עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לסרטן במכון הלאומי לבריאות מענק R01 CA140257-01.

<html> הערה: הסכמה מדעת התקבלה מהחולים. כמו כן, מחקר זה בוצע בהתאם לכל הנחיות מוסדיות, לאומיים ובינלאומיות לרווחת אדם. 1. להכין את המחשב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את המחשב הנייד ובחיבור USB מהכרטיס לכידת DVI2USB. </li></ol> 2. הכן צג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבור את כבל DVI לפקח וPINP לאפשר endoscopist לצפות בקטעי וידאו ממסכים אלה ולא במחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שצג עומד הוא על והוא מוגדר ל-DVI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר PINP לחלק האחורי של מערכת אולימפוס אז ללחוץ על כפתור הקלט על מערכת אולימפוס כדי להציג את התמונה על המסך הגדול רכוב על הקיר. </li></ol> 3. הגדרת התקן הלייזר דיודה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כדי לוודא שנהג דיודת הלייזר הוא כבוי. יש להפוך אותו רק בכמה דקות לפני ההדמיה מבוצעת. </li></ol>e_title &quot;&gt; 4. כוח הרצועה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחבר את המחשב הנייד, מעבד, נהג דיודת לייזר, ספליטר DVI, וכרטיס לכידת Epiphan לרצועת הכוח. </li></ol> 5. הפעל MDE Widefield על שולחן העבודה למחשב נייד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hit &quot;תיקייה נוכחית&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלד את מספר חולה וראשי תיבות ולחצו על &#39;צור תיקיית חולה&#39;. </li></ol> 6. הכן את השווי וסינון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת טיפול במסנן, תמיד להשתמש בכפפות וKimwipes כדי למזער את העברת הנפט ופסולת למסנן. מטליות גזה או אלכוהול עלולות להשאיר סיבים שיכולים להפריע להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמה Kimwipes על שולחן כדי ליצור פלטפורמה לנשכבה המסנן והכובע. אזור חיטוי זה צריך להיות נגיש לגסטרואנטרולוג במהלך ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נשכב המסנן וכובע ולשמור Kimwipes להיסגר עד לשימוש במהלך ההליך. </li></ol> 7. הכנת חולה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטופל הסכמה על שימוששל VFI ולצבוע proflavine לפני שהגיע לסוויטה של ​​אנדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטופל עמדה להליך אנדוסקופיה עליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך עם האור לבן הדמיה סטנדרטית באמצעות מיקרוסקופ multispectral דיגיטלי (MDM) 7. </li></ol> 8. הכנס וריסוס Proflavine <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שסיימתי עם האור לבן הדמיה, הכנס ולרסס צבע proflavine על רקמות של עניין. 1-5 מ&quot;מ צריכה להספיק בהתאם לאזור של הרקמה של בארט. על ידי ריסוס צבע proflavine בשלב זה, מספיק זמן (דקות לפחות 1) ניתן לקליטת רקמה מספיק לפני VFI. Proflavine, אשר מכוסה תחת יישום תרופת investigational החדש של ה-FDA (IND 102,217), הוא חומר ניגוד ניאון שמתרכז בתוך גרעין תא זמן קצר לאחר היישום. למרות VFI לא יכולה לפתור את המורפולוגיה תאית בודדת, כאשר מחבתות דיודת לייזר על רקמה, האור מוחזר מאפשרת endoscopist להעריך morpholo בלוטות כלליתGY. </li></ol> 9. הפעל לייזר דיודה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את דיודת הלייזר. לעשות לפחות 2 דקות זה לפני ההדמיה מתחילה. </li></ol> 10. הכן אנדוסקופ לVFI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למשוך את אנדוסקופ לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הטיפול באנדוסקופ, להבטיח כי יש לו את עוזרו שני זוגות של כפפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם endoscopist להחזיק אנדוסקופ מול העוזרת שנמצאה בסמוך לפלטפורמת Kimwipe שפורטה לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם Kimwipes, יש העוזרת מנקה את הקצה של אנדוסקופ. הקפד לנקות את המשטח הקדמי בעדינות וגם לנקות כמה סנטימטרים לאורך הצד של אנדוסקופ לטיפול קל יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניקוי, יש לי השלך העוזר של הזוג החיצוני של כפפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם עוזר לשים על המסנן. הכנס את הבליטה הגלילית הקצרה על המסנן לתוך החור המשלים שלה באנדוסקופ. שמור אנדוסקופ אנכי כדי לסייע לתהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק filtאה במקום, חלק את הכובע מעל המסנן ולדחוף אותו מעל הקצה של אנדוסקופ. ודא הכובע מאובטח ודחף באופן מוחלט עם הקצוות מיושרים עם אנדוסקופ. ודא ששפת הכובע מעט משתרעת על פני הקצה של אנדוסקופ. ולבסוף, לוודא את המסנן הוא עדיין במקום ולשטוף עם הקצה של אנדוסקופ. </li></ol> 11. הכנס חזור אנדוסקופ אל הוושט ותמונה 12. הסר אנדוסקופ משט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש Kimwipes למשוך בזהירות את המכסה ולסנן את אנדוסקופ. לזרוק את הכובע ולנקות את המסנן למקרה הבא. </li></ol> 13. נקה סינון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות בעדינות את המסנן עם Kimwipes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא כוס קטנה עם Cydex ולהטביע את המסנן עבור 12 דקות. כל כמה דקות להפוך את המסנן מעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות בעדינות את המסנן עם Kimwipes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול מסנן, הפעם במים סטריליים. אחרי 5 דקות, השתמש ב להשפריץottle וקל לרסס מים סטריליים על המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מסנן בכמה Kimwipes ולתת לו להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר יבש מקום, במכל אחסון בבין Kimwipes. </li></ol>

<ol>
	<li>Modiano, N., Gerson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrett's+Esophagus:+Incidence,+etiology,+pathophysiology,+prevention+and+treatment.">Barrett's Esophagus: Incidence, etiology, pathophysiology, prevention and treatment.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 3, 1035-1145 (2007).</li><li>Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+Adenocarcinoma+of+the+esophagus+among+white+Americans+by+sex,+stage,+and+age.">Incidence of Adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age.</a> Journal of the National Cancer Institute. 100, 1184-1187 (2008).</li><li>Siegel, R., Naishadham, D., Ahmedin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2012.">Cancer Statistics, 2012.</a> A Cancer Journal for Clinicians. 62, 10-29 (2012).</li><li>Vieth, M., Ell, C., Gossner, L., May, A., Stolte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+analysis+of+endoscopic+resection+specimens+from+326+patients+with+Barrett's+esophagus+and+early+neoplasia.">Histological analysis of endoscopic resection specimens from 326 patients with Barrett's esophagus and early neoplasia.</a> Endoscopy. 36, 776-781 (2004).</li><li>Pohl, H., Rosch, T., Vieth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniprobe+confocal+laser+microscopy+for+the+detection+of+invisible+neoplasia+in+patients+with+Barrett's+oesophagus.">Miniprobe confocal laser microscopy for the detection of invisible neoplasia in patients with Barrett's oesophagus.</a> Gut. 57, 1648-1653 (2008).</li><li>Thekkek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+video+endoscopy+for+in+vivo+cross-polarized+and+vital-dye+fluorescence+imaging+of+Barrett's-associated+neoplasia.">Modular video endoscopy for in vivo cross-polarized and vital-dye fluorescence imaging of Barrett's-associated neoplasia.</a> Journal of Biomedical Optics. 18, 026007 (2013).</li><li>Roblyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+optical+imaging+device+for+in+vivo+detection+of+oral+neoplasia.">Multispectral optical imaging device for in vivo detection of oral neoplasia.</a> Journal of Biomedical Optics. 13, 024019 (2008).</li><li>Egger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopsy+surveillance+is+still+necessary+in+patients+with+Barrett's+oesophagus+despite+new+endoscopic+imaging+techniques.">Biopsy surveillance is still necessary in patients with Barrett's oesophagus despite new endoscopic imaging techniques.</a> Gut. 52, 18-23 (2003).</li><li>Thekkek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital-dye+enhanced+fluorescence+imaging+of+GI+mucosa:+metaplasia,+neoplasia,+inflammation.">Vital-dye enhanced fluorescence imaging of GI mucosa: metaplasia, neoplasia, inflammation.</a> Gastrointestinal Endoscopy. 75, 877-887 (2012).</li><li>Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+in+Barrett's+esophagus:+a+novel,+low-cost+endoscopic+microscope.">High-resolution imaging in Barrett's esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope.</a> Gastrointestinal Endoscopy. 68, 737-744 (2008).</li></ol>

אין מה לחשוף.

עם מעקב אנדוסקופית סטנדרטי, neoplasia בBE הוא החמיץ לעתים קרובות 8 בגלל metaplasia השפיר יכול להיות שאין להבחין בין דיספלזיה בדרגה גבוהה ואדנוקרצינומה. ככלי שהייתי טוב יותר לאפשר גסטרואנטרולוגים כדי לתקן שגיאה בלתי נמנעת כרגע זה, דימות פלואורסצנטי המשופרת חיוני לצבוע מד...

במהלך ארבעים השנים האחרונות, השכיחות של אדנוקרצינומה של הוושט (EAC) גדלה באופן משמעותי 1,2; עדיין עקב איחור באבחון, שיעור ההישרדות של חמש השנים הוא פחות מ 20% 3. הסטנדרטי של מעקב אנדוסקופי בלהיות הנוכחי, מבשר על EAC, הוא אנדוסקופיה אור הלבנה עם ביופסיות &#39;המלקחיים ארבעה quandrant האקראי של המגזר. למרבה הצער, בטכניקה זו לעתים קרובות מפספסת neoplasia, אשר יכולה להיות שטוח, דק וקשה להבחנה על תקן הדמיה אור לבן 4. אמנם יש כבר הצלחה בבאמצעות מיקרוסקופ לייזר confocal כדי להדגיש תכונות סלולריות in vivo, נגעים עדיין יכולים לפספס בגלל שדה ירד מבט 5. עובדה שיש בטכנולוגיה &#39;גשר&#39; שיכול להדגיש אזורי הדמיה microendoscopic confocal נוסף תהיה במידה ניכרת רבות ערך. כתוצאה מכך, שיטת הדמיה דגל האדום משופרת, המשפרת את יכולת targeneoplasia מוקדם t והביופסיה בBE יהיה אינסטרומנטלי באיתור EAC בשלב מוקדם, ריפוי ועלול להוביל לטיפול ושיעורי הישרדות השתפרו לאחר מכן יעילים יותר. VFI היא טכניקה חדשנית שמשלבת הדמיה אפיתל ברזולוציה גבוהה עם ניגוד אקסוגני, proflavine ניאון אקטואלי, כדי להדגיש את מורפולוגיה בלוטות ולהתוות neoplasia (דיספלזיה בדרגה גבוהה וסרטן) בוושט הדיסטלי בתקווה לשפר את אבחון in vivo 6. על העירור של proflavine, אשר מרכז בתוך גרעין תא זמן קצר לאחר יישום, תמונות הניאון לספק רזולוציה מרחבית של 50-100 מיקרומטר ושדה הראייה עד 2.5 סנטימטר, המאפשרת endoscopists לדמיין מורפולוגיה בלוטות. כתוצאה מכך, גישה זו מאפשרת לגסטרואנטרולוגים להבחין metaplasia בארט הקלאסי, שבו יש בלוטות רציפות, באופן שווה ברווח ומורפולוגיה הומוגנית כוללת, מלהיות עם neoplasia, שבה יש obliteration של ארכיטקטורת הבלוטות. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול של טכניקה חדשה זו עם אנדוסקופ multispectral, ולספק תוצאות נציג להדגים את התועלת של המכשיר הזה הבמתאר את השינוי המורפולוגי מmetaplasia השפיר לדיספלזיה בדרגה גבוהה וסרטן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="650">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Filter*</td>
			<td>Schott North America, Inc., Duryea, Pennsylvania</td>
			<td>Not Applicable</td>
			<td>495-nm long-pass filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo Cap &#8211; Medium*</td>
			<td>Barrx Medical</td>
			<td>CP-002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processor*</td>
			<td>Pentax</td>
			<td>EPK-i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multispectral Digital Microscope**</td>
			<td>Not Applicable</td>
			<td>Not Applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>KimTech Science</td>
			<td>S-8115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cidex</td>
			<td>Advanced Sterilization Products&#160;</td>
			<td>CIDEX OPA Solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proflavine hemisulfate (0.01% w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FDA (IND 102,217)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Diode*</td>
			<td>Nichia Corporation</td>
			<td>Not Applicable</td>
			<td>455-nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Capture*</td>
			<td>Labview</td>
			<td>Not Applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray Catheter</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Not Applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>*Equipment specifics within Reference 6. **Equipment specifics within Reference 7</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagnosis of neoplasia in barrett&#8217;s esophagus using vital-dye enhanced fluorescence imaging

היכולת להבחין metaplasia השפיר בוושט של בארט (BE) מneoplasia in vivo נותרת קשה כמו שני סוגי הרקמות יכולים להיות שטוחים ונבדל עם הדמיה אור לבנה לבד. כתוצאה מכך, שיטה שמדגישה ארכיטקטורת בלוטות תהיה שימושית להפלות neoplasia מאפיתל שפיר בושט דיסטלי. VFI היא טכניקה חדשנית שעושה שימוש בחומר ניגוד אקסוגני אקטואלי ניאון להתוות דיספלזיה בדרגה גבוהה וסרטן מאפיתל שפיר. באופן ספציפי, תמונות הניאון לספק רזולוציה מרחבית של 50-100 מיקרומטר ושדה הראייה עד 2.5 סנטימטר, המאפשרת endoscopists לדמיין מורפולוגיה בלוטות. על העירור, metaplasia של בארט הקלאסי מופיע בלוטות רציפות כ, שווה ברווח ומורפולוגיה הומוגנית הכוללת; בניגוד לכך, רקמת neoplastic מופיעה צפופה עם מחיקה של מסגרת בלוטות מלאה. כאן אנו מספקים סקירה שלהמכשור ולמנות את הפרוטוקול של טכניקה חדשה זו. בעוד VFI מקנה גסטרואנטרולוג עם הארכיטקטורה של רקמת הבלוטות חשודה, דיספלזיה הסלולרית לא ניתן לפתור עם שיטה זו. ככזה, לא ניתן להבחין מורפולוגית metaplasia של בארט מלהיות עם נמוכה כיתה דיספלזיה באמצעות שיטת הדמיה זו. על ידי מסחר מירידה ברזולוציה עם שדה גדול יותר של תצוגה, מערכת הדמיה זו יכולה לשמש לכל הפחות כמכשיר הדמיה דגל אדום כדי למקד וביופסית נגעים חשודים; עדיין, אם אמצעי הדיוק הם מבטיח, VFI עלולה להפוך את טכניקת ההדמיה סטנדרטית לאבחון של neoplasia (המוגדר כשתי דיספלזיה בדרגה גבוהה או סרטן) בושט דיסטלי.

איור 1 מתאר השט בארט קלאסי ללא דיספלזיה מוקפת בגבולות על ידי אפיתל קשקש הנורמלי. מתחיל עם רקמת הקשקש השטוח, הנמצאת שולי ומצוינת על ידי החיצים הכחולים, אזור הומוגני של הקרינה משעממת הוא הווה ללא ארכיטקטורת בלוטות. החיצים הירוקים מצביעים על קו ירוק מעגלי המקיף ...

Watch this Scientific Journal Video about Diagnosis of Neoplasia in BarrettÃ¢â‚¬â„¢s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging at JoVE.com

Diagnosis of Neoplasia in Barrett&#8217;s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging

דימות פלואורסצנטי המשופרת חיוני לצבוע (VFI) היא רומן בטכניקת vivo המשלב הדמיה אפיתל ברזולוציה גבוהה עם ניגוד ניאון אקטואלי אקסוגני כדי להדגיש את מורפולוגיה בלוטות ולהתוות neoplasia (דיספלזיה בדרגה גבוהה וסרטן) בושט דיסטלי.

אבחנה של neoplasia בוושט של בארט באמצעות דימות פלואורסצנטי המשופרת ויטל לצבוע

The ability to differentiate benign metaplasia in Barrett&#8217;s Esophagus (BE) from neoplasia in vivo remains difficult as both tissue types can be flat ...

diagnosis-neoplasia-barretts-esophagus-using-vital-dye-enhanced

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Bioengineering

Unit 1

Disorders of the Esophagus

SCIENTISTS IN ACTION

11.9K Views.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  דימות פלואורסצנטי המשופרת חיוני לצבוע (VFI) היא רומן בטכניקת vivo המשלב הדמיה אפיתל ברזולוציה גבוהה עם ניגוד ניאון אקטואלי אקסוגני כדי להדגיש את מורפולוגיה בלוטות ולהתוות neoplasia (דיספלזיה בדרגה גבוהה וסרטן) בושט דיסטלי. 

Video: Diagnosis of Neoplasia in Barrett’s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

חיים דימות פלואורסצנטי של הרוטורים מולקולרית בתאים חיים

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

זמן לשגות דימות פלואורסצנטי של צמיחה רוט ארבידופסיס עם מניפולציה מהירה של הסביבה רוט שימוש RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes have the potential to serve as biomarkers for disease diagnosis and to monitor disease progression and treatment response. However, most exosome analysis procedures require exosome isolation and purification steps, which are usually time-consuming and labor-intensive, and thus of limited utility in clinical settings. This report describes a rapid procedure to analyze specific biomarkers on the outer membrane of exosomes without requiring separate isolation and purification steps. In this method, exosomes are captured on the surface of a slide by exosome-specific antibodies and then hybridized with nanoparticle-conjugated antibody probes specific to a disease. After hybridization, the abundance of the target exosome population is determined by analyzing low-magnification dark-field microscope (LMDFM) images of the bound nanoparticles. This approach can be easily adopted for research and clinical use to analyze membrane-associated exosome biomarkers linked to disease.

Clinical translation of exosome-derived biomarkers for diseased and malignant cells is hindered by the lack of rapid and accurate quantification methods. This report describes the use of low-magnification dark-field microscope images to quantify specific exosome subtypes in small volume serum or plasma samples.

שימוש Nanoplasmon-משופרת פיזור מיקרוסקופ נמוך הגדלה הדמיה כדי לכמת הגידול הנגזר בגידולים

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes ...

Contrast-Enhanced Subharmonic Aided Pressure Estimation (SHAPE) Using Ultrasound Imaging with a Focus on Identifying Portal Hypertension

Noninvasive, accurate measurement of pressures within the human body has long been an important but elusive clinical goal. Contrast agents for ultrasound imaging are gas-filled, encapsulated microbubbles (diameter &#60; 10 &#956;m) that traverse the entire vasculature and enhance signals by up to 30 dB. These microbubbles also produce nonlinear oscillations at frequencies ranging from the subharmonic (half of the transmit frequency) to higher harmonics. The subharmonic amplitude has an inverse linear relationship with the ambient hydrostatic pressure. Here an ultrasound system capable of performing real-time, subharmonic aided pressure estimation (SHAPE) is presented. During ultrasound contrast agent infusion, an algorithm for optimizing acoustic outputs is activated. Following this calibration, subharmonic microbubble signals (i.e., SHAPE) have the highest sensitivity to pressure changes and can be used to noninvasively quantify pressure. The utility of the SHAPE procedure for identifying portal hypertension in the liver is the emphasis here, but the technique has applicability across many clinical scenarios.

Contrast-Enhanced Subharmonic Aided Pressure Estimation SHAPE Using Ultrasound Imaging with a Focus on Identifying Portal Hypertension

A protocol for noninvasively estimating ambient pressures utilizing subharmonic ultrasound imaging of infused contrast microbubbles (following appropriate calibration) is described with examples from human patients with chronic liver disease.

הערכת לחץ תת-הרמוני משופר בניגודיות (SHAPE) באמצעות הדמיית אולטרסאונד עם דגש על זיהוי יתר לחץ דם פורטלי

Noninvasive, accurate measurement of pressures within the human body has long been an important but elusive clinical goal. Contrast agents for ultrasound ...