורם גדילה, ובעיקר, פוגע בשחרור מבוקר מהשטח.

חלבון morphogenetic עצם 2 (BMP-2) הוא חבר של גורם הפיכת צמיחת משפחה (TGF-β) ופועל כמשדל של דה נובו היווצרות עצם כמו גם רגולטור של כמה רקמות במהלך התפתחות עוברית ובוגר הומאוסטזיס 1-3. כל מונומר של BMP-2 החלבון homodimeric הפעיל הביולוגית מכיל מוטיב &quot;קשר ציסטאין&quot;, שזה שמור ביותר בכל 4 BMPs. שש משאריות ציסטאין שבע ליצור קשרי דיסולפיד intramolecular כי לייצב מונומר אחד, ואילו ציסטאין השביעי מעורבים בdimerization, ויצר אג&quot;ח מולקולאריים בין שני מונומרים 5,6. קשר ציסטאין השמור ביותר זה מגדיר את המבנה התל הממדי של חלבון BMP-2 וקובע את המאפיינים הייחודיים שלה, כגון עמידות מפני חום, denaturants וחומצי pH 7-9. BMP-2 נקשר לקולטנים הטרנסממברני קינאז סרין / תראונין, וכך גרימת הולכות אותות <sup&gt; 10-12. בהתאם למצב של oligomerization קולט, מסלולי איתות שונים מופעלים: מפל איתות הסמאד עצמאי מוביל לאינדוקצית phosphatase אלקליין באמצעות איתות p38, ואילו מסלול הסמאד תלוי מופעל על ידי תוצאות זרחון הקולטן בטרנסלוקציה הסמאד המורכבת גרעינית והפעלה של שעתוק של גנים ספציפיים יעד, כגון המעכב של התמיינות (Id) 12-14. בעצמות, BMP-2 גורם להתמיינות של תאי גזע mesenchymal לאוסטאובלסטים, וכך מגרה את הריפוי והיווצרות דה נובו של עצם. נכון לעכשיו, recombinantly הביע BMP-2 מוחל קליני כדי לשפר את הריפוי של אתרים שבורים. אסטרטגיה נפוצה בהנדסת רקמות עצם היא השימוש בגורמי גדילה בזריקות, שהוא פחות פולשני בהשוואה למערכות אספקה ​​מקומיות. עם זאת, במחקרי vivo ויישומים קליניים הראו כי זמן מחצית החיים הביולוגיים קצרים, loc הנוקבalization וסליקה מקומית מהירה של BMP-2 עשויים להוביל למספר בעיות מקומיות, מחוץ לרחם ומערכתית 15. לפיכך, כדי להשיג מצגת יעילה, המלכוד או חוסר תנועה של BMP-2 בתוך או על גבי חומרים הכרחי למסירה באתר היעד מתמשכת והמקומית שלה. משלוח מתמשך ניתן להשיג עם גישות שימור שאינו קוולנטיים, כגון הילכדות פיזית, ספיחה או complexation יון 16. עם זאת, ידוע כי ספיחה לא ספציפית של חלבונים על משטחים עשויות תוצאות בdenaturation של המולקולות 17. לקוולנטיים המחייב של גורמי גדילה, סוגים שונים של תומך פותחו בעשור האחרון. השימוש במולקולות מקשרים bifunctional כי יעד קבוצות אמינו או carboxyl של החלבון לדוגמא, הוא סוג אחד גישה שלא בהכרח דורש שינוי חלבון כדי להשיג קיבועה של. למעשה, בעוד שינוי החלבון מציע את היתרון של השליטה נטייה חלבון,המבוא של תחומים מלאכותיים, תגי פפטיד ורשתות באתר ספציפי עשוי לשנות את הפעילות הביולוגית של גידול גורמי 17. לכן, כדי לעקוף denaturation עקב אינטראקציה עם חומר התמיכה, יכולים להיות פונקציונליות משטחים מראש, למשל, עם monolayer עצמי התאספו (SAM) של מולקולה המקשרת, ואחריו צימוד של הגורם הרצוי 18. יש לנו בשימוש בגישה מבוססת SAM כדי לשתק קוולנטית BMP-2 על גבי משטח על ידי מיקוד השאריות האמינים בחינם והראינו כי החלבון המשותק שומר גם הפעילות הביולוגית לטווח קצר והארוך שלה 19. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה ויעילה כדי לספק BMP-2 לתאים לבדיקות במבחנה על המנגנונים שמתרחשים בקרום התא ומווסתים את האיתות תאית אחראית לאיתות osteogenic.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(dimethylamino)pyridin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>522805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11-mercaptoundecanoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>674427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichlormethane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-dicyclohexylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D80002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum benzene</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>M 875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylacetate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhBMP-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>355-BM</td>
			<td>Carrier-free; expressed in E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN00.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethyl siloxane) (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rhBMP-2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampliflu Red assay</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Sterile filtered, cell culture tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine (0.1 M)</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 (1%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Lysis buffer (ALP assay)19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HNO3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3533.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenylphosphate (pNPP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0942</td>
			<td>Phosphatase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mysin heavy chain (MHC)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa</td>
			<td>MF20</td>
			<td>Monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz</td>
			<td>BANDELIN electronic GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MED 020 Sputtercoating system</td>
			<td>BAL-TEC AG</td>
			<td></td>
			<td>Coating conditions 
			Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec 
			Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M200 Plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent binding of bmp-2 on surfaces using a self-assembled monolayer approach

morphogenetic עצם חלבון 2 (BMP-2) הוא גורם גדילה משובץ במטריצה ​​תאית של רקמת עצם. BMP-2 משמש כהדק של התמיינות תאי mesenchymal לאוסטאובלסטים, וכך מגרה ריפוי והיווצרות עצם נובו דה. השימוש הקליני של אנושי רקומביננטי BMP-2 (rhBMP-2) בשיתוף עם פיגומים העלה מחלוקות האחרונות, המבוסס על המצב של מצגת ואת הסכום כדי להיות מועבר. הפרוטוקול המובא כאן מספק דרך פשוטה ויעילה כדי לספק BMP-2 לבדיקות במבחנה בתאים. אנו מתארים כיצד ליצור monolayer עצמית התאספו בהיקף של מקשר heterobifunctional, ולהראות את הצעד מחייב שלאחר מכן כדי להשיג קיבוע קוולנטי של rhBMP-2. עם גישה זו אפשר להשיג מצגת מתמשכת של BMP-2 תוך שמירה על הפעילות הביולוגית של החלבונים. למעשה, חוסר התנועה של BMP-2 המשטח מאפשרת חקירות ממוקדות על ידי מניעת מודעות נוקבותorption, תוך הפחתת הכמות של גורם גדילה, ובעיקר, פוגע בשחרור מבוקר מהשטח. שני אירועי האיתות לטווח קצר וארוך מופעלים על ידי BMP-2 מתרחשים כאשר תאים נחשפים למשטחי הצגה משותקים קוולנטית rhBMP-2, מה שהופך את הגישה הזאת מתאימה למחקרים במבחנה בתגובות תא לBMP-2 גירוי.

בהתקנה שלנו, זהב נבחר כחומר לא פעיל מאז שהיא מספקת מערכת ביולוגית נוקבת אבל כימי מתכונן. יתר על כן, היישום של monolayers הרכבה העצמית כרוך יתרונות רבים: סאמס לספוג באופן ספונטני באמצעות &quot;ראש הקבוצות&quot; שלהם על מתכות וmonolayers טופס עם כמה פגמים, ואילו ניתן לשנות קצה הקבוצות הפונקציונלית שלהם עוד יותר. כך שהם מספקים פלטפורמה ללהתאים את המאפיינים של הממשק בצורה עדיין ישימה מאוד מבוקרת 20. לחוסר התנועה של BMP-2 על משטחים מצופים זהב, השתמשנו בגישת שני שלבים: 1) מחייב מקשר MU-NHS לשכבת הזהב, ולאחר מכן 2) מגיב מקשר עם החלבון (ראו איור 1). כדי להוכיח המחייבים של rhBMP-2, השתמשנו immunoassay אנזים. ב assay זה, משטחי הצגה משותק rhBMP-2 הודגרו עם נוגדן BMP-2 ספציפי ושני נוגדנים מצומדות עם HRP. הכריכה של זה האחרון יכולה להיות Determined באמצעות פתרון Ampliflu אדום. בנוכחות מי חמצן, HRP מזרז את ההמרה של Ampliflu האדום חסר צבע (10-אצטיל-3 ,7-dihydroxyphenoxazine) לresorufin מתחם הניאון. זיהינו משטח המשותק rhBMP-2 (iBMP-2) לפני ואחרי מתקרב תאים חסיד מלמעלה עם משטחים פונקציונליות. אנא שים לב כי לצורך זיהוי של rhBMP עם assay Ampliflu האדום, הדגימות כפופות למספר צעדי דגירה וטיפולים. לכן, זה לא ריאלי כדי לחקור את אותו המשטח לפני ואחרי גירוי תא. איור 2A תערוכות מוצלחת מחייב של rhBMP-2 אל פני השטח בקונפורמציה מוכרת על ידי אנטי BMP-2 IgG. איור 2B מראה iBMP- 2 פני השטח ששימש לעורר תאים ל30 דקות לפני immunoassay HRP. גם לאחר גירוי תא החלבון מזוהה על פני השטח. תגובות תא למשטחי הצגת RH המשותקBMP-2 הוערכו ובהשוואה להשפעה של מצעי זהב שאינם מטופלים (בקרה שלילית). על מנת למזער את ההשפעה של תהליך ההדבקה על הניתוח של האיתות לטווח הקצר, הגדרה מיוחדת שפותחה לגירוי תא. הנה, תאי C2C12 היו מגורה ל30 דקות על ידי rhBMP-2 משטחים פונקציונליות המתקרבים מלמעלה. שורת התאים והיצמדות למנגנון עכבר C2C12 היא קו pluripotent mesenchymal תא מבשר, אשר נעשה שימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד את השלב המוקדם של בידול osteogenic במהלך היווצרות עצם ברקמות שרירים. במודל זה, BMP-2 מעכב את ההתמיינות של תאים לmyotubes multinucleated וגורם לאוסטאובלסטים פנוטיפים 21. ההפעלה של סמאד 1/5/8, שהם עיתונאים במורד הזרם של מסלול איתות BMP-2, הוא נותח על ידי מערבי סופג. כפי שניתן לראות באיור 3 א, זירחון הסמאד הוא ציין לאחר גירוי 30 דקות על ידי iBMP-2, בעוד שאף זירחון של סמאד 1/5/8 מתרחשבתאים שנחשפו לדגימות זהב שלא טופלו. תוצאה זו מצביעה על כך שתהליך הקיבוע אינו משנה BMP-2 פעילות לטווח קצר ומפעיל צעדים בשלב מוקדם באיתות הסמאד. כדי לקבוע אם iBMP-2 משפיע על התמיינות osteogenic לטווח ארוך, רמת הביטוי של phosphatase אלקליין (ALP), סמן osteogenic, נחקר על ידי assay colorimetric. פעילות ALP של תאי C2C12 נמדדה לאחר דוגרים התאים במשך 6 ימים בזהב רגיל (שליטה) וiBMP-2 משטחים. פעילות ALP בlysates של תאים בתרבית על iBMP-2 משטחים תערוכות קליטה גבוהה יותר באופן משמעותי בהשוואה לביקורת (איור 3 ב). תוצאה זו עולה כי iBMP-2 גורם לביטוי של ALP הסמן osteogenic בתאי C2C12. שורת תא זו ידועה להבדיל על confluency לכת בתנאי בסרום נמוך, ובכך יוצר myotubes ולבטא חלבוני myogenic אופייניים. עם זאת, טיפול עם BMP-2 גורם לשינוי במסלול הבידול מmyoblastic לosteoblastic, ולכן דיכוי היווצרות myotubes. כדי לחקור את ההשפעה של iBMP-2 בmyogenesis, תאי C2C12 היו מצופים באופן ישיר על זהב (שליטה) או משטחים ותרבותיים תחת בידול תנאים (סרום נמוך) פונקציונליות. לאחר 6 ימים, הכתמה של שרשרת שרירן כבדה (MHC) בוצעה. כפי שמוצג באיור 3 ג, תאי C2C12 להיכשל כדי ליצור myotubes החיובי MHC בנוכחות של iBMP-2, אבל לא על מצעי זהב. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50842/50842fig1.jpg" /> איור 1. ערכה של תהליך הקיבוע של rhBMP-2 על גבי משטחי זהב. Coverslips הזכוכית מצופות בשכבת זהב ולאחר מכן הודגרו עם מקשר heterobifunctional (MU-NHS) וכתוצאה מכך בשכבה עצמית התאספו פונקציונליות-NHS (SAM). אמינים ראשוניים של BMP-2 מגיבים עם מקשר שמוביל לשיתוףחלבון משותק valently על פני המצע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50842/50842fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/50842/50842fig2.jpg" /> איור 2. בכריכת פני השטח ניתן לאתרם rhBMP-2 על ידי immunoassay האנזימטית לפני (), כמו גם לאחר (ב) ניסויי גירוי תא. ללא יכולת לזוז rhBMP-2 היה לכמת באמצעות assay colorimetric Ampliflu האדום. הקליטה נמדדה ב 570 ננומטר והנתונים היו מנורמלים לשלוט (לא לטפל במשטחי זהב) ערכים. ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן מן הממוצע n&gt; 3. <img alt="איור 3" fo:content-width="2.6in" src="/files/ftp_upload/50842/50842fig3.jpg" /> איור 3. משותק rhBMP-2 נשאר פעילים מבחינה ביולוגית וגורם לטווח קצר כמוגם אירועי איתות לטווח ארוך. (א) בתאי C2C12 היו מגורה ל30 דקות על ידי חשיפה למשטחי זהב (שליטה) ומשטחים עם משותק קוולנטית rhBMP-2 (iBMP-2) מתקרב מלמעלה. לאחר תמוגה תא, דגימות immunoblotted לp-Smad1/5/8 וβ-אקטין. (ב &#39;) את הפעילות האנזימטית של phosphatase אלקליין (ALP) מצביעה על בידול osteogenic של תאי C2C12 ונמדדה מlysates התא לאחר דגירה 6 ימים תקופה בשליטה או iBMP-2 משטחים, בהתאמה. פעילות ALP נמדדה כספיגה ב 405 ננומטר. נתונים שנרכשו לאחר תגובת 60 דקות מראה גרף עמודות. הברים השגיאה מצביעים על סטיית תקן, n = 3, * p &lt;0.01. תאי C2C12 (ג) היו זורעים על משטחים ותרבית הצביעו עבור 6 ימים בתנאי סרום נמוכים כדי לאפשר myogenesis. תמונות מראות שרשרת שרירן כבדה מכתים (MHC) של myotubes multinucleated (ירוקה) ומכתים DAPI גרעינים (כחול). 20x הגדלת תמונה.

Watch this Scientific Journal Video about Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach at JoVE.com

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

אנו מתארים שיטה לביצוע קיבוע יעיל של BMP-2 על גבי משטחים. הגישה שלנו מבוססת על היווצרות monolayer עצמי התאספו כדי להשיג את הקשר הקוולנטי של BMP-2 באמצעות השאריות האמינים שלה בחינם. שיטה זו היא כלי שימושי כדי ללמוד איתות בקרום התא.

קוולנטיים עקידת BMP-2 על משטחים באמצעות גישה חד שכבתי התאסף עצמית

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

covalent-binding-bmp-2-on-surfaces-using-self-assembled-monolayer

Google

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Chemistry

Unit 1

Covalent Bonding and Structure

SCIENTISTS IN ACTION

13.8K Views.  University of Heidelberg.  אנו מתארים שיטה לביצוע קיבוע יעיל של BMP-2 על גבי משטחים. הגישה שלנו מבוססת על היווצרות monolayer עצמי התאספו כדי להשיג את הקשר הקוולנטי של BMP-2 באמצעות השאריות האמינים שלה בחינם. שיטה זו היא כלי שימושי כדי ללמוד איתות בקרום התא. 

Video: Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing and maintaining primary and pluripotent stem cell derived hepatocytes. While biological matrices are useful, they permit short term culture of hepatocytes, limiting their widespread application. We have attempted to overcome the limitations using a synthetic polymer coating. Polymers represent one of the broadest classes of biomaterials and possess a wide range of mechanical, physical and chemical properties, which can be fine-tuned for purpose. Importantly, such materials can be scaled to quality assured standards and display batch-to-batch consistency. This is essential if cells are to be expanded for high through-put screening in the pharmaceutical testing industry or for cellular based therapy. Polyurethanes (PUs) are one group of materials that have shown promise in cell culture. Our recent progress in optimizing a polyurethane coated surface, for long-term culture of human hepatocytes displaying stable phenotype, is presented and discussed.

This article will focus on developing polymer coated surfaces for long-term, stable culture of stem cell derived human hepatocytes.

ייצוב Hepatocellular הפנוטיפ באמצעות משטחים סינטטיים אופטימליים

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in understanding contaminant mass transport and the ability to decontaminate materials. If a material is contaminated, over time, the transport of highly toxic chemicals (such as chemical warfare agent species) out of the material can result in vapor exposure or transfer to the skin, which can result in percutaneous exposure to personnel who interact with the material. Due to the high toxicity of chemical warfare agents, the release of trace chemical quantities is of significant concern. Mapping subsurface concentration distribution and transport characteristics of absorbed agents enables exposure hazards to be assessed in untested conditions. Furthermore, these tools can be used to characterize subsurface reaction dynamics to ultimately design improved decontaminants or decontamination procedures. To achieve this goal, an inverse analysis mass transport modeling approach was developed that utilizes time-resolved mass spectroscopy measurements of vapor emission from contaminated paint coatings as the input parameter for calculation of subsurface concentration profiles. Details are provided on sample preparation, including contaminant and material handling, the application of mass spectrometry for the measurement of emitted contaminant vapor, and the implementation of inverse analysis using a physics-based diffusion model to determine transport properties of live chemical warfare agents including distilled mustard (HD) and the nerve agent VX.

In this paper, a procedure for quantifying the mass transport parameters of chemicals in various materials is presented. This process involves employing an inverse-analysis based diffusion model to vapor emission profiles recorded by real-time, mass spectrometry in high vacuum.

גישה הפוכה ניתוח לאפיון כימי תחבורה בצבעים

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Facile Preparation of Internally Self-assembled Lipid Particles Stabilized by Carbon Nanotubes

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled (functionalized) CNTs are used as stabilizers to produce Pickering type oil-in-water (O/W) emulsions. Lipids namely, Dimodan U and Phytantriol are used as emulsifiers, which in excess water self-assemble into the bicontinuous cubic Pn3m phase. This highly viscous phase is fragmented into smaller particles using a probe ultrasonicator in presence of conventional surfactant stabilizers or CNTs as done here. Initially, the CNTs (powder form) are dispersed in water followed by further ultrasonication with the molten lipid to form the final emulsion. During this process the CNTs get coated with lipid molecules, which in turn are presumed to surround the lipid droplets to form a particulate emulsion that is stable for months. The average size of CNT-stabilized nanostructured lipid particles is in the submicron range, which compares well with the particles stabilized using conventional surfactants. Small angle X-ray scattering data confirms the retention of the original Pn3m cubic phase in the CNT-stabilized lipid dispersions as compared to the pure lipid phase (bulk state). Blue shift and lowering of the intensities in characteristic G and G&#39; bands of CNTs observed in Raman spectroscopy characterize the interaction between CNT surface and lipid molecules. These results suggest that the interactions between the CNTs and lipids are responsible for their mutual stabilization in aqueous solutions. As the concentrations of CNTs employed for stabilization are very low and lipid molecules are able to functionalize the CNTs, the toxicity of CNTs is expected to be insignificant while their biocompatibility is greatly enhanced. Hence the present approach finds a great potential in various biomedical applications, for instance, for developing hybrid nanocarrier systems for the delivery of multiple functional molecules as in combination therapy or polytherapy.

We report on a smart application of carbon nanotubes for kinetic stabilization of lipid particles that contain self-assembled nanostructures in their cores. The preparation of lipid particles requires rather low concentrations of carbon nanotubes permitting their use in biomedical applications such as drug delivery.

הכנה קלילה של פנימית עצמית התאספו חלקיקים ליפידים מיוצב על ידי פחמן

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled ...

Highly Stable, Functional Hairy Nanoparticles and Biopolymers from Wood Fibers: Towards Sustainable Nanotechnology

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While metal-based nanoparticles are associated with synthetic and environmental hassles, cellulose introduces a green, sustainable alternative for nanoparticle synthesis. Here, we present the chemical synthesis and separation procedures to produce new classes of hairy nanoparticles (bearing both amorphous and crystalline regions) and biopolymers based on wood fibers. Through periodate oxidation of soft wood pulp, the glucose ring of cellulose is opened at the C2-C3 bond to form 2,3-dialdehyde groups. Further heating of the partially oxidized fibers (e.g., T = 80 &#176;C) results in three products, namely fibrous oxidized cellulose, sterically stabilized nanocrystalline cellulose (SNCC), and dissolved dialdehyde modified cellulose (DAMC), which are well separated by intermittent centrifugation and co-solvent addition. The partially oxidized fibers (without heating) were used as a highly reactive intermediate to react with chlorite for converting almost all aldehyde to carboxyl groups. Co-solvent precipitation and centrifugation resulted in electrosterically stabilized nanocrystalline cellulose (ENCC) and dicarboxylated cellulose (DCC). The aldehyde content of SNCC and consequently surface charge of ENCC (carboxyl content) were precisely controlled by controlling the periodate oxidation reaction time, resulting in highly stable nanoparticles bearing more than 7 mmol functional groups per gram of nanoparticles (e.g., as compared to conventional NCC bearing &#60;&#60; 1 mmol functional group/g). Atomic force microscopy (AFM), transmission electron microscopy (TEM), and scanning electron microscopy (SEM) attested to the rod-like morphology. Conductometric titration, Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), nuclear magnetic resonance (NMR), dynamic light scattering (DLS), electrokinetic-sonic-amplitude (ESA) and acoustic attenuation spectroscopy shed light on the superior properties of these nanomaterials.

Synthesis schemes to prepare highly stable wood fiber-based hairy nanoparticles and functional cellulose-based biopolymers have been detailed.

מאוד יציבים, חלקיקים שעירים פונקציונליים Biopolymers סיבי עץ: לקראת ננוטכנולוגיה קיימא

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While ...

Microfluidic-based Synthesis of Covalent Organic Frameworks (COFs): A Tool for Continuous Production of COF Fibers and Direct Printing on a Surface

Covalent Organic Frameworks (COFs) are a class of porous covalent materials which are frequently synthesized as unprocessable crystalline powders. The first COF was reported in 2005 with much effort centered on the establishment of new synthetic routes for its preparation. To date, most available synthetic methods for COF synthesis are based on bulk mixing under solvothermal conditions. Therefore, there is increasing interest in developing systematic protocols for COF synthesis that provide for fine control over reaction conditions and improve COF processability on surfaces, which is essential for their use in practical applications. Herein, we present a novel microfluidic-based method for COF synthesis where the reaction between two constituent building blocks, 1,3,5-benzenetricarbaldehyde (BTCA) and 1,3,5-tris(4-aminophenyl)benzene (TAPB), takes place under controlled diffusion conditions and at room temperature. Using such an approach yields sponge-like, crystalline fibers of a COF material, hereafter called MF-COF. The mechanical properties of MF-COF and the dynamic nature of the approach allow the continuous production of MF-COF fibers and their direct printing onto surfaces. The general method opens new potential applications requiring advanced printing of 2D or 3D COF structures on flexible or rigid surfaces.

Microfluidic-based Synthesis of Covalent Organic Frameworks COFs: A Tool for Continuous Production of COF Fibers and Direct Printing on a Surface

We present a novel microfluidic-based method for synthesis of covalent organic frameworks (COFs). We demonstrate how this approach can be used to produce continuous COF fibers, and also 2D or 3D COF structures on surfaces.

Microfluidic מבוסס סינתזה של מסגרות אורגני קוולנטי (COF): כלי לייצור רציף של סיבים COF והדפסה ישירה על משטח

Covalent Organic Frameworks (COFs) are a class of porous covalent materials which are frequently synthesized as unprocessable crystalline powders. The ...

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces are demonstrated. This work requires careful design, considerable synthetic effort, and proper analysis. The rotary motion of the molecular motor in solution is shown by 1H NMR and UV-vis absorption spectroscopy techniques. In addition, the method to graft the motor onto an amine-coated quartz is described. This method helps to gain more insight into molecular machines.

The manuscript describes how to synthesize and graft a molecular motor on surfaces for single molecular imaging.

מונחי-אור המנועים המולקולריים על משטחים עבור יחיד הדמיה מולקולרית

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass spectrometry (MS) of complex molecules and their reactions on surfaces. DINeC is based on a beam of SO2 clusters impacting on the sample surface at low cluster energy. During cluster-surface impact, some of the surface molecules are desorbed and ionized via dissolvation in the impacting cluster; as a result of this dissolvation-mediated desorption mechanism, low cluster energy is sufficient and the desorption process is extremely soft. Both surface adsorbates and molecules of which the surface is composed of can be analyzed. Clear and fragmentation-free spectra from complex molecules such as peptides and proteins are obtained. DINeC does not require any special sample preparation, in particular no matrix has to be applied. The method yields quantitative information on the composition of the samples; molecules at a surface coverage as low as 0.1 % of a monolayer can be detected. Surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition can be observed in real-time and the kinetics of the reactions can be deduced. Using a pulsed nozzle for cluster beam generation, DINeC can be efficiently combined with ion trap mass spectrometry. The matrix-free and soft nature of the DINeC process in combination with the MSn capabilities of the ion trap allows for very detailed and unambiguous analysis of the chemical composition of complex organic samples and organic adsorbates on surfaces.

Neutral SO2 clusters of low kinetic energy (&#60; 0.8 eV/constituent) are used to desorb complex surface molecules such as peptides or lipids for further analysis by means of mass spectrometry using an ion trap mass spectrometer. No special sample preparation is required, and real-time observation of reactions is possible.

ניתוח של מולקולות מורכבות והתגובות שלהם על משטחים באמצעות מצבר-המושרה באמצעות אשכול/אינון המסה ספקטרומטריה

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and surfaces. For a true single molecule experiment, covalent attachment of the probe molecule is essential because only then can hundreds of force-extension traces with one and the same single molecule be obtained. Many traces are in turn necessary to prove that a single molecule alone is probed. Additionally, passivation is crucial for preventing unwanted interactions between the single probe molecule and the AFM cantilever tip as well as between the AFM cantilever tip and the underlying surface. The functionalization protocol presented here is reliable and can easily be applied to a variety of polymers. Characteristic single molecule events (i.e., stretches and plateaus) are detected in the force-extension traces. From these events, physical parameters such as stretching force, desorption force and desorption length can be obtained. This is particularly important for the precise investigation of stimuli-responsive systems at the single molecule level. As exemplary systems poly(ethylene glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) and polystyrene (PS) are stretched and desorbed from SiOx (for PEG and PNiPAM) and from hydrophobic self-assembled monolayer surfaces (for PS) in aqueous environment.

Covalent attachment of probe molecules to atomic force microscopy (AFM) cantilever tips is an essential technique for the investigation of their physical properties. This allows us to determine the stretching force, desorption force and length of polymers via AFM-based single molecule force spectroscopy with high reproducibility.

חיבור קוולנטי של מולקולות בודדות לספקטרוסקופיית כוחות מבוססי AFM

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Synthesis of pH Dependent Pyrazole, Imidazole, and Isoindolone Dipyrrinone Fluorophores using a Claisen-Schmidt Condensation Approach

Methine-bridged conjugated bicyclic aromatic compounds are common constituents of a range of biologically relevant molecules such as porphyrins, dipyrrinones, and pharmaceuticals. Additionally, restricted rotation of these systems often results in highly to moderately fluorescent systems as observed in 3H,5H-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f]pyrimidin-3-ones, xanthoglows, pyrroloindolizinedione analogs, BODIPY analogs, and the phenolic and imidazolinone ring systems of Green Fluorescent Protein (GFP). This manuscript describes an inexpensive and operationally simple method of performing a Claisen-Schmidt condensation to generate a series of fluorescent pH dependent pyrazole/imidazole/isoindolone dipyrrinone analogs. While the methodology illustrates the synthesis of dipyrrinone analogs, it can be translated to produce a wide range of conjugated bicyclic aromatic compounds. The Claisen-Schmidt condensation reaction utilized in this method is limited in scope to nucleophiles and electrophiles that are enolizable under basic conditions (nucleophile component) and non-enolizable aldehydes (electrophile component). Additionally, both the nucleophilic and electrophilic reactants must contain functional groups that will not inadvertently react with hydroxide. Despite these limitations, this methodology offers access to completely novel systems that can be employed as biological or molecular probes.

The Claisen-Schmidt condensation reaction is an important methodology for the generation of methine-bridged conjugated bicyclic aromatic compounds. Through utilizing a base-mediated variant of the aldol reaction, a range of fluorescent and/or biologically relevant molecules can be accessed through a generally inexpensive and operationally simple synthetic approach.

סינתזה של pH תלוי Pyrazole, Imidazole, ו Isoindolone דיפירינון פלואורופורים באמצעות גישת עיבוי Claisen-שמידט

Methine-bridged conjugated bicyclic aromatic compounds are common constituents of a range of biologically relevant molecules such as porphyrins, ...

Analysis of Organochlorine Pesticides in a Soil Sample by a Modified QuEChERS Approach Using Ammonium Formate

Currently, the QuEChERS method represents the most widely used sample preparation protocol worldwide for analyzing pesticide residues in a broad variety of matrices both in official and non-official laboratories. The QuEChERS method using ammonium formate has previously proven to be advantageous compared to the original and the two official versions. On the one hand, the simple addition of 0.5 g of ammonium formate per gram of sample is sufficient to induce phase separation and achieve good analytical performance. On the other hand, ammonium formate reduces the need for maintenance in routine analyses. Here, a modified QuEChERS method using ammonium formate was applied for the simultaneous analysis of organochlorine pesticide (OCP) residues in agricultural soil. Specifically, 10 g of the sample was hydrated with 10 mL of water and then extracted with 10 mL of acetonitrile. Next, phase separation was carried out using 5 g of ammonium formate. After centrifugation, the supernatant was subjected to a dispersive solid-phase extraction clean-up step with anhydrous magnesium sulfate, primary-secondary amine, and octadecylsilane. Gas chromatography-mass spectrometry was used as the analytical technique. The QuEChERS method using ammonium formate is demonstrated as a successful alternative for extracting OCP residues from a soil sample.

The present protocol describes the utilization of ammonium formate for phase partitioning in QuEChERS, together with gas chromatography-mass spectrometry, to successfully determine organochlorine pesticide residues in a soil sample.

ניתוח של חומרי הדברה אורגנוכלורין בדגימת קרקע על ידי גישת QuEChERS שונה באמצעות פורמט אמוניום

Currently, the QuEChERS method represents the most widely used sample preparation protocol worldwide for analyzing pesticide residues in a broad variety ...