This work was supported by the Belgian National Foundation for Scientific Research (F.R.S.-FNRS) through &#8220;MIS Confocal Microscopy&#8221;, &#8220;Cr&#233;dit aux Chercheurs&#8221; grants and the &#8220;Nanomotility FRFC project&#8221; (no. 2.4622.11). T.G. doctoral fellowship is supported by the Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research (FRIA). The authors gratefully acknowledge Sylvain Desprez for mechanical characterization and G&#233;raldine Circelli for confocal imaging.

.1 הפעלת Surface של Coverslips הזכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips זכוכית מקום עגול (25 מ&quot;מ קוטר) בצלחת פטרי ולמרוח 0.1 פתרון M NaOH על זה במשך 5 דקות (מנדף הכימי המומלץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון NaOH ולטבול באופן מלא coverslips עם סטרילי DDH 2 O עבור 20 דקות תוך מתנדנד בעדינות על צלחת נדנדה בברדס תרבות סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים DDH 2 O סטרילי ולחזור על השלב 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverslips עם פינצטה סטרילי ולמקם אותם בצלחת פטרי חדשה עם מופעל עם הפנים למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips יבש תחת זרימה קבועה של גז חנקן טוהר גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף תרבות סטרילי, למרוח שכבה דקה של 3 acrylate propyl (trimethoxysilyl) (92%) בצד הופעל של coverslip עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהרחבה לשטוף coverslips זכוכית עם 3 שוטף של DDH סטרילי 2 O ולטבול אותם בסטרילי DDH 2 O בצלחת פטרי חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש על צלחת פטריעם Parafilm ומניח אותו על צלחת נדנדה תחת תסיסה עדינה עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverslips מDDH 2 O עם פינצטה סטרילי עם טיפים יפים ומניח אותם בצלחת פטרי חדשה עם מופעל עם הפנים למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחסן ב RT במקום יבש עם נייר אלומיניום כדי למנוע אבק יידבק לcoverslips. </li></ol> 2 הכנת הידרוקסי-PAAm הידרוג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן משקל של 65 מ&quot;ג של acrylamide N-Hydroxyethyl (HEA) בצינור 1.5 Eppendorf מ&quot;ל. חשוב להכין פתרון HEA טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של 50 חיץ HEPES מ&quot;מ לHEA ולערבב באמצעות vortexer עד פירוק HEA המלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 400 μl של 40% w / w בHEPES פתרון acrylamide והנפח הנדרש של 2% w / w בפתרון bis-acrylamide HEPES (ראה טבלה 1) כדי להגיע לנוקשות הידרוג&#39;ל הרצויות. התאם עם 50 HEPES מ&quot;מ לנפח סופי של 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הפתרון באמצעות vortexer ודגה זהבתא ואקום עבור 20 דקות כדי להפחית את ריכוז חמצן בתוך התמיסה, אשר מונעת פילמור הידרוקסי-PAAm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסת מנוע סטרילי, לסנן פתרון degased עם מסנן גודל נקבובית 0.2 מיקרומטר כדי לעקר אותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל coverslips העגול זכוכית (קוטר 22 מ&quot;מ) בשואב UV / אוזון במהלך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10% persulfate אמוניום פתרון (APS) 100 μl, שהוא 10 APS מ&quot;ג ב100 μl DDH 2 O. חשוב להכין פתרון APS טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 μl של tetramethylenediamine (TEMED) ו25 μl של פתרון APS לפתרון מעוקר הידרוקסי-PAAm (שלב 2.5) ליזום פילמור. מערבבים את הפתרון על ידי 3 pipettings רצוף ללא הקדמה של בועות, בתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסת מנוע סטרילי, מקום טיפת 25 μl של פתרון הידרוקסי-PAAm על coverslip 25 מ&quot;מ (זמינה מצעד 1.9) ומייד להציב GL 22 מ&quot;מcoverslip התחת (שהוכן על שלב 2.5) על גבי אגל לסחוט את פתרון הידרוקסי-PAAm. מרכז את coverslip זכוכית 22 מ&quot;מ עם פינצטה סטרילי ולהחליק את כל בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר הידרוג-PAAm הידרוקסי לפלמר ב RT במשך 15 דקות. היפוך ידני פתרון הידרוקסי-PAAm שנותר בצינור Eppendorf לעקוב השלמת תהליך פילמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן מלא לטבול coverslips עם סטרילי DDH 2 O ולהפריד בזהירות את 22 coverslips מ&quot;מ הזכוכית על ידי החדרת הקצה של סכין גילוח בין coverslips מ&quot;מ הזכוכית 22 ושכבת הידרוג&#39;ל הידרוקסי-PAAm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף הידרוג-PAAm הידרוקסי עם PBS סטרילי (3 חילופים של PBS) ולתת לי ג&#39;לי השקוע לחלוטין בPBS סטרילי כדי לשמור על לחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן הידרוג-PAAm הידרוקסי בסטרילי PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 ימים. </li></ol> .3 Polydimethylsiloxane (PDMS) Microstamp ייצור הערה: הייצור של אדון סיליקון נדרשת לפני start PDMS ייצור microstamp. microfabrication זה של אדון סיליקון יכול להיעשות על ידי טכניקות ליתוגרפי, אשר דורשת ציוד והכשרה מיוחדים. שיתופי פעולה עם מתקן nanofabrication מעודדים לפברק מאסטר סיליקון. לחלופין, ליצור קשר עם חברה שבודה אדוני סיליקון microstructured מחוייט על פי דרישה. חשוב לציין כי הייצור של אדון סיליקון רק צריך להיעשות פעם אחת. ואכן, ניתן להשתמש בו אדוני סיליקון microstructured ללא הגבלת זמן לייצר חותמות אלסטומרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקס PDMS וסוכן הריפוי ב10: 1 יחס בכוס פלסטיק ומערבבים היטב בעזרת פיפטה עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגה תערובת PDMS תחת ואקום כדי להסיר בועות אוויר שנוצרו במהלך השלב 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את אדון סיליקון microstructured בצלחת פטרי והטלת שכבה עבה 10 מ&quot;מ של תערובת PDMS degassed על זה בלי ליצור בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לרפא PDMS לשעה 2 ב 60 מעלות צלזיוס בתנור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נטולת אבק, microstamps 1 סנטימטר 2 מתקלפת שכבת PDMS ובלו עם אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, PDMS המקום microstamps דפוס בצלחת פטרי. </li></ol> .4 הידרוג הידרוקסי-PAAm Micropatterning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microstamps PDMS המקום באתנול / מים פתרון (50/50) וsonicate במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את הבולים עם זרם של זרימת חנקן ולמקם אותם דפוס בשואב UV / אוזון (λ &lt;ננומטר 200) במשך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסת מנוע סטרילי, מקום טיפה 150-μl של פתרון רצוי חלבון (לדוגמא, 100 מיקרוגרם / laminin מיליליטר PBS או 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל פיברונקטין PBS) על גבי משטח microstructured של בול 2 PDMS 1 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: שנה את הריכוז של תמיסת החלבון לווסת את צפיפות תאים ליגנד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים את פתרון החלבון על פני השטח החותמת על ידי הזזתו עם קצה סטרילי של פיפטה כלפי כל אחת מפינותהחותמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את פתרון החלבון לספוג בחותמת PDMS ל60 דקות מתחת למכסת מנוע סטרילית. כבה את הנרות, כדי למנוע נזק חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מכסה המנוע סטרילית, להעביר coverslips הידרוקסי-PAAm המצופה (ניתן להשיג בצעד 2.13) לתוך צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS העודף מפני שטח של מצעי הידרוקסי-PAAm עם זרם חנקן נמוך בתנאים סטריליים. להפסיק את ההליך בהקדם אין ראיות של מים עומדים על פני השטח ג&#39;ל הוא ציין. ג&#39;ל לא צריך להיות יבש לחלוטין בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש בזהירות את פני השטח המובנה של PDMS להחתים עם זרימה קבועה של גז חנקן טוהר גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס את החותמת מצופה חלבון עם מלקחיים רקמות הלבשה ולמקם את פני השטח המובנה במגע עם פני השטח הידרוג&#39;ל המיובשים. החל נקודות לחץ קצרות עם הקצה של פינצטה בחלק העליון של חותמת PDMS כדי להבטיח קשר טוב בין microfeatures בולים ופני שטח הידרוג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את חותמת PDMS על המשטח הידרוג&#39;ל דואר עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינות בולי PDMS מהידרוג הידרוקסי-PAAm עם מלקחיים רקמות הלבשה ובצע את השלב 4.1 לנקות את החותמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בהרחבה הידרוג-PAAm הידרוקסי יוחתם על ידי 3 חילופים של PBS (pH = 7.4) בתנאים סטריליים עבור 10 דקות לחליפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: micropatterns נוסף של חלבוני ECM אחרים ניתן להוסיף למשטח הידרוקסי-PAAm ידי ביצוע שלבים 4.5-4.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזורים מודפסים אינו passivate עם פתרון סטרילי של BSA ב5 מ&quot;ג / מיליליטר PBS במהלך לילה אחד ב 4 מעלות צלזיוס תחת תסיסה עדינה על צלחת נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בהרחבה על ידי 3 חילופים של PBS (pH = 7.4) בתנאים סטריליים עבור 10 דקות לחליפין. בשלב זה, ניתן לאחסן הידרוג-PAAm הידרוקסי חותמת על 4 מעלות צלזיוס עד שבוע. </li></ol> .5 הפקדת נייד על הידרוקסי-PAAm הידרוג micropatterned <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslips בתקשורת תא ל30-45 דקות לפני הציפוי גאמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים חסיד תרבותיים בבקבוק 2 תרבות 75 סנטימטר עם PBS סטרילי על 37 מעלות צלזיוס ולנתק אותו עם 3 מ&quot;ל של טריפסין-EDTA או Accutase עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הסכום הרצוי של מדיום גידול מתאים מלא מראש חימם עבור הקו הסלולרי שלך לתוך הבקבוק המכיל את התאים מנותקים וצנטריפוגה ההשעיה התא במשך 3 דקות ב650 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant עם micropipette וresuspend התאים במדיום התרבות שלם ב15-20,000 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מ&quot;ל של פתרון התא לcoverslip micropatterned (המתקבל משלב 5.1) ומקום coverslip מכוסה התא בחממה תרבות ב37 ° C ו 5% לחות ל1-2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בעדינות תאים ופנויים להחליף מדיום התרבות. להחזיר את התאים המצורפים לחממה ולתת להם להתפשט באופן מלא (שעות 3-6, תלוי בסוג התא). </li></ol>

<ol>
	<li>Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+route+to+functionalize+polyacrylamide+gels+for+the+independent+tuning+of+mechanotransduction+cues.">A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues.</a> Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).</li><li>Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Th&#233;odoly, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+investigation+reveals+distinct+roles+for+actin+cytoskeleton+and+myosin+II+activity+in+capillary+leukocyte+trafficking.">Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking.</a> Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).</li><li>Atmanli, A., Domian, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+aligned+functional+myocardial+tissue+through+microcontact+printing.">Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing.</a> J. Vis. Exp. (73), e50288 (2013).</li><li>Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Th&#233;odoly, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+microfluidic+method+to+select,+isolate,+and+manipulate+single-cells+in+mechanical+and+biochemical+assays.">A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays.</a> Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).</li><li>Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+control+of+nuclear+confinement+identifies+a+threshold+deformation+leading+to+lamina+rupture+and+induction+of+specific+genes.">Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes.</a> Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).</li><li>Rundqvist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fidelity+functional+patterns+of+an+extracellular+matrix+protein+by+electron+beam-based+inactivation.">High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).</li><li>Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+generation+of+proteins+micropatterns+for+neuron+culture+applications.">Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications.</a> Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).</li><li>Holden, M. A., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activated+patterning+of+dye-labeled+molecules+on+surfaces.">Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).</li><li>Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-assisted+surface+chemical+patterning+for+single-cell+culture.">Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture.</a> Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).</li><li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+gold+having+micrometer+to+centimeter+dimensions+can+be+formed+through+a+combination+of+stamping+with+an+elastomeric+stamp+and+an+alkanethiol+"ink"+followed+by+chemical+etching.">Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching.</a> Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).</li><li>Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Polydimethylsiloxane+Substrates+with+Tunable+Elastic+Modulus+to+Study+Cell+Mechanobiology+in+Muscle+and+Nerve.">Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve.</a> PLoS ONE. 7, e51499 (2012).</li><li>Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Phosphorylcholine+hydrogels+as+tunable+and+versatile+platforms+for+mechanobiology.">PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology.</a> Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).</li><li>Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+hydroxy-PAAm+hydrogels+and+sylgard+184+silicone+elastomers+with+tunable+elastic+moduli.">Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli.</a> Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+towards+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses.</a> Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).</li><li>Hemphill, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+role+for+integrin+signaling+in+diffuse+axonal+injury.">A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22899 (2011).</li><li>Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamide+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays.">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays.</a> BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li><li>Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cell+growth+on+protein-functionalized+hydrogel+surfaces.">Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li><li>Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+coordination+between+cell+and+nuclear+shape+within+micropatterned+endothelial+cells.">Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells.</a> Nat. Commun. 3, 671 (2012).</li><li>Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Confinement:+Putting+the+squeeze+on+the+nucleus.">Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus.</a> Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).</li><li>Trappman, B., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+sense+extracellular+matrix+stiffness:+a+material's+perspective.">How cells sense extracellular matrix stiffness: a material's perspective.</a> Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

רב בתצפיות מבחנה בביולוגיה של התא מודרני בוצעו על coverslips זכוכית הקשיח, לעתים קרובות מצופה בשכבה דקה של חלבוני ECM או פפטידים סינטטיים המכילים את רצף RGD. עם זאת, מצעי תרבות בסיסיים כגון לא לשחזר את כל מורכבות physicochemical של ECM ולכן אינם מספקים מודל מדויק ללימוד תהליכי mecha...

היבטים של microenvironment הסלולרי המקומי רבים (למשל, קשיחות, גודל נקבובית, טבע של חלבונים, או צפיפות תאים ליגנד) לספק קואורדינטות מוגדרות של רמזי רגולציה השולטים בתהליכים תאיים כגון תנועתיות, התפשטות תאים, התמיינות, וביטוי גנים. שינויים של מאפייני physicochemical של הסביבה תאית יכולים להיתפס על ידי תאים ולגרום להשלכות פיסיולוגיות שונות, כולל עיוות של קיטוב סלולארי, הגירה, ובידול. עדיין לא ברור, עם זאת, כיצד תאים לתרגם שינויי ECM לאותות ביוכימיים סלולריים. לכן חשיבות רבה למהנדס בשליטה בmicroenvironments מבחנה שיכולה לשכפל את יחסי הגומלין בין תאים וmicroenvironment ללימוד מסלולי mechanotransduction. כדי לטפל בבעיה זו, יש לנו לאחרונה הציג שיטה חדשה 1, הנקראת הידרוג-PAAm הידרוקסי, כדי ליצור שתי אגורה בקלותמטריצות nsional רכות המאפשרות לשלוט באופן עצמאי רמזי mechanotransduction חשובים: מטריצת קשיחות, גיאומטריה תא וכליאה, הטבע של החלבון וצפיפות תאים ליגנד. ECM מכוון את התהליכים תאיים באמצעות הדרגתיים בmorphogens (chemotaxis), חלבוני דבק (haptotaxis), וקשיחות (durotaxis). במהלך העשורים האחרונים, מתקדם בפלטפורמות מבחנה פותחו כדי לבודד רמזים תאיים הללו על מנת להקניט את הדרך בה התאים מסוגלים לתרגם תכונות ביוכימיות וbiophysical לתהליכים פיסיולוגיים 2-5. אלומת אלקטרונים 6, photolithography 7, קיבוע פוטו 8, או טכניקות סיוע פלזמה 9 פותחו כדי לכוון את הצמיחה של תאי חיים על מצעי micropatterned. למרות שהטכניקות אלה הניבו תוצאות חשובות, רובם אינו מאפשרים אפליה בין ההשפעה הפרטנית של רמזים שונים על התנהגות תאוהם דורשים מתקנים טכניים שכמה מעבדות יכולות להרשות לעצמו. בין הטכניקות הללו, הדפסת microcontact (μCP), התפתחה כשיטת חזקה ונגישה ליצירת מיקרו איי תא מודבק 10. לאחרונה, מאמצים נרחבים 11-14 נעשה כדי לפתח μCP על הידרוג&#39;ל עם קשיחויות מתכונן כדי לשחזר את מגוון הרחב של קשיחויות שנצפו ברקמות חיות. בין יצירות אלה, polyacrylamide (PAAm) הפך פופולרי 15 והוא כבר אחד המטריצות המבוסס על פולימר הנפוץ ביותר עבור מבחני ביומכניקה התא. משטחי PAAm הם פונקציונליות בדרך כלל עם מקשר הצולב heterobifunctional החלבונים sulfosuccinimidyl-6 N [4&#39;-azido-2&#39;-nitrophenylamido] (sulfo-SANPAH) וECM צמודים למשטח על ידי הפעלת UV של nitrophenyl sulfo-SANPAH קבוצות אזיד 16. טכניקה נוספת מורכבת בהידרזין צימוד לחלבונים שעברו חמצון קשהעם periodate 17. Hynd ועמיתים לעבודה הציגו טכניקה עבור דפוסי משטחי הידרוג&#39;ל biomimetic עם חלבון ופפטידים הדורשת photopolymerization בנוכחות של מונומר acroyl-streptavidin 18. לאחרונה, Tseng et al. דיווחו שיטה חדשה micropatterning 19 מבוססים על חשיפה לקרינת UV עמוקה של PAAm דרך מסכת קוורץ אופטית הדורשת לדגירת ג&#39;לי הרשות הפלסטינית מופעל עם 1-אתיל-3 [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) ופתרונות N-hydroxysuccinimide (NHS) מים לפני להוסיף את החלבון. למרות היכולת של טכניקות אלה כדי ליצור micropatterns חלבונים הומוגנית ושחזור, רובם סובלים מגבלות עיקריות: תהליכי סינתזה ארוכה (למשל, דיאליזה, lyophilization, וכו &#39;), תרכובות כימיות יקרות (למשל, חומצה היאלורונית, sulfo-SANPAH) UV עמוק או הקרנה. בנוסף, טכניקות אלה אינן מאפשרות אפנון עצמאי של קשיחות מצע, micropatternגיאומטריה, טבע חלבון ECM, וצפיפות תאים ליגנד. לוקח מגבלות אלה בחשבון, שפיתחנו גישה המבוססת על acrylamide רומן ופשוט, המאפשרת קיבוע של מגוון רחב של חלבונים ומולקולות ביולוגיים על הידרוג רך ומאפשרת כוונון עצמאי של רמזי mechanotransduction כדי לפענח את תפקידם על תפקודים תאיים. במקום לטפל הידרוג PAAm עם תרכובות כימיות קשות, אנחנו מציגים מונומר acrylamide מסחרי עם קבוצות הידרוקסיל במהלך פילמור PAAm. פעולה פשוטה זו מתגברת על הרכוש אנטי דבק הפנימי של הידרוג PAAm ללא כל דרישות טכניות אחרות. הנוכחות של קבוצות הידרוקסיל מובילה לזיקה גבוהה של הידרוג-PAAm הידרוקסי לחלבונים ומולקולות ביולוגיים היוצרים אינטראקציות מימן מליטה. בשילוב עם μCP, הידרוג-PAAm הידרוקסי לאפשר דור מהיר של פלטפורמת התרבות דו ממדים עם שליטה עצמאיתעל קשיחות מטריצה, סוג של חלבוני ECM, צפיפות תאים ליגנד ודביקות מוגבלת, אשר חזתה להיות פלטפורמה רבת עוצמה ללימוד mechanotransduction. מטרת פרוטוקול זה היא לספק את המידע הדרוש בקלות מה שהופך את הידרוג-PAAm הידרוקסי ללא מומחיות כלשהי במדעי חומר. המטרה הסופית היא לספק אמצעים לחוקרים לשאול שאלות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית ברמה התאית ורקמות שעשויות להוביל להבנה טובה יותר של מסלולי mechanotransduction המעורבים במנגנוני pathophysiological.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">UV/Ozone Photoreactor</td>
			<td style="width:71px;">Ultra-Violet Products</td>
			<td style="width:119px;">Model PR-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Rocking plate</td>
			<td style="width:71px;">IKAcWerke</td>
			<td style="width:119px;">Model KS 130 Basic</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Vortexer</td>
			<td style="width:71px;">Scientific Industries</td>
			<td style="width:119px;">Model Vortex Genie2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Vacuum degassing chamber</td>
			<td style="width:71px;">Applied Vacuum Engineering</td>
			<td style="width:119px;">DP- 8-KIT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Stainless steel forceps with fine tip</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z225304-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Dressing tissue forceps</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F4392-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Petri dishes in polystyrene</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5731-500EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Aluminium foil, thickness 0.5&#160;mm</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">266574-3.4G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Isopore membrane filter (0,2 &#181;m pore size)</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">GTTP Filter code</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Round glass coverslip (22 mm diameter)</td>
			<td style="width:71px;">Neuvitro</td>
			<td style="width:119px;">GG-22</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Round glass coverslip (25 mm diameter)</td>
			<td style="width:71px;">Neuvitro</td>
			<td style="width:119px;">GG-25</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Variable volume micropipette</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z114820</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Protein microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z666505-100EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Scalpel handles</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2896-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2771-100EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Cell culture flasks (75 cm2)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS430641</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z613983-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Polydimethylsiloxane&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Acrylamide (powder)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3553</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">N,N&#8217;-Methylenebis(acrylamide)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">146072</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">N-Hydroxyethylacrylamide</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">697931</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Amonium PerSulfate (APS)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3678</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">1805</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Human Plasma Fibronectin</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">FC010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Laminin from EHS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sodium hydroxyde</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221465-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Double-distilled water (ddH2O)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Endothelial cell growth medium</td>
			<td style="width:71px;">Cells Applications</td>
			<td style="width:119px;">211K-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C-003-5C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Accutase</td>
			<td style="width:71px;">PAA laboratories</td>
			<td style="width:119px;">L11-007</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">HEPES buffer solution 1M in H20</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83264-500ML-F</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Antibiotics-antimycotics</td>
			<td style="width:71px;">PAA laboratories</td>
			<td style="width:119px;">P11-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Phosphate Buffer Saline solution</td>
			<td style="width:71px;">PAA laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H15-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Phaloidin</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-vinculin antibody produced in mouse</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">V9131</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">T-2762</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Fibronectin</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">F3648</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">(rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">41469</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Laminin antibody</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">L9393</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">(rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-rabbit IgG-FITC</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7512</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3924-100ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459844-2.5L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of hydroxy-paam hydrogels for decoupling the effects of mechanotransduction cues

עכשיו זה גם נקבע כי רב תפקודים תאיים מוסדרים על ידי יחסי גומלין של תאים עם רמזי physicochemical ומכאניים של סביבתם מטריצת חוץ תאית (ECM). תאים האיקריוטים לחוש כל הזמן microenvironment המקומי שלהם באמצעות mechanosensors משטח כדי transduce שינויים פיזיים של ECM לאותות ביוכימיים, ולשלב את האותות האלה להשגת שינויים ספציפיים בביטוי גנים. מעניין, פרמטרים physicochemical ומכאניים של בני הזוג יכול ECM אחד עם השני כדי להסדיר את גורל תא. לכן, מפתח להבנת mechanotransduction הוא לנתק את תרומתו היחסית של רמזי ECM על תפקודים תאיים. כאן אנו מציגים פרוטוקול ניסוי מפורט במהירות ובקלות ליצור הידרוג רלוונטי מבחינה ביולוגית לכוונון העצמאי של רמזי mechanotransduction במבחנה. אנו הידרוג polyacrylamide שינוי כימי (PAAm) להתגבר באופן מהותי שאינו adhesive נכסים על ידי שילוב מונומרים acrylamide-פונקציונליות הידרוקסיל במהלך פילמור. השגנו הידרוג&#39;ל רומן PAAm, נקרא הידרוקסי-PAAm, המאפשר קיבוע מכל הסוג רצוי של חלבוני ECM. שילוב של הידרוקסי-PAAm הידרוג עם הדפסת microcontact מאפשרת לשלוט באופן עצמאי את המורפולוגיה של תאים בודדים, נוקשות המטריצה, הטבע והצפיפות של חלבוני ECM. אנו מספקים שיטה פשוטה ומהירה שניתן להגדיר בכל מעבדת ביולוגיה ללמוד בתהליכי mechanotransduction תא מבחנה. אנו מאשרים הרומן הזה פלטפורמה דו ממדים על ידי ביצוע ניסויים על תאי האנדותל המדגימים צימוד מכאני בין נוקשות ECM והגרעין.

איור 1 א מציג את שיתוף פילמור של acrylamide (AAM) וbisacrylamide (bis-עאם) עם N-hydroxyethylacrylamide מונומרים (HEA) המכילים הידרוקסיל עיקרי שהוקם על ידי פילמור הרדיקלי האקראי רשת הידרופילי של polyacrylamide עם קבוצות הידרוקסיל משובצות (הידרוקסי-PAAm) . בפרוטוקול זה, מ&quot;ג משקל 65 של חימום חייב להי...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues at JoVE.com

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

אנו מציגים הידרוג&#39;ל חדש polyacrylamide, נקרא הידרוקסי-PAAm, המאפשר ישיר מחייב של חלבוני ECM עם עלות או מומחיות מינימאלית. שילוב של הידרוקסי-PAAm הידרוג עם הדפסת microcontact מאפשרת שליטה עצמאית של רמזים רבים של microenvironment התא הטבעי ללימוד mechanostransduction הסלולרי.

הכנת הידרוקסי-PAAm הידרוג לצימוד האפקטים של רמזי mechanotransduction

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

preparation-hydroxy-paam-hydrogels-for-decoupling-effects

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.2K Views.  Université de Mons.  אנו מציגים הידרוג'ל חדש polyacrylamide, נקרא הידרוקסי-PAAm, המאפשר ישיר מחייב של חלבוני ECM עם עלות או מומחיות מינימאלית. שילוב של הידרוקסי-PAAm הידרוג עם הדפסת microcontact מאפשרת שליטה עצמאית של רמזים רבים של microenvironment התא הטבעי ללימוד mechanostransduction הסלולרי....

Video: Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

אקסון צמיחה מתיחה: Mechanotransduction הצמיחה העצבית

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

חלבון נמוך מולקולרית משקל העשרה על סרטים סיליקה mesoporous דק גילוי סמן ביולוגי

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

הסינתזה של RGD פונקציונלית הידרוג ככלי יישומים טיפוליים

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

סינתזה של הידרוג עם מאפייני Antifouling ופלטות לטיהור מים

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

הייצור של חלבון כמו אלסטין Hydrogels כימוס, Immunostaining של תאים ב- 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

מדידת הסלולר העולמי מטריקס מטאלו-פרוטאינאז ופעילות מטבולית Hydrogels תלת-ממד

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical environment. During this process, mechanosensitive osteocytes regulate the opposing responses between the catabolic osteoclasts and anabolic osteoblasts. To better understand the highly intricate signaling pathways that regulate this process, our lab has developed a foundationary lab-on-a-chip (LOC) platform for analyzing functional outcomes (formation and resorption) of bone remodeling within a small scale system. As bone remodeling is a lengthy process that occurs on the order of weeks to months, we developed long-term cell culturing protocols within the system. Osteoblasts and osteoclasts were grown on functional activity substrates within the LOC and maintained for up to seven weeks. Afterward, chips were disassembled to allow for the quantification of bone formation and resorption. Additionally, we have designed a 3D printed mechanical loading device that pairs with the LOC platform and can be used to induce osteocyte mechanotransduction by deforming the cellular matrix. We have optimized cell culturing protocols for osteocytes, osteoblasts, and osteoclasts within the LOC platform and have addressed concerns of sterility and cytotoxicity. Here, we present the protocols for fabricating and sterilizing the LOC, seeding cells on functional substrates, inducing mechanical load, and disassembling the LOC to quantify endpoint results. We believe that these techniques lay the groundwork for developing a true organ-on-a-chip for bone remodeling.

Here, we present protocols for analyzing bone remodeling within a lab-on-a-chip platform. A 3D printed mechanical loading device can be paired with the platform to induce osteocyte mechanostransduction by deforming the cellular matrix. The platform can also be used to quantify bone remodeling functional outcomes from osteoclasts and osteoblasts (resorption/formation).

פלטפורמת מעבדה על שבב לעירור מכניציט וניתוח תוצאות פונקציונליות של שיפוץ עצם

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

זן מבוקר של הידרוג'ל תלת מימדי תחת הדמיה מיקרוסקופית חיה

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...