Agradecemos al Prof. JP Spatz (Departamento de Química Biofísica, Universidad de Heidelberg y el Departamento de Nuevos Materiales y Biosystems, Instituto Max Planck para Sistemas Inteligentes, Stuttgart) por su amable apoyo. El apoyo financiero de la Max-Planck-Gesellschaft y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 a EAC-A.) También se reconoce en gran medida.

1. Síntesis de 11-Mercaptoundecanoyl-N-hidroxisuccinimida éster (MU-NHS) <ol><li> Añadir gota a gota una solución de 500 mg de N-hidroxisuccinimida y 30 mg de 4 - (dimetilamino) piridina en 10 ml de acetona (PA) a 1 g de ácido 11-mercaptoundecanoico en 40 ml de diclorometano (PA) a temperatura ambiente (RT). </li><li> Enfriar la reacción a 0 ° C y añadir gota a gota 1,1 g de N, N &#39;-diciclohexilcarbodiimida en 10 ml de diclorometano (bajo atmósfera de nitrógeno). Mantener la reacción a baja temperatura durante 1 hora y después se agita a TA durante la noche. </li><li> Se filtra el precipitado y se seca a presión reducida. El producto se purifica mediante cromatografía flash con benceno petróleo y acetato de etilo (pa) en una proporción de 1:1. </li></ol> 2. Preparación de capas de oro homogéneos <ol><li> Cubreobjetos de vidrio limpias con toallitas de precisión y sonicar ellos durante 5 minutos en una solución que contiene una mezcla 1:1 de acetato de etilo (pa) y metanol (pa). Rinse sustratos con metanol y se secan bajo flujo de nitrógeno. </li><li> Coloca los sustratos limpios en el dispositivo de revestimiento por bombardeo iónico. Evacuar la cámara. Retire la capa de óxido de cromo superior de la meta de cromo mediante pulverización durante 60 segundos. Colocar las muestras por debajo de la viga de metal y recubrirlos con una capa de cromo de 10 nm, seguido por recubrimiento con una capa de oro de 40 nm. </li></ol> 3. Inmovilización de la superficie de la BMP-2 <ol><li> Disolver MU-NHS en N, N-dimethlyformamide (DMF) a una concentración final de aproximadamente 1 mM y se incuba sustratos de oro en la solución MU-NHS a TA durante 4 h bajo atmósfera de nitrógeno. </li><li> Superficies Someter a ultrasonidos en DMF durante 2 min, enjuague con DMF y MeOH y se secan bajo flujo de nitrógeno. </li><li> Preparar una solución madre de rhBMP-2 en HCl 4 mM estéril con una concentración de 100 g / ml (almacenar alícuotas a -80 ° C). Para diluciones de trabajo (3,5 mg / ml), se diluye la solución madre en PBS / NaCl (PBS que contenía 1 M de NaCl) y unJUSTE a pH 8,5 inmediatamente antes del uso. </li><li> Incubar superficies funcionalizadas MU-NHS en la solución de trabajo de rhBMP-2 a 4 ° C durante la noche. Aspirar el sobrenadante de la incubación. Superficies Sonicar en PBS / NaCl durante 2 minutos y se lavan 3 veces con PBS estéril / NaCl. </li></ol> 4. Caracterización de superficies <ol><li> Para bloquear la adsorción no específica del anticuerpo, se incuban las superficies con un 5% de BSA (w / v) en solución de PBS durante 1 hora a TA, seguido de incubación con un anticuerpo anti-BMP-2 (1:100 en 1% (w / v ) solución de BSA / PBS) durante 1 hora a TA. Lave las superficies dos veces con PBS y déjelos en remojo durante 30 seg. </li><li> Incubar sustratos con anticuerpo secundario conjugado con HRP (1:1000 en 1% (w / v) de solución de BSA / PBS) durante 30 min a TA, a continuación, lavar dos veces con PBS. </li><li> Utilice ensayo de rojo Ampliflu para medir la actividad enzimática de HRP a 570 nm con un lector de placas. </li></ol> 5. Análisis de la Actividad Biológica <ol><li> Seed 1 x 10 5 ratón mioblastos C2C12 por pocillo en 6 pocillos plAtes en medio de crecimiento, que consisten en un DMEM de alta glucosa que contenía piruvato suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina y se incuba durante 24 horas a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Morir de hambre las células en DMEM libre de suero durante 3-5 horas antes de la siembra en las superficies decoradas con inmovilizada BMP-2. </li><li> Para la investigación de la inducción de la señalización de corto plazo, sustituir el medio por 200 l DMEM libre de suero y colocar los inmovilizados BMP-2 superficies superiores a las células. La superficie debe ser manejado con pinzas de punta fina para evitar que se raye. </li><li> Retire suavemente las superficies y aspirar el medio con una pipeta, se lavan las células dos veces con PBS. Continúe con el análisis de las respuestas de células. </li><li> Para el análisis de la actividad biológica a largo plazo, células de la placa en las superficies y la cultura ellos a 37 ° C / 5% de CO 2 en condiciones de suero bajas (2% de FBS) durante seis días. </li></ol>

<ol>
	<li>Helm, G., Andersson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+statement:+Bone+morphogenetic+proteins:+Basic+science.">Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science.</a> Spine. 27 (16S), S9 (2002).</li><li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins:+multifunctional+regulators+of+vertebrate+development.">Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development.</a> Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).</li><li>Reddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs:+from+bone+morphogenetic+proteins+to+body+morphogenetic+proteins.">BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).</li><li>Rengachary, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins:+basic+concepts.">Bone morphogenetic proteins: basic concepts.</a> Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).</li><li>Schlunegger, M., Gru&#776;tter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+feature+revealed+by+the+crystal+structure+at+2.2+&#197;;+resolution+of+human+transforming+growth+factor-&#946;2.">An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 &#197;; resolution of human transforming growth factor-&#946;2.</a> Nature. 358, 430-434 (1992).</li><li>Scheufler, C., Sebald, W., Hu&#776;lsmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+bone+morphogenetic+protein-2+at+2.7+&#197;+resolution.">Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 &#197; resolution.</a> J. 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Los autores tienen nada que revelar.

En este protocolo se describe la preparación de superficies funcionalizadas con rhBMP-2 bioactivo. Este enfoque comprende dos etapas: 1) la formación inicial de una monocapa auto-montaje (SAM) de un conector bifuncional en la superficie de oro, 2) la inmovilización covalente de la proteína rhBMP-2. En trabajos anteriores, hemos validado la unión efectiva del enlazador bifuncional y el factor de crecimiento, y demostramos que superficie inmovilizada rhBMP-2 mantiene su actividad biológica 19. La bioactiv...

Proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2) es un miembro del factor de crecimiento transformante (TGF-β) de la familia y actúa como inductor de la formación de novo de hueso, así como regulador de varios tejidos durante el desarrollo embrionario y adulto homeostasis 1-3. Cada monómero de la proteína biológicamente activa homodimérica BMP-2 contiene un motivo de &quot;nudo de cisteína&quot;, que está altamente conservada en todas las BMP 4. Seis de los siete residuos de cisteína forman enlaces disulfuro intramoleculares que estabilizan cada monómero, mientras que la séptima cisteína está involucrado en la dimerización, formando un enlace intermolecular entre los dos monómeros 5,6. Este nudo de cisteína altamente conservados define la estructura tridimensional de la proteína BMP-2 y determina sus propiedades únicas, tales como resistencia al calor, desnaturalizantes y ácida de pH 7-9. BMP-2 se une a receptores transmembrana quinasa serina / treonina, induciendo de este modo la transducción de señales <sup&gt; 10-12. Dependiendo del modo de oligomerización del receptor, diferentes vías de señalización se activan: una cascada de señalización Smad-independiente conduce a la inducción de la fosfatasa alcalina a través de señalización de p38, mientras que una vía de Smad-dependiente activado por resultados de fosforilación del receptor de Smad en la translocación nuclear complejo y la activación de la transcripción de genes diana específicos, tales como el inhibidor de la diferenciación (Id) 12-14. En el hueso, BMP-2 induce la diferenciación de células madre mesenquimales en osteoblastos, estimulando así la curación y la formación de novo de hueso. Actualmente, expresada de forma recombinante BMP-2 se aplica clínicamente para mejorar la curación de los sitios fracturados. Una estrategia común en ingeniería de tejido óseo es el uso de factores de crecimiento inyectables, que es menos invasiva en comparación con los sistemas de suministro locales. Sin embargo, estudios in vivo y aplicaciones clínicas han demostrado que la vida media biológica corta, loc inespecíficazación y rápida de domiciliación de BMP-2 puede dar lugar a varios problemas locales, ectópicos y sistémicos 15. Por lo tanto, para obtener una presentación eficaz, el atrapamiento o la inmovilización de la BMP-2 dentro o sobre materiales es necesario para su entrega local y sostenida en el sitio diana. La liberación sostenida se puede lograr con los enfoques de retención no covalentes, tales como atrapamiento físico, adsorción o de iones complejación 16. Sin embargo, se sabe que la adsorción no específica de proteínas a superficies puede resultados en la desnaturalización de las moléculas 17. Para la unión de factores de crecimiento covalente, diferentes tipos de soportes se han desarrollado en la última década. El uso de moléculas de unión bifuncional que se dirigen a grupos amino o carboxilo de la proteína, por ejemplo, es un tipo de enfoque que no requiere necesariamente la modificación de proteínas para lograr su inmovilización. De hecho, mientras que la modificación de proteínas ofrece la ventaja de controlar la orientación de proteína,la introducción de dominios artificiales, etiquetas de péptidos y cadenas específicas de sitio puede alterar la actividad biológica de factores de crecimiento 17. Por lo tanto, para eludir la desnaturalización debida a la interacción con el material de apoyo, las superficies se pueden funcionalizar de antemano, por ejemplo, con una capa monomolecular auto-ensamblada (SAM) de una molécula de unión, seguido por acoplamiento del factor deseado 18. Hemos utilizado un enfoque basado en el SAM para inmovilizar covalentemente BMP-2 en una superficie por la orientación de sus residuos amino libres y hemos demostrado que la proteína inmovilizada conserva tanto su actividad biológica a corto y largo plazo 19. Este protocolo proporciona una forma simple y eficiente para entregar BMP-2 a las células para estudios in vitro de los mecanismos que se producen en la membrana celular y regulan la señalización intracelular responsable de la señalización de osteogénico.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(dimethylamino)pyridin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>522805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11-mercaptoundecanoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>674427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichlormethane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-dicyclohexylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D80002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum benzene</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>M 875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylacetate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhBMP-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>355-BM</td>
			<td>Carrier-free; expressed in E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN00.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethyl siloxane) (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rhBMP-2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampliflu Red assay</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Sterile filtered, cell culture tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine (0.1 M)</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 (1%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Lysis buffer (ALP assay)19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HNO3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3533.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenylphosphate (pNPP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0942</td>
			<td>Phosphatase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mysin heavy chain (MHC)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa</td>
			<td>MF20</td>
			<td>Monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz</td>
			<td>BANDELIN electronic GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MED 020 Sputtercoating system</td>
			<td>BAL-TEC AG</td>
			<td></td>
			<td>Coating conditions 
			Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec 
			Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M200 Plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent binding of bmp-2 on surfaces using a self-assembled monolayer approach

Proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2) es un factor de crecimiento embebido en la matriz extracelular del tejido óseo. BMP-2 actúa como desencadenante de la diferenciación de células mesenquimales en osteoblastos, estimulando así la cicatrización y la formación de hueso novo. El uso clínico de la humana recombinante BMP-2 (rhBMP-2), en relación con los andamios ha suscitado controversias recientes, en base a la forma de presentación y la cantidad que se va a entregar. El protocolo presentado aquí proporciona una forma simple y eficiente para entregar BMP-2 para los estudios in vitro sobre las células. Describimos cómo formar una monocapa auto-ensamblado que consiste en un engarce heterobifuncional, y mostramos el paso de unión posterior para obtener la inmovilización covalente de rhBMP-2. Con este enfoque es posible lograr una presentación sostenida de BMP-2, mientras que el mantenimiento de la actividad biológica de la proteína. De hecho, la inmovilización de superficie de BMP-2 permite que las investigaciones dirigidas por la prevención de anuncios inespecíficosdesorción, mientras que la reducción de la cantidad de factor de crecimiento y, más notablemente, lo que dificulta la liberación no controlada de la superficie. Ambos eventos de señalización de corto y largo plazo provocados por BMP-2 se llevan a cabo cuando las células están expuestas a las superficies que presentan inmovilizado covalentemente rhBMP-2, por lo que este enfoque adecuado para los estudios in vitro sobre las respuestas celulares a BMP-2 estimulación.

En nuestra configuración, el oro fue elegido como excipiente, ya que proporciona un sistema biológico no específico pero químicamente sintonizable. Además, la aplicación de las monocapas de autoensamblaje implica muchos beneficios: SAM adsorber de forma espontánea a través de sus &quot;cabeza-grupos&quot; en metales y forman monocapas con pocos defectos, mientras que sus grupos terminales funcionales se pueden modificar adicionalmente. Por tanto, proporcionan una plataforma para adaptar las propiedades de la int...

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Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Se describe un método para llevar a cabo la inmovilización eficaz de BMP-2 en las superficies. Nuestro enfoque se basa en la formación de una capa monomolecular auto-ensamblada para lograr la unión de BMP-2 a través de sus residuos de amina libres covalente. Este método es una herramienta útil para el estudio de señalización en la membrana celular.

Unión covalente de BMP-2 en las superficies utilizando una monocapa enfoque de auto-ensamblada

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

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13.8K vistas.  University of Heidelberg.  Se describe un método para llevar a cabo la inmovilización eficaz de BMP-2 en las superficies. Nuestro enfoque se basa en la formación de una capa monomolecular auto-ensamblada para lograr la unión de BMP-2 a través de sus residuos de amina libres covalente. Este método es una herramienta útil para el estudio de señalización en la membrana celular. 