עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן Wellcome דוקטורט קליני (ECAT).

1. המצאה של דפוסי Parylene על SiO 2: תהליך זרימה (ראה איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב רצוי תצורת parylene-C באמצעות חבילת עורך פריסת תוכנה, יכולת לקרוא / לכתוב CIF (צורת ביניים קלטק) או GDS-II (מסד נתונים גרפיים System-II) קבצים. CIF וGDS-II הם פורמטים של קבצים סטנדרטיים בתעשייה לפריסת יצירות אמנות מעגל משולבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסכת תמונה הוועדה לייצר למתקן המיקרואלקטרוניקה מתאימה, או לעשות בתוך הבית אם מתקנים קיימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמצן פרוסות סיליקון בתנור אופקי אטמוספרי (H 2 SLM 1.88 וO 2 1.25 SLM) ב950 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות כדי לייצר שכבת 200 ננומטר SiO 2 (לאשר עובי עם reflectometer ספקטרוסקופיות נקודה קטנה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקיק ראש מתחמצן עם אמרגן הידבקות silane. עכשיו להפקיד parylene-C ב22 ° C בשיעור של 1.298 ננומטר / מ&quot;ג של דימר באמצעות מערכת ואקום בתצהיר שתוכננה במיוחד כדי להפקיד parylene. 100ציפוי parylene-C העבה ננומטר שימש לכל דוגמאות שמוצגים להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא ההפקדה hexamethyldisilazane (HMDS) אמרגן הידבקות ברקיק מצופה parylene באמצעות מערכת ציפוי צילום להתנגד מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו לסובב את פרוסות סיליקון ב 4,000 סל&quot;ד במשך 30 שניות תוך החלת חיובית צילום להתנגד (וכתוצאה מכך עובי תיאורטי של 1 מיקרומטר), תוך שימוש באותה מערכת ציפוי photoresist כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רך לאפות את רקיק ל60 שניות ב90 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את שני פרוסות סיליקון ומסכת תמונה premanufactured לaligner מסכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את רקיק מצופה photoresist עם ייצוג שלילי UV של תצורת parylene-C הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופים רקיק נחשף ל60 שניות ב110 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל נחשפו תמונה חסינה מהרקיק ידי פיתוח בפתרון מפתח מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחרוט את parylene לא מוגן. השתמש במערכת חמצן פלזמה לחרוט (בחדר לחץ 50 mTorr, 49 SCCM O 2, 100 כוח W RF ב13.56 MHz, ושיעור לחרוט של 100 ננומטר / min) כדי לחשוף את SiO הבסיסי 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוביות הוופל באמצעות מסור חיתוך מתאים (מהירות ציר 30,000 סל&quot;ד, מהירות הזנת 7 מ&quot;מ / שנייה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הצ&#39;יפס בH 2 O deionized ומכה יבש עם חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבבי חנות (ללא הגבלת זמן) בתיבות אבק חינם עד נדרשת. </li></ol> 2. שבב ניקוי והפעלה: פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר photoresist שיורי משבבים על ידי שטיפה באצטון ל10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף בdeionized מזוקק H 2 O 3x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכיב את החומצה טרי פיראניה (יחס 5:03 של 30% מי חמצן ו98% חומצה גופרתית). זהירות: היכונו חומצת פיראניה בזהירות רבה. זה מחמצן חזק מאוד, הוא מאוד חומצי, וערבוב מי חמצן עם חומצה גופרתית הוא תגובה אקסותרמית. לבצע שלב זה במנדף חומצה. לאפשר 2 דקות כדי לעבור לאחר ערבוב חומצת פיראניה אבל להשתמש בתוך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבבים נקיים ולחרוט על ידי טבילה בpiחומצת ranha 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבבים לשטוף 3x בH 2 O deionized ולהעביר לצלחת תרבות סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו להפעיל את השבבים עבור דפוסים תא. לדוגמא, להוסיף שני שבבים לכל גם לצלחת 6 היטב ולאחר מכן להוסיף 2 מיליליטר של סרום שור עוברי, כדי לטבול באופן מלא את כל השבבים. לבצע את זה, וכל שלבי תרבית תאים שלאחר מכן, בתנאים סטריליים במנדף בתרבית רקמת זרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שבבים בסרום ל3-12 שעות ב37 ° C. הערה: צעדים 2.4-2.7 צריכה להתבצע ברצף וללא דיחוי בין שלבים. אם הפעלת סרום מתפרסמת בהשהייה של ≥ 24 שעות לאחר פיראניה טיפול, דפוסים תא נפגעים עקב דחיית תא הופחתה מ 2 אזורי SiO. פתרונות הפעלה אלטרנטיבית המכילים חלבוני הידבקות תא ספציפיים יכולים לשמש במקומו של סרום שור העובר. פתרונות כגון לשנות את מאפייני תא הידבקות של שני מצעים מנוגדים (ראה תוצאות נציג לדוגמא). </li&gt; </ol> 3. קווי ציפוי תא על שבב: פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שבבים מפתרון ההפעלה שלהם ולשטוף פעם אחת עבור 10 שניות בתמיסת מלח מאוזנת של האנק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שבב בתרבות היטב וצלחת סוג תא נבחר כהשעיה בתקשורת הצמיחה הרגילה שלו. צפיפות ציפוי תא אופטימלית תלויה גם בסוג התא ודגם גיאומטרי של parylene-C על שבב. צפיפות של 5 x 10 4 תאים / מיליליטר היא נקודת התחלה הגיונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה מותאמת למניע הבסיסי לדפוסי תא חי אבל התנהגות תא בקלות ניתן להעריך באמצעות מיקרוסקופ לנתח ומצלמה דיגיטלית עם עדשת ממסר מתאימה. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Gold+Surface+Approach+for+Fabrication+and+Interrogation+of+Glycoarrays.">A Versatile Gold Surface Approach for Fabrication and Interrogation of Glycoarrays.</a> ChemBioChem. 9, 1568-1575 (2009).</li><li>Michelini, E., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staying+alive:+new+perspectives+on+cell+immobilization+for+biosensing+purposes.">Staying alive: new perspectives on cell immobilization for biosensing purposes.</a> Anal. Bioanal. Chem. 402 (5), 1785-1797 (2012).</li><li>Franks, W., Tosatti, S., Heer, F., Seif, P., Textor, M., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+cell+adhesion+by+self-assembled+structures+for+use+with+a+CMOS+cell-based+biosensor.">Patterned cell adhesion by self-assembled structures for use with a CMOS cell-based biosensor.</a> Biosens. Bioelectron. 22 (7), 1426-1433 (2007).</li><li>Bacakova, L., Filova, E., Parizek, M., Ruml, T., Svorcik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+cell+adhesion,+proliferation+and+differentiation+on+materials+designed+for+body+implants.">Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on materials designed for body implants.</a> Biotechnol. Adv. 29 (6), 739-767 (2011).</li><li>Bacakova, L., Svorcik, V., Kimura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell colonization control by physical and chemical modification of materials. In: Cell growth process: new research. , 5-56 (2008).</li><li>Sanjana, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+flexible+ink-jet+printing+method+for+patterning+dissociated+neurons+in+culture.">A fast flexible ink-jet printing method for patterning dissociated neurons in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 136, 151-163 (2004).</li><li>Brittain, S., Paul, K., Zhao, X. -. M., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+and+micro-+fabrication.">Soft lithography and micro- fabrication.</a> Phys. World. 11, 31-36 (1998).</li><li>Maher, M., Pine, J., Wright, J., Tai, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurochip:+a+new+multielectrode+device+for+stimulating+and+recording+from+cultured+neurons.">The neurochip: a new multielectrode device for stimulating and recording from cultured neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 45-56 (1999).</li><li>Martinoia, S., Bove, M., Tedesco, M., Margesin, B., Grattarola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+micro-+fluidic+system+for+patterning+populations+of+neurons+on+silicon+micro-+machined+substrates.">A simple micro- fluidic system for patterning populations of neurons on silicon micro- machined substrates.</a> J. Neurosci. Methods. 87 (1), 35-44 (1999).</li><li>Zeck, G., Fromherz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+neuroelectronic+interfacing+with+synaptically+connected+snail+neurons+immobilized+on+a+semiconductor+chip.">Noninvasive neuroelectronic interfacing with synaptically connected snail neurons immobilized on a semiconductor chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (18), 10457-10462 (2001).</li><li>Michel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+molecular+assembly+patterning:+a+new+approach+to+micro-+and+nanochemical+patterning+of+surfaces+for+biological+applications.">Selective molecular assembly patterning: a new approach to micro- and nanochemical patterning of surfaces for biological applications.</a> Langmuir. 18 (8), 3281-3287 (2002).</li><li>Rajalingam, B., Selvarasah, S., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+static+and+dynamic+patterned+cocultures+using+microfabricated+parylene-C+stencils.">Generation of static and dynamic patterned cocultures using microfabricated parylene-C stencils.</a> Lab Chip. 7, 1272-1279 (2007).</li><li>Wright, D., Rajalingam, B., Karp, J., Selvarah, S., Ling, Y., Yeh, J., Langer, R., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reusable,+reversibly+sealable+parylene+membranes+for+cell+and+protein+patterning.">Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., MacLeod, N. K., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+growth+of+neurons+and+glia+using+microfabricated+patterns+of+parylene-C+on+a+SiO2+background.">Guided growth of neurons and glia using microfabricated patterns of parylene-C on a SiO2 background.</a> Biomaterials. 30, 2048-2058 (2009).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+parylene-C+photooxidation+on+serum-assisted+glial+and+neuronal+patterning.">Effects of parylene-C photooxidation on serum-assisted glial and neuronal patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 94, 47-58 (2010).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+adhesion+and+growth+of+long+term+glial+and+neuronal+cultures+on+parylene-C.">Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Bunting, A., Cameron, K., Murray, A. F., Shipston, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+patterned+adhesion+and+repulsion+of+HEK+293+cells+on+micro-engineered+parylene-C/SiO2+substrates.">Modulating patterned adhesion and repulsion of HEK 293 cells on micro-engineered parylene-C/SiO2 substrates.</a> J. Biomed. Mat. Res. Mater. A. 101 (2), 349-357 (2013).</li><li>Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+hNT+neurons+patterned+on+parylene-C/silicon+dioxide+substrates:+Combining+an+accessible+cell+line+and+robust+patterning+technology+for+the+study+of+the+pathological+adult+human+brain.">First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

טבילה של שבבים בחומצה פיראניה משמשת לא רק כדי להסיר כל חומר אורגני השיורי אלא גם חורטת משטחי המצע. זה הוא מפתח המאפשר הפעלה יעילה עם סרום שור העובר. אם לא יעשה כך מונע תא דפוסים ועמוקים משנה את התנהגות תא על שבב. אין דרישה לעקר שבבים לאחר ניקוי עם חומצת פיראניה. אכן עיקור על ידי חשיפה לקרינת UV הוכח לערער דפוסים תא באופן תלוי מינון 13. יש להקפיד לשטוף את כל photoresist הנותרת לאחר תהליך photolithographic. photoresist מתמיד יכול לשמש כשכבת ציטומגלווירוס דבק לא רצויה שעוקפת דפוסים מוכתבים על ידי parylene-C/SiO 2 גיאומטריה. אצטון הוא יעיל כאשר משתמשים בתהליך photolithographic שתואר לעיל ועם חומרים כימיים שצוינו. עם זאת, סוגים אחרים של photoresist עשויים לדרוש ממס שונה. כדי להעריך את ההשפעה והצלחה של differeצעדי ייצור NT, זווית המגע של שני מצעים מנוגדים ניתן למדוד. איור 2 ממחיש את השינויים המתרחשים במהלך תהליך הפעלת שבב. סביר להניח, עם זאת, כי דבק ספציפי ורכיבי חלבון דוחים בסרום סופו של דבר לאפשר את השבב בדוגמת parylene להפעיל מאפייני ציטומגלווירוס דבק או ציטומגלווירוס הדוחה שלו בהתאמה. כל תוצאות הנציג משמשות שבבים בעובי parylene של 100 ננומטר, למרות שיש לנו בהצלחה בדוגמת באמצעות שכבות parylene גם עבות יותר ודקות יותר. חשוב לציין, טכניקת תחריט photolithographic זו מאפשרת שליטה תלת ממדים גדולות הרבה יותר של תצורת parylene מזה מודגם כאן. לדוגמא, באמצעות שילוב של photomasks, ניתן ליצור אזורי parylene מעורב עובי. זו פותחת את הדרך ליצירת תרביות תאים עם טופוגרפיה תלת ממדית מוגדרת, הולכת מעבר לאזורים פשוט מכתיבים של הידבקות תא / repulשיאון, באופן פוטנציאלי מציע אמצעי לשילוב ערוצי microfluidic לתוך המבנה. כפי שניתן לראות, עם זאת, פלטפורמת דפוסים זה לא אוניברסלי יעילה על פני סוגי תאים. שורות תאים שונות, עם פרופילי המולקולה שלהם המגוונים הידבקות תא, באופן לא מפתיע מתנהגות בצורה שונה כאשר בתרבית בפלטפורמה זו. עדיין לא זיהינו את המרכיבים העיקריים בסרום, ולא את הקולטנים בתא קרום הטיפוח, אשר ביסודה של פלטפורמה סלולארי דפוסים זה. ותעשה זאת בעתיד מבטיח להרחיב את השירות ואת הספציפיות שלה. לדוגמא, שורת תאים &quot;אינם דפוסים &#39;יכולה להיות מהונדס גנטית כדי לבטא את מולקולת ההידבקות הנדרשת וכך לקדם את הדפוסים.

הבנת מנגנונים המכתיבים את הידבקות תא ודפוסים על חומרים סינטטיים היא חשובה עבור יישומים כגון הנדסת רקמות, גילוי תרופות, וייצור של biosensors 1-3. טכניקות רבות זמינות ומתפתח, כל ניצול של הגורמים ביולוגיים, כימיים ופיזיים עצום המשפיעים על הידבקות תא. כאן אנו מתארים טכניקת תא דפוסים אשר מנצלת תהליכים פותחו בתחילה למטרות ייצור המיקרואלקטרוניקה. ככזה, הפלטפורמה היא ממוקם היטב על מנת לאפשר אינטגרציה במורד הזרם של טכנולוגיות מיקרואלקטרוניקה, כגון MEAs, לתוך פלטפורמת הדפוסים. הממשק בין קרום תא וחומרים סמוכים הוא דו כיווני ומורכב. בvivo, חלבונים תאיים מטריקס יספק מבנה וכוח והשפעה על התנהגות תא באמצעות אינטראקציות עם רצפטורים הידבקות תא. בדומה לכך, תאים בvitro אינטראקציה עם מצעים סינטטיים באמצעות שכבות נספגו של חלבונים 4 תוך השפעות פיסיקלי כימיות גם לווסת את ההידבקות. לדוגמא, משטח פולימרים יכול להיות מוצג יותר &quot;רטיבים&quot; (הידרופילי) על ידי יונים או הקרנת אור אולטרה סגול, או תחריט על ידי טיפול עם 5 חומצה או הידרוקסיד. שיטות שהוקמו לדפוסי תא לנצל את אלה ומתווכי הידבקות תא אחרים. דוגמאות כוללות הזרקת דיו מדפיסה 6, microcontact ביול 7, חוסר תנועה פיזית 8, מיקרופלואידיקה 9, בזמן אמת מניפולציה 10, ודפוסים סלקטיבית מולקולריים הרכבה (SMAP) 11. לכל אחד יש יתרונות ומגבלות מסוימים. נהג מפתח בעבודה שלנו, לעומת זאת, הוא לשלב את הדפוסים תא עם מערכות מיקרו (MEMS). MEMS מתייחס למכשירים מכאניים קטנים מאוד מונעים על ידי חשמל. זה חופף לשווה הערך בקנה מידה ננומטרי, nanoelectromechמערכות anical. מושג זה הפך למעשי רק כאשר אסטרטגיות של מוליכים למחצה אפשרו ייצור להתקיים במידה הזעירה. טכניקות microfabrication פותחו במקור עבור מוליכים למחצה ואלקטרוניקה בטעות נמצאו מועילות לשימושים אחרים כגון אלקטרופיזיולוגיה הסלולרית, למשל. מטרה במורד הזרם מרכזית היא לשלב טכנולוגיות מיקרואלקטרוניקה כזה עם תהליך באיכות גבוהה דפוסים תא (להרכיב מכשיר BIOMEMS). כמה טכניקות תא דפוסים קיימות ואחרת אמינות ומעשיות אינן מתיישבות עם הרעיון הזה. לדוגמא, יישור מדויק של כל המיקרואלקטרוניקה או biosensors מוטבעים הוא יסוד ליעילות שלהם, אבל קשה מאוד להשיג באמצעות טכניקה כמו רקיעת microcontact. כדי לעקוף בעיה זו, אנו עובדים על פלטפורמת דפוסים מבוססת 2 SiO המשתמשת מודפס photolithographically parylene-C. Photolithography כרוך העברה של תכונות גיאומטריים שלמסכה למצע באמצעות תאורת UV. מסכה מיועדת באמצעות תכנית תכנון בעזרת מחשב מתאים. על צלחת זכוכית, שכבה דקה של כרום לא שקוף מייצגת את הדגם הגיאומטרי הרצוי (ברזולוציה תכונה של 1-2 מ&quot;מ אפשרית). המצע להיות בדוגמת מצופה בשכבה דקה של photoresist (פולימר UV רגיש). מצופה הפולימר אז מיושר והביא במגע קרוב עם המסכה. מקור UV מיושם כך שאזורים לא מוגנים הם מוקרנים ולכן הופכים מסיסים ונשלפים בשלב ההתפתחות הבא, ומשאיר ייצוג parylene-C של דפוס המסכה שמאחורי. תהליך זה מקורו בפיתוח של התקני מוליכים למחצה. ככזה, פרוסות סיליקון משמשות לעתים קרובות כמצע. בתצהיר photolithographic של parylene-C ב SiO 2 הוא ומכאן תהליך פשוט ואמין כי באופן שיגרתי מתקיים במתקני חדר נקי המיקרואלקטרוניקה. בעוד parylene ישכמה מאפייני bioengineering רצויים (אינרטי מבחינה כימית, שאינו פריק ביולוגי), גורם המגביל את שימושה הישיר בדפוסי תא הוא הדביקות שלה עני מולד התא, המיוחסת בחלקו להידרופוביות הקיצונית שלה. עם זאת, parylene-C כבר בעבר בשימוש באופן עקיף לדפוסי תא, למשל כתבנית סלולרית קליפה משם 12,13. גישה זו היא מוגבלת על ידי רזולוציה נמוכה ודורשת שלבים מרובים. התהליך שתואר כאן במקום מנצל צעד לחרוט חומצה, ואחריו דגירה בסרום, על מנת להבטיח שאזורי parylene-C הופכים לתא מודבק, באמצעות שילוב של ירידה בחלבון הידרופוביות וסרום מחייב. התוצאה הסופית היא מבנה מורכב משני מצעים שונים אשר, לאחר הפעלה ביולוגית, להפגין מאפייני ציטומגלווירוס דבק או ציטומגלווירוס הדוחה בהתאמה וכך מייצג פלטפורמת תיפוף תא יעילה. חשוב לציין, שאין צורך להציג את AG הביולוגיתמציג לתוך מתקן החדר הנקי כניתן לאחסן מצעים בדוגמת הגבלת זמן לפני השימוש (ואז הם מופעלים באמצעות סרום שור העובר או פתרון הפעלה אחר). פלטפורמת הדפוסים parylene-C/SiO 2 זהו אפוא מועמד טוב לקואליציה עם רכיבי MEMS, כמו תהליכי הייצור כל כך במראה באופן הדוק אלה המשמשים לייצור המיקרואלקטרוניקה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1784">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Layout editor software package&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:615px;">Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bespoke photo mask</td>
			<td colspan="2">e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com</td>
			<td>Either fabricate in-house of facilities exist or commision</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">3&#34; Silicon wafers</td>
			<td>e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Atmospheric horizontal furnace</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>For oxidising silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Small spot spectroscopic reflectometer</td>
			<td>e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>To measure depth of silicon dioxide layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silane adhesion promoter</td>
			<td>e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/</td>
			<td style="width:215px;">1076730050</td>
			<td>Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parylene-C&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010</td>
			<td style="width:572px;">SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/</td>
			<td style="width:215px;">Model PDS2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter</td>
			<td style="width:572px;">e.g. SpiChem, www.2spi.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Automated track system for dispensing photoresist on wafers.</td>
			<td>e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track,&#160;</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist.&#160; Pre-bake oven cures the resist.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Photo-resist: Rohm &#38; Haas</td>
			<td style="width:572px;">Rohm &#38; Haas, www.rohmhaas.com/</td>
			<td style="width:215px;">&#160;SPR350-1.2 positive photo-resist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Phot-mask aligner</td>
			<td>e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microchem MF-26A developer</td>
			<td>Microchem MF-26A developer, www.microchem.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed reogions of photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Plasma etch system</td>
			<td>e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed regions of parylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Wafer dicing saw</td>
			<td>e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/</td>
			<td style="width:215px;">A929-4&#160;</td>
			<td>To wash off residual photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">98% Sulphuric Acid</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">435589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">10437</td>
			<td>Standard chip activation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">14170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell patterning on photolithographically defined 
parylene-c: sio2 substrates

פלטפורמות דפוסים תא לתמוך במטרות מחקר רחבות, כגון בניית רשתות עצביות במבחנה מוגדרת מראש והחקר של היבטים מרכזיים מסוימים של פיזיולוגיה הסלולר. כדי לשלב בקלות דפוסים תא עם Multi-אלקטרודה מערכים (MEAs) ושל &quot;מעבדה על שבב&quot; מבוסס סיליקון טכנולוגיות, נדרש פרוטוקול microfabrication התואם. אנו מתארים שיטה שמנצלת תצהיר של parylene-C פולימרים על SiO 2 הוופלים. Photolithography מאפשר דפוסים מדויקים ואמינים של parylene-C ברזולוציה ברמת מיקרון. הפעלה לאחר מכן על ידי טבילה בסרום שור העובר (או פתרון הפעלה ספציפי אחר) תוצאות במצע שבו תאים בתרבית לדבוק, או שנהדפו על ידי, parylene או SiO 2 אזורי בהתאמה. טכניקה זו אפשרה לדפוסים של מגוון רחב של סוגי תאים (כולל תאים ראשוניים עכבריים בהיפוקמפוס, שורת תאי HEK 293, teratocarcinoma כמו נוירון אדםשורת תאים, תאי גרגיר עיקריים עכבריים המוח הקטן, ותאי גזע דמוי אנושיים עיקריים הנגזר גליומה). מעניין לציין, עם זאת, הפלטפורמה היא לא אוניברסלית; המשקפת את החשיבות של מולקולות הדבקת תא ספציפי. תהליך הדפוסים תא זה חסכוני, אמין, וחשוב מכך ניתן לשלב microfabrication הסטנדרטי פרוטוקולים (ייצור שבבים), סולל את הדרך לשילוב של טכנולוגית המיקרואלקטרוניקה.

תהליך photolithographic של דפוסי SiO 2 עם parylene-C מודגם באיור 1. מוכן ברגע, הפעלה של שבבים בסרום שור העובר מאפשרת מגוון רחב של סוגי תאים להיות בדוגמת בתרבות. הקבוצה שלנו בדוגמת בהצלחה תאים ראשוניים עכבריים היפוקמפוס 14-16, קו HEK 293 התא 17, teratocarcinoma האדם כמו נוירון (HNT) שורת תאים 18, תאי גרגיר עיקריים עכבריים המוח הקטן, ותאי גזע דמוי אנושיים עיקריים הנגזר גליומה. איור 3 ממחיש דפוסים חזקים של HEK 293 תאים בדפוס parylene המורכב מצומת מעגליים עם סיומות &quot;שיער צולב&quot;. הפעלת שבב בדוגמא זו הייתה בסרום שור העובר. לעומת זאת, תרשים 4 מתאר את הפוטנציאל להגדיל את פלטפורמת הדפוסים באמצעות פתרונות הפעלה חלופית. באמצעות פתרון של אלבומין בסרום שור (3 מ&quot;ג / מיליליטר) ו<html> פיברונקטין (1 מיקרוגרם / מיליליטר) בHBSS, מצווה הדפוסים הקודמת כבר הפוכה. איור 5 מדגים סוג תאים שונה (קו עיקרי אדם נגזר כמו בתאי גזע שמקורם גליומה בדרגה גבוהה). הנה, את הגיאומטריה של השפעות דפוס התנהגות תא הבסיסית, עם הדפוס שמוצג באיור 4 א קידום צמיחת תהליך התא יחד דק parylene-C עוקבת כפי שמוצגת ב4B דמויות ו4C. סוגים מסוימים של תאים לא דפוס בעת שימוש בפרוטוקול ההפעלה בסרום שור העוברי הוקם. איור 6 ממחיש 3T3 תאי L1 הגובר למפגש ללא הבדל ציטומגלווירוס דוחה או ציטומגלווירוס הדבק להבחין בין parylene-C וSiO 2 אזורים. pload/50929/50929fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1. תרשים זרימה המדגימה את תהליך הייצור של תבניות parylene-C ב SiO 2. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" /> איור 2. תרשים זרימה הממחיש את השינויים בזווית מגע ל2 תחומים parylene-C וSiO דוגמת במהלך שלבי הפעלת שבב. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" /> איור 3. הדמיה תא חי של HEK 293 תאים בתרבית על parylene-C/SiO 2 אחרי שלושה ימים במבחנה. צ&#39;יפס טופח במשך 3 שעות בסרום שור עוברי לאחר שהתאים היומצופה בתרחיף בריכוז של 5 x 10 4 תאים / מיליליטר. Parylene-C מקדם הידבקות תא תוך חשוף SiO 2 דוחה תאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" /> איור 4. הדמיה תא חי של HEK 293 תאים בתרבית על parylene-C/SiO 2 אחרי שלושה ימים במבחנה צ&#39;יפס יופעל במשך 3 שעות בפתרונות הפעלת רציונליזציה שונות:.: סרום שור עוברי, ב &#39;: vitronectin (מיקרוגרם / מיליליטר 1) בHBSS, C: אלבומין בסרום שור (3 מ&quot;ג / מיליליטר) + vitronectin (1 מיקרוגרם / מיליליטר) בHBSS, D: אלבומין בסרום שור (3 מ&quot;ג / מיליליטר) + פיברונקטין (156; גר &#39;/ מיליליטר) בHBSS. תאים מצופים היו בהשעיה בצפיפות של 5 x 10 4 תאים / מיליליטר. שים לב איך טיפול של השבב שונה הביא להיפוך של הדוגמה הקודמת דפוסים, עם SiO 2 עכשיו דבק וparylene-C דוחה. קוטר Parylene-C צומת 250 מיקרומטר, מותאם מיוז et al. 17 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" /> איור 5. תמונות Immunofluorescence של תאי גזע דמוי אנושיים עיקריים הנגזר גליומה גדלו על דפוסים שונים של parylene-C ב SiO 2:. סכמטי הממחיש את עיצוב parylene הרשתית מוצג B ו-C </strong&gt; B:.. מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים קבועים (לאחר 4 ימים במבחנה) מוכתם עבור חלבון fibrillary גליה חומצי (GFAP) C:. מיקרוסקופ אור של תאי חיים עליו שבב D: תמונה פלואורסצנטי הממחישה תאים צבעוניים GFAP על parylene שונה . עיצוב E:. תמונת החזרה של הצומת ודיברה עיצוב parylene צילם בD <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" /> איור 6. הדמיה תא חי של 3T3 תאי L1 תרבית על parylene-C/SiO 2 לאחר ארבעה ימים במבחנה. צ&#39;יפס יופעל במשך 3 שעות בסרום שור עוברי לאחר wתאי hich היו מצופים בהשעיה (3 x 10 4 תאים / מיליליטר). במקרה זה, הפלטפורמה אינה מאפשרת דפוסים, עם תאים הופכים מחוברות באופן שווה ב -2 באזורי parylene-C וSiO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates at JoVE.com

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

פרוטוקול זה מתאר שיטת microfabrication התואם לדפוסי תא על SiO 2. עיצוב parylene-C מוגדר מראש מודפס photolithographically על SiO 2 הוופלים. תאים לאחר דגירה עם סרום (או פתרון הפעלה אחר) לדבוק במיוחד ל( ולגדול בהתאם להתאמה של) parylene-C שבבסיס, בעוד שנהדף על ידי SiO 2 אזורים.

תא דפוסים על photolithographically מוגדר Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; מצעים

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

cell-patterning-on-photolithographically-defined-parylene-c-sio2

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

13.2K Views.  The University of Edinburgh.  פרוטוקול זה מתאר שיטת microfabrication התואם לדפוסי תא על SiO 2. עיצוב parylene-C מוגדר מראש מודפס photolithographically על SiO 2 הוופלים. תאים לאחר דגירה עם סרום (או פתרון הפעלה אחר) לדבוק במיוחד ל( ולגדול בהתאם להתאמה של) parylene-C שבבסיס, בעוד שנהדף על ידי SiO 

Video: Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Surface פלזמה ליתוגרפיה דפוסים של יצירת רשתות Cell

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה&quot;כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

דפוסי שיתוף תרבות נייד באמצעות מערכות מימיות שני שלבים

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

באמצעות דפוסים דבקים כדי לבנות התקני 3D נייר Microfluidic

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

דפוסי Subtractive מהירים של שכבות תא חיות עם בדיקת Microfluidic

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

שיטה צדדית של חלבוני דפוסי תאים

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

תכנים חלבונים ביו או פפטידים על הידרוג באמצעות פוטוכימיה עבור יישומים ביולוגיים

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

הערכת תקין התפשטות על שניים - שלושה ממדי מסוג קולגן מצעים

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...