המחבר מודה רוברטו Kolter (בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד) לקבלת הייעוץ לא יסולא בפזו וסיוע במהלך הפיתוח של מסך coculture זה. היא גם הודות מתיו פאוורס לקריאת כתב היד לבהירות, וChia-יי נג לקבלת סיוע בקבלת איור 6.

<ol>
	<li>Berdy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+microbial+metabolites.">Bioactive microbial metabolites.</a> J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multiple+cell+types+in+Bacillus+subtilis.">Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis.</a> FEMS Microbiol. Rev. 33, 152-163 (2009).</li><li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community.">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li><li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li><li>Shank, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+interactions+that+result+in+Bacillus+subtilis+forming+biofilms+are+mediated+mainly+by+members+of+its+own+genus.">Interspecies interactions that result in Bacillus subtilis forming biofilms are mediated mainly by members of its own genus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1236-1243 (2011).</li><li>Piston, D. W., Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J., Claxton, N. S., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Fluorescent Proteins. , (2013).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol. Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> J. Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Nicolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condition-dependent+transcriptome+reveals+high-level+regulatory+architecture+in+Bacillus+subtilis.">Condition-dependent transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis.</a> Science. 335, 1103-1106 (2012).</li><li>Middleton, R., Hofmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+shuttle+vectors+for+ectopic+insertion+of+genes+into+Bacillus+subtilis.">New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis.</a> Plasmid. 51, 238-245 (2004).</li><li>Shimotsu, H., Henner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+single-copy+integration+vector+and+its+use+in+analysis+of+regulation+of+the+trp+operon+of+Bacillus+subtilis.">Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis.</a> Gene. 43, 85-94 (1986).</li><li>Guerout-Fleury, A. M., Frandsen, N., Stragier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmids+for+ectopic+integration+in+Bacillus+subtilis.">Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis.</a> Gene. 180, 57-61 (1996).</li><li>Semsey, S., Blaha, B., Koles, K., Orosz, L., Papp, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integrative+elements+of+rhizobiophage+16-3+can+integrate+into+proline+tRNA+(CGG)+genes+in+different+bacterial+genera.">Site-specific integrative elements of rhizobiophage 16-3 can integrate into proline tRNA (CGG) genes in different bacterial genera.</a> J. Bacteriol. 184, 177-182 (2002).</li><li>Charpentier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cassette-based+shuttle+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6076-6085 (2004).</li><li>Yang, H. Y., Kim, Y. W., Chang, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+an+integration-proficient+vector+based+on+the+site-specific+recombination+mechanism+of+enterococcal+temperate+phage+phiFC1.">Construction of an integration-proficient vector based on the site-specific recombination mechanism of enterococcal temperate phage phiFC1.</a> J. Bacteriol. 184, 1859-1864 (2002).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protoc. 1, 153-161 (2006).</li><li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7:+a+target+site-specific+transposon.">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Mol. Microbiol. 5, 2569-2573 (1991).</li><li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry.">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (60), e3796 (2012).</li><li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis.">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li><li>Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., Wade, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+culture+of+'unculturable'+bacteria.">Strategies for culture of 'unculturable' bacteria.</a> FEMS Microbiol. Lett. 309, 1-7 (2010).</li><li>Romano, J. D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas-Saccharomyces+interactions:+influence+of+fungal+metabolism+on+bacterial+physiology+and+survival.">Pseudomonas-Saccharomyces interactions: influence of fungal metabolism on bacterial physiology and survival.</a> J. Bacteriol. 187, 940-948 (2005).</li><li>Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+protein+component+of+the+Bacillus+subtilis+biofilm+matrix.">A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix.</a> Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).</li><li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivating+the+uncultured.">Cultivating the uncultured.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 15681-15686 (2002).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אחת המגבלות הטבועות של הפרוטוקול הזה הוא שהוא מסתמך על cultivability של אורגניזמים מיקרוביאלי. כפי שכבר תעד 24 היטב, רוב החיים מיקרוביאליים על פני כדור הארץ לא יכולים (עדיין) להיות מבוגרים בתנאי culturing נחקרו עד כה. לפיכך, מספר עצום של יחסי גומלין בין מינים של חיידקים המתר...

אנחנו מעוניינים להבין כיצד מטבוליטים שחיידקים מפרישים משפיעים על הפיסיולוגיה והתפתחות של חיידקים שכנים. מטבוליטים רבים כבר מאופיינים לתופעות ביו בחיידקים אחרים. שתי דוגמאות שתוארו היטב כוללות אנטיביוטיקה, אשר לעכב את הצמיחה של חיידקים אחרים, ומולקולות חישת מניין, אשר משנה את ביטוי הגנים העולמי של חיידקים אחרים. עם זאת, חיידקים מייצרים מוצרים רבים אחרים קטנים מולקולה טבעיות שאין להם bioactivities ידוע 1. אנו משערים כי חיידקים התפתחו ונשמרו את היכולת לייצר כמה מטבוליטים אלה משום שהם מאפשרים להם לווסת את הפיסיולוגיה התאית של חיידקי שכניהם בקהילות חיידקים המורכבים שבתוכה רוב החיידקים להתקיים. סוגי תאי subtilis Bacillus אנו מתמקדים המחקרים שלנו על אינטראקציות של חיידקים בתיווך כימי הכרוכים בBacilsubtilis lus. זה לא רק בגלל מעמדו כחיידק מודל גראם חיובי והכלים גנטיים כתוצאה זמינות למניפולציה שלו, אלא גם בגלל יכולתה להתמיין לסוגים מאופיינים תא. דוגמאות כוללות תאים שהם: שחייה; הפקת המטריצה ​​תאית הנדרשת ליצירת biofilm חזקה; מוסמך לקחת את ה-DNA מהסביבה, והמתנבג בין יתר 2,. כל אחד מסוגי התאים מבטא regulon תעתיק מאפיין שהופך אותם מבחינה פיזיולוגית ו / או פיזי להבדיל מהאחים זהים מבחינה גנטית שלהם. בתנאי גידול רבים, סוגי תאים מרובים לדור בכפיפה אחת אוכלוסיות שונות כמו בתוך מושבה אחת של B. תאי subtilis 3. למרות שמינים רבים של חיידקים עשויים להפגין את ההטרוגניות מקבילה סוג התא, תופעה זו כבר בעיקר למדה היטב ב &#39; subtilis. בפרט, הגנים שהם UPRegulated בתוך כל אחד מB. הספציפי אלה סוגי subtilis תאים זוהו. זיהוי גנים שהוגברו כזה הוא חיוני לעבודה המתוארת כאן כי רבים של פנוטיפים חיידקים אלה של עניין קשה או בלתי אפשריים להתבונן באופן ישיר. לדוגמא, אנחנו לא יכולים מבחינה ויזואלית לזהות תכונה כגון שחייה על צלחות מוצקות (1.5%) אגר, למרות שsubpopulation של B. תאי subtilis לייצר שוטונים בתנאים אלה 3. דוגמא נוספת היא מטריצת ייצור biofilm. ייצור מטריקס ניתן דמיינו ידי מורפולוגיה מושבה (כפי תוצאות מושבות macroscopically מקומטות), אלא רק במדיום גידול מסוים, ורק אחרי ימים רבים של צמיחת 4. עם זאת, על ידי לדעת אילו גנים שהוגברו במהלך התמיינות, אנחנו יכולים לבנות לכתבים תעתיק המשמשים כסמנים להתמיינות לסוגי התאים. כתב בונה לא ניאון אלהכתבי ranscriptional מורכבים מהיזמים עבור גנים תאים מסוג מסוימים נוהגים בייצור של גן כתב, למשל חלבון פלואורסצנטי. דוגמאות כוללות מכשפה-YFP P (לשחייה בתאים), P טאפה-YFP (לתאים מייצרי מטריצת biofilm), ו-P-sspB YFP (להמתנבג תאים), כאשר x P מציין את האזור המקדם עבור x גן. כתב בונה אלה משולבים לוקוס ניטראלי בכרומוזום (איור 1 וראה להלן), כך שרגולצית יליד פנוטיפ נותרה בשלמותה. עם זאת, כעת, כאשר תא מבטא פנוטיפ זה, זה גם מבטא את חלבון פלואורסצנטי. זה מספק דמיינו בקלות לקריאה מתוך ההפעלה מסוימת פנוטיפי התנהגות, מאפשר לנו להקרין לחיידקים שמפעילים את תגובה פיזיולוגית זה. למרות שכתבים כאלה משמשים בדרך כלל במיקרוביולוגיה, הם לא יושמו באופן רחב במסכים לidentifאינטראקציות מטבוליות y בין חיידקים לפני שיטה זו תוארה 5. ישנם מספר השיקולים החשובים בתכנון והבנייה של תאים מסוג ספציפי לזני כתב. יש לנו מנוצלים באופן בלעדי כתבי ניאון תעתיק, אם כי סוגים אחרים של מבנים הם בהחלט אפשריים. אנו לעודד את השימוש בשילובי translational כסמנים לבידול סוג התא במסך שלנו, לעומת זאת, משתי סיבות: 1) הרצון להשאיר מהסוג ספציפי של תאי החלבון האם של שלוות נפש, ו2) ההכרה בכך מפוזר, תא הקרינה רחבה תהיה יותר קלה לזהות מאשר puncta מקומי בתוך תאים (משותף עם התכה translational). בחירת גן כתב לאחר שהחליט להשתמש בתעתיק כקריאה החוצה, גן הכתב יש לבחור (לדוגמא LacZ, הקרינה, או בלוציפראז). יש LacZ היתרון של צורך מיוחד לפחותized ציוד לגילוי, אך קיימת סבירות גבוהה הרבה יותר של תוצאות חיוביות שגויות בקרב חיידקים סביבתיים. בידיים שלנו, ברמת הרקע לאק + אורגניזמים בין החיידקים קרקע הייתה גבוהה להחריד (&gt;&gt; 10% מחיידקי אדמה היו כחולות (Lac +) על צלחות X-gal, מידע לא מוצג). יתכן כי על ידי titrating הריכוז של X-gal במדיום, זה יכול להיות מותאם כדי לאפשר את השימוש בכתב X-gal, למרות שאנחנו לא ניסינו את זה. לוציפראז מספק רגישות גבוהה של איתור והוא הכתב מאונך ביותר: אין כמעט סיכוי לחיידקים סביבתיים להיות זורח מיסודו. עם זאת, מצאנו את זה קשה לזהות מכשור במוסד שלנו, שאיפשר גילוי הארה פני צלחות פטרי כולו, כפי שרובן נועדו לסרוק אזורים רק מקומיים בצלחות רב גם. ייתכן שקיים גם סיבוכים באופן חזותי מושבות זורח באופן שאפשר גם הפיזי בו זמנית הואolation של אורגניזמים וישכנע. בעת השימוש בנאמנים ייתכן שעשה את זה אפשרי, אנחנו במקום שנבחרו לשימוש כתבי תעתיק ניאון, אשר הוכחו לעבוד בB. subtilis, ובלבד רגישות נאותה של זיהוי ושיעורים חיוביים כוזבים נמוכים בקרב אורגניזמים קרקע, ומותר להשתמש במכשור בקלות זמין עבור שניהם להדמיה ונהלי בידוד. בחירת Fluorophore Fluorophore הספציפי שנבחר יהיה תלוי במינים החיידקים שלך, המדיום אגר צמיחתו אתה משתמש, ומסנן הקרינה המסוים קובע שיש לך זמין. עם המכשור שלנו, מצאו ששניהם B. subtilis מושבות עצמם ואגרו הם גדלו על הקרינה רקע פחות הוצגה כאשר מסנני YFP (חלבון פלואורסצנטי צהוב) היו בשימוש, מה שהופך את הכתב שעדיף על ה-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) בידיים שלנו. שימוש קודון של חלבוני ניאוןלעתים קרובות מותאם לאאוקריוטים, שהופך אותו חשוב לבחור fluorophore ידוע או מהספרות לעבודה במינים החיידקים שלך, או לבדוק אותו באופן מפורש באמצעות אמרגן מכונן. מספר גדול של גרסאות חלבון פלואורסצנטי הולכת ומתפתחים זמין 6 כיום, שכבר נבדק במספר המקורות 7,8, שחלקם באופן מפורש לספק הדרכה בבחירת חלבון פלואורסצנטי מתאים לניסוי שלך 9. בחירת יזם הבחירה של אמרגן במידה רבה תהיה תלויה בסוג התא או הפנוטיפ של עניין שלך. לאורגניזמים כגון B. subtilis, כמה גנים כתב תאים מסוג מסוימים הוקמו בספרות. לזני חיידקים אחרים, בחינת microarray או נתונים תעתיק תהיה צורך לספק מידע על אילו גנים שהוגברו מאוד בתנאים שבו סוג התא שלך שלי ענייןבא לידי ביטוי ים. מחקר שנערך לאחרונה מקוטלג השעתוק של B. subtilis תחת 104 תנאי גידול שונים באמצעות מערכי ריצוף 10. מאמר זה מספק מידע מקיף על אילו גנים שהוגברו מאוד בתנאים שונים, שלא יסולא בפז לפנוטיפים-היטב מאופיינים פחות. במקום מיפוי אזורי אמרגן מדויקים לכל גן של עניין, אנחנו בדרך כלל פשוט להשתמש נ&quot;ב הרצף 200-500 במעלה הזרם של הגן כאמרגן. אורך הרצף המדויק תלוי בהקשר הגנומי: אזורים קצרים יותר נמצאים בשימוש בעת צורך כדי להימנע מהכללת אזורי קידוד במעלה הזרם משכן מסגרות קריאה פתוחות. לוקוסים ואינטגרציה ניטראליים איך לשמור על הכתב לבנות בזן החיידקים שלך הופכת להיות השאלה האחרונה בעיצוב זן כתב תעתיק ניאון. בחיידקים, גנים של עניין נשמרים בתדירות גבוההעל פלסמידים באמצעות בחירה אנטיביוטיות. עם זאת, ייתכן שלא ניתן יהיה להשתמש באנטיביוטיקה במהלך coculture בלי להרוג את החיידקים הסביבתיים. אם פלסמידים נשמרים ביציבות במינים החיידקים שלך, זה עשוי להיות אפשרי לגדול החיידקים שלך מכילים כתב שמקורן בפלסמיד בנוכחות של אנטיביוטיקה כדי להכין את הכתב שלך להקרנה, ולאחר מכן לחסל אנטיביוטיקה במהלך coculture עצמו בתקווה שיהיה פלסמיד להישמר במידה מספקת כדי לאפשר לקרינה. עם זאת, אם פלסמידים הולכים לאיבוד בקלות בחיידק שלך, או הולכים לאיבוד בתנאי לחץ, זו לא תהיה אפשרות מעשית. במקרים רבים, הפתרון הטוב ביותר יהיה לשלב את הכתב לבנות על גבי כרומוזום בקטריאלי, המאפשר תחזוקה יציבה של הכתב גם בהיעדר של בחירה. על מנת ששילוב לא לשבש את הביטוי או תקנה הרגיל של גן העניין שלך, אנו ממליצים לשלב לתוך אתר מחוץ לרחם בכרומוזום כי can לשמש &quot;מוקד ניטראלי&quot;. בB. subtilis אתרי אינטגרציה אלה הם גנים ה-- כאשר מוטציה - להעביר פנוטיפ בתקשורת מינימאלית מסוימת (המאפשר integrants להיות מזוהה ללא בחירת אנטיביוטיקה), אך אינו משנה את הצמיחה או שיעורים נביגה במדיה עשירה, וכולל כגון גנים כamyE, lacA, thrC, pyrD, gltA, וsacA (שינוע היכולת לנצל עמילן, β-galactosides, תראונין, אורציל, גלוטמט, וסוכרוז, בהתאמה) 11-13. למרות ששילוב בגנים אלה היה בשימוש באופן אמין במשך שנים רבות בB. subtilis (במיוחד בamyE וlacA), ידע דומה ייתכן שלא יהיה זמין לגנים במינים רבים של חיידקים אחרים. השימוש באתרים מצורפים הפאג חלופות גדולות לאתרי אינטגרציה כרומוזומליות ניטראליים: יש מינים ספציפיים רבים 14-16, כמו גם באתרי אינטגרציה כלליים כגון האתר המצורף Tn7 (Tn7 עו&quot;ד)זוהה ומנוצל להוספות גנים במינים רבים של חיידקי 17,18. חיידקים סביבתיים אנו משתמשים באדמה כמקור ישיר של חיידקים סביבתיים למסך coculture שלנו. האדמה מכילה מגוון גבוה של חיידקים, ורבים מיצורים אלה הם מקור עשיר של מוצרים טבעיים. באמצעות תרחיפים נוזליים של אדמה הונחו ישירות על גבי צלחות עם הזן שלנו ניאון תעתיק כתב (ללא בידוד מוקדם של חיידקים מהאדמה), אנחנו מאוד לפשט הגישה הניסויית. האדמה יכולה לשמש מייד לאחר קציר, או להיות קפוא ב-80 ° C לשימוש עתידי. יש שימוש מיידי את היתרון שמגוון גדול יותר של חיידקים ניתן לגדל באופן פוטנציאלי, כולל אלה שלא ישרדו הקפאה היטב. יש לו את החסרון שהריכוז של אורגניזמים אדמה לעיבוד חקלאיים מדוגמאות אלה אינו ידוע, הגדלת מספר צלחות מסך שחייב להיות בשימוש. דליש שימוש עאיד היתרון ש/ מיליליטר CFU עבור כל מקור אדמה ניתן לקבוע מראש, ומאפשר למספר אופטימלי של מושבות שגדל על כל צלחת מסך. עם זאת, הוא דורש שאורגניזמים האדמה להיות מסוגלים לשרוד הקפאה. שים לב שגיוון בריכת inducer הנבדקת (כלומר מקורות האדמה) מופיע להיות יעילים יותר בזיהוי אינטראקציות interspecies חדשים מאשר הקרנה מעמיקה על אותה האדמה: מגוון פילוגנטי גדול יותר נצפה בנפילות במסך מטריקס האינדוקציה שלנו, כמו מקורות אדמה נוספים נבדקו ולא הקרנה אותם מקורות הקרקע באופן יסודי יותר (EA שאנק ור &#39;Kolter, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד, תוצאות לא פורסמו). סקירה הגישה שאנו מתארים כאן היא פשוטה מבחינת הדרישות טכניות שלה. היא כוללת: 1) בניית כתב תעתיק ניאון בB. subtilis אומיני חיידקים אחרים של עניין, 2) זיהוי תנאים שבם הכתב הזה אינו מופעל, 3) הכנת aliquots של זן הכתב הזה ואורגניזמים שיוקרנו (במקרה של אדמתנו, אבל יכולים להיות מנוצלים מקורות אחרים במקום), 4) ערבוב אלה שתי קבוצות של חיידקים על תקשורת מוצקה, 5) זיהוי ובידוד המשוערת גרימת אורגניזמים, ו6) המאשר כי אורגניזמים אלה אכן להפעיל פנוטיפ זה במסך המשני. לאחר שזוהו, אורגניזמים אלה ומטבוליטים שלהם לספק לנו כלים כימיים כדי לווסת את התנהגות חיידקים, ללמוד פיזיולוגיה חיידקים ויחסי גומלין של חיידקים, ואפשרות לפעול פיגומי רומן כמו לתרכובות טיפוליות עתידיות.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth, Lennox</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80017-484</td>
			<td>Alternative media sources may be necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 3 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>26396-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading tips, round</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods</td>
			<td>VWR</td>
			<td>59060-069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions

בטבע, חיידקים קיימים רק לעתים נדירות בבידוד, הם מוקפים במקום על ידי מערך רחב של מיקרואורגניזמים אחרים המשנים את הסביבה המקומית על ידי הפרשת המטבוליטים. יש מטבוליטים אלה הפוטנציאל לווסת את הפיסיולוגיה ובידול של שכניהם של חיידקים והם גורמים חשובים צפויים בהקמה והתחזוקה של קהילות חיידקים מורכבות. פיתחנו מסך coculture הקרינה מבוססת לזהות אינטראקציות של חיידקים בתיווך כימי מסוג זה. המסך כולל שילוב מתח כתב תעתיק ניאון עם חיידקים סביבתיים על תקשורת מוצקה ומאפשר למושבות לגדול בcoculture. כתב תעתיק הניאון מתוכנן כך שזן החיידקים שנבחר מאיר כאשר הוא מבטא את הפנוטיפ מסוים של עניין (כלומר היווצרות biofilm, נביגה, ייצור גורם ארסיות, וכו &#39;.) הקרנה מתבצעת בתנאי צמיחת wheמחדש פנוטיפ זה לא בא לידי ביטוי (ולכן מתח הכתב הוא בדרך כלל nonfluorescent). כאשר חיידק סביבתי מפריש המטבוליט שמפעיל פנוטיפ הזה, זה מפזר באמצעות אגר ומפעיל את מבנה כתב הניאון. זה מאפשר-ייצור המטבוליט גרימת החיידק כדי להתגלות: הם מושבות nonfluorescent הפרוקסימלי ביותר למושבות ניאון. כך, מסך זה מאפשר זיהוי של חיידקים סביבתיים שמייצרים מטבוליטים diffusible המפעילים תגובה פיזיולוגית מסוימת במתח כתב. פרסום זה דן באופן: א) לבחור תנאי הקרנת coculture מתאימים, ב) להכין את הכתב וחיידקים סביבתיים להקרנה, ג) לבצע את מסך coculture, ד) לבודד משוער גרימת אורגניזמים, וה) לאשר את פעילותם במסך משנית. פיתחנו שיטה זו כדי למסך עבור אורגניזמים אדמה שיפעילו biofilm מטריצת ייצור בsubtilis Bacillus </em&gt;, עם זאת, אנחנו גם לדון בשיקולים ליישום גישה זו לחיידקים גנטי צייתנים אחרים.

מסך זה משמש לזיהוי אורגניזמים אדמה מפריש תרכובות המשנות את הפיסיולוגיה של B. subtilis. התוצאות המתוארות כאן יתמקדו בסוג התא שמייצר מטריצה ​​של B. subtilis, אשר מייצר את החלבון וexopolysaccharide הנדרשים ליצירת biofilm חזקה בחיידק זה. אנחנו בחרנו את האמרגן של אופרון טאפה-sipW-טס...

Watch this Scientific Journal Video about Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions at JoVE.com

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

חיידקים מייצרים תרכובות מופרשות שיש לו את הפוטנציאל להשפיע על הפיסיולוגיה של חיידקי השכנים שלהם. כאן אנו מתארים מסך coculture המאפשר זיהוי של אינטראקציות כאלה interspecies תיווך כימי על ידי ערבוב של חיידקים אדמה עם זני כתב תעתיק ניאון של Bacillus subtilis על תקשורת מוצקה.

שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

using-coculture-to-detect-chemically-mediated-interspecies

Research

JoVE Journal

Biology

13.5K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill.  חיידקים מייצרים תרכובות מופרשות שיש לו את הפוטנציאל להשפיע על הפיסיולוגיה של חיידקי השכנים שלהם. כאן אנו מתארים מסך coculture המאפשר זיהוי של אינטראקציות כאלה interspecies תיווך כימי על ידי ערבוב של חיידקים אדמה עם זני כתב תעתיק ניאון של Bacillus subtilis...

Video: Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

סינתזה והקרנה של גורמי שעתוק הופעל כימי עם כתבים המבוסס על ה-GFP מהיר

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

גילוי אינטראקציות חלבון ואפיון תפקוד חלבון באמצעות HaloTag טכנולוגיה

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

שיטות תרבות לחקר אינטראקציות ספציפיות לאפיקליות באמצעות מודלים אורגנויד מעיים

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Bioinformatics Resources for the Study of Glycan-Mediated Protein Interactions

The Glyco@Expasy initiative was launched as a collection of interdependent databases and tools spanning several aspects of knowledge in glycobiology. In particular, it aims at highlighting interactions between glycoproteins (such as cell surface receptors) and carbohydrate-binding proteins mediated by glycans. Here, major resources of the collection are introduced through two illustrative examples centered on the N-glycome of the human Prostate Specific Antigen (PSA) and the O-glycome of human serum proteins. Through different database queries and with the help of visualization tools, this article shows how to explore and compare content in a continuum to gather and correlate otherwise scattered pieces of information. Collected data are destined to feed more elaborate scenarios of glycan function. Glycoinformatics introduced here is, therefore, proposed as a means to either strengthen, shape, or refute assumptions on the specificity of a protein glycome in a given context.

This protocol illustrates how to explore, compare, and interpret human protein glycomes with online resources.

משאבי ביואינפורמטיקה לחקר אינטראקציות חלבון בתיווך גליקן

The Glyco@Expasy initiative was launched as a collection of interdependent databases and tools spanning several aspects of knowledge in glycobiology. In ...