1. בידוד של כונדרוציטים במפרק ראשי קציר 10-15 פרוסות סחוס בעובי מלאה ממשטחי המפרקים של מפרקים בבעלי חיים (למשל משותף מסרק-phalangeal של פרות בשלות כשלד המתקבלות מabbatoir מקומי). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות סחוס מניח בתבנית 100 מ&quot;מ פטר ודגירה ב20 מ&quot;ל של פרוטאז 0.5% בשינקין של F-12 (w / v) עבור 2 שעות ב 37 ° C. יש לשטוף שלוש פעמים בF-12 תקשורת התרבות של שינקין, ודגירה עם 20 מ&quot;ל של collagenase 0.15% בF-12 התקשורת של שינקין תרבות הלילה ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן השעית התא דרך מסנן מסך רשת 200 לתוך צלחת נקיה. שטוף את המסנן עם 5 מ&quot;ל של Ham של F-12 ולהוסיף לתבשיל. להעביר את השעית התא לצינור 50 מיליליטר חרוטים. לשטוף את צלחת פטרי עם 10 מ&quot;ל של Ham של F-12 ולהוסיף לצינור החרוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב600-800 RCF במשך 6-8 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant, ומבטיח לא להפריע הדואר תא גלולה ומחדש להשעות ב40 מ&quot;ל של F-12 תקשורת התרבות של שינקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב600-800 RCF במשך 6-8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.4 ו 1.5 פעמים יותר עבור סכום כולל של 3 פעמים. לפני צנטריפוגה בפעם השלישית, resuspend הגלולה באמצעות התססה ולקבל aliquot μl 500 לספירת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאי קיימא בשיטת ההדרה הכחולה Trypan 9 עם hemacytometer ומיקרוסקופ אור הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מחדש להשעות את הגלולה בהיקף של התקשורת של שינקין F-12 להכפיל את צפיפות הזריעה הרצויה (למשל 20 x 10 6 תאים / מ&quot;ל לריכוז סופי של 10 x 10 6 תאים / מ&quot;ל אחרי אנקפסולציה). </li></ol> 2. Encapsulation Hydrogel Chondrocyte-agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום 0.8 גרם autoclaved סוג השביעי agarose ב20 מ&quot;ל של 1x PBS סטרילי (pH 7.4) על צלחת חמה להגדיר עד 120 מעלות צלזיוס עד שהיא נמסה. ברגע מומס, מנמיך את האש עד 60 ° C כמו טמפרטורות גבוהות will להשפיע כדאיויות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור 50 מיליליטר חרוטים, יסודיות לערבב כמויות שווות של השעית התא עם הריכוז הכפול הרצוי של agarose (למשל 4% להשעית agarose 2% הידרוג agarose סופי). הימנע מיצירת הבועות גדולות כפי שהם יכולים להשפיע על כדאיויות תא ולבנות חיים עייפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות 10 מיליליטר aliquot של תערובת chondrocyte-agarose לתוך צלחת פטרי קוטר 60 מ&quot;מ, תוך הימנעות מיצירת בועות גדולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו לעמוד במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר עד gelled. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג כמה שיותר דגימות הידרוג chondrocyte-agarose לפי הצורך (בדרך כלל 20-30) באמצעות 4 מ&quot;מ ביופסית אגרוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ולתעד את הממדים הפיסיים (קוטר וגובה) של מדגמים מייצגים באמצעות מיקרומטר. מבנים צריכים להיות כ 5 מ&quot;מ הגובה, לבטל את כל דגימות שהתקבלו מאזור שבו דגימת שונות הגובה הייתה גדול מ 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות לצלחת פטרי 60 מ&quot;מ טריה ותוספתעם 10 מ&quot;ל של מדיה מלאה (20% בסרום למשל עוברים מבקר בF-12 תקשורת התרבות של שינקין עם 20 HEPES מ&quot;מ, 100 מיקרוגרם חומצה / מ&quot;ל אסקורבית ואנטיביוטיקה / antimycotics 2x). </li></ol> 3. גירוי וRadiolabelling מכאני של הידרוג Chondrocyte-agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיטוי הרכיבים המתכתיים של מתקן הדחיסה. לעקר את רכיבי פלסטיק עם אתנול 70% (לילה) ואור UV (לפחות 15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על מבנים את הנפילה, באמצעות מלקחיים, מקום 12 טבעות פלסטיק סטריליים התמך (עם קוטר פנימי גדול יותר מקוטר התבנית) (n = 6, דגימות ובקרה) בתוך הבארות של צלחת תרבות 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים, להעביר בזהירות את הידרוג chondrocyte-agarose מצלחת פטרי לצלחת 24 היטב, הבטחה שכל אחד במטבע חיזוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 400 μl של מדיה מלאה (לדוגמא 20% FBS בF-12 תקשורת התרבות של שינקין עם 20 HEPES מ&quot;מ, 100 מיקרוגרם / מיליליטר חומצה אסקורבית, ו2x אנטיביוטיקה / antimycotics) לכל דגימה היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את מתקן הדחיסה המעוקרת (איור 1) ולהבטיח את platens עם ברגים שנקבעו. צרף מתקן הדחיסה לצלחת התרבות 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר ולהבטיח מחדש את הברגים הקבועים ליצור קשר Platen-הידרוג&#39;ל (אפס מדינת מתח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מתקן הדחיסה התאסף לתוך מערכת בדיקת micromechanical מאך-1. מתקן מאובטח על הבמה האנכית באמצעות סיכה ונעילת איתור המקום עם בורג סט. הסר את מחול המרווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל טעינת דחיסה דינמית במשרעת רצויה (למשל 10% משרעת מתח המבוססת על הגובה המקורי של דגימות), תדירות (1 לדוגמא רץ) ומשך או מספר המחזורים (למשל מרווחי זמן של עד 60 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת הגירוי מכאני, החלף את מחול המרווח, שחרר את בורג סט סיכת האיתור ולהסיר את מעטת הדחיסה וצלחת תרבות מבדיקת מערכת micromechanical מאך-1. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבני Radiolabel תא הידרוג ידי להשלים את התקשורת עם 5 μCi של איזוטופ הרצוי (למשל [3 ח] תווית חלבון פרולין לסינתזת הקולגן chondrocyte ספציפית ו[ 35 S] גופרית לסינתזת גליקן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת מבני radiolabeled עבור 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את המבנים הידרוג radiolabeled ולשטוף 3 פעמים ב1x PBS (pH 7.4), כדי להסיר כל איזוטופ מאוגד. דגימות Digest באמצעות פפאין (40 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ביצטט אמוניום 20 מ&quot;מ, חומצת 1 מ&quot;מ ethyldiaminetetraacetic וdithiothreitol 2 מ&quot;מ על 65 המעלות צלזיוס במשך 72 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay לעכל לתוכן דנ&quot;א באמצעות assay PicoGreen הצבע 11 ופעילות איזוטופ משולב, מנורמל לתוכן ה-DNA, על ידי נצנץ β-נוזל ספירת עיכול פפאין מייד לאחר 12,13. </li></ol> הערה: הרכישה וסילוק חומרים רדיואקטיביים (איזוטופים פסולת ופריטיםשייתכן שהגיע לחומרים רדיואקטיביים מגע) חייב לעקוב מדיניות (ו / או ממשלתי) ונהלים לטיפול וסילוק הבטוח של חומרים רדיואקטיביים מוסדי רלוונטי. 4. נציג תוצאות מבני שור מפרקי chondrocyte-agarose הידרוג (2% agarose עם 10 10 x 6 תאים / תאים כמוסים מ&quot;ל) היו מגורה מכאני בהמשרעת של מתח דחיסה 10% בתדירות של הרץ 1 במשך 20 עד 60 דקות (או 1200 ל3600 מחזורים ) וassayed לתוכן ה-DNA וסינתזה תאית על ידי שילוב radioisotope. ה-DNA וסינתזת מטריקס הושפעה באופן תלוי מינון. תוכן ה-DNA הראה ירידה משמעותית 35% כתוצאה מ20 או 30 דקות של גירוי (p &lt;0.01), ואילו 60 דקות של גירוי הציגו שום אפקט (איור 2). סחוס ספציפי סינתזת הקולגן וגליקן (נקבע על ידי [3 ח]-פרולין ו<html> [35 S] שילוב גופרית, בהתאמה) הציג עלייה משמעותית של כ 60% בתגובה ל20 או 30 דקות של גירוי (p &lt;0.01), עם 60 דקות של גירוי אינה מראה סימני השפעה משמעותית (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig1.jpg" alt="איור 1" /> . האיור 1 סכמטי של מתקן הדחיסה הדינמית שהותקן על גירוי מבני chondrocyte-agarose שמאל:. אסדה מורכבת ימני:. התפוצץ נוף מראה רכיבים בודדים. <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. שינויים בתוכן ה-DNA של chondrocyte-agarose הידרוג מגורה מכאני תחת משרעת 10% דחיסת מתח ברץ 1 במשך 20 עד 60 דקות (ממוצע ± SEM, n = 6/group). her.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. שינויים בסינתזה תאית (קולגן וproteoglycans) של agarose chondrocyte הידרוג מגורה מכאני תחת משרעת מתח דחיסה 10% בהרץ 1 במשך 20 עד 60 דקות (ממוצע ± SEM, n = 6/group).

<ol>
	<li>Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+remodeling+in+response+to+mechanical+forces.">Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).</li><li>Kuettner, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+articular+cartilage+in+health+and+disease.">Biochemistry of articular cartilage in health and disease.</a> Clinical Biochemistry. 25, 155-163 (1992).</li><li>Neu, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interface+of+functional+biotribology+and+regenerative+medicine+in+synovial+joints.">The interface of functional biotribology and regenerative medicine in synovial joints.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 235-247 (2008).</li><li>Demarteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+compression+of+cartilage+constructs+engineered+from+expanded+human+articular+chondrocytes.">Dynamic compression of cartilage constructs engineered from expanded human articular chondrocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 310, 580-588 (2003).</li><li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+intermittent+compressive+stimulation+improves+the+composition+and+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage.">Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage.</a> Tissue Engineering. 10, 1323-1331 (2004).</li><li>Hunter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+compression+of+chondrocyte-seeded+fibrin+gels:+effects+on+matrix+accumulation+and+mechanical+stiffness.">Dynamic compression of chondrocyte-seeded fibrin gels: effects on matrix accumulation and mechanical stiffness.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 12, 117-130 (2004).</li><li>Buschmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+compression+modulates+matrix+biosynthesis+in+chondrocyte/agarose+culture.">Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture.</a> Journal of Cell Science. 108 (Pt 4), 1497-1508 (1995).</li><li>Quinn, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+compression+alters+proteoglycan+deposition+and+matrix+deformation+around+individual+cells+in+cartilage+explants.">Mechanical compression alters proteoglycan deposition and matrix deformation around individual cells in cartilage explants.</a> Journal of Cell Science. 111 (Pt 5), 573-583 (1998).</li><li>Kuettner, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cartilage+matrix+by+mammalian+chondrocytes+in+vitro.+I.+Isolation,+culture+characteristics,+and+morphology.">Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics, and morphology.</a> The Journal of Cell Biology. 93, 743-750 (1982).</li><li>Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+loading+of+chondrocytes+embedded+in+3D+constructs:+in+vitro+methods+for+assessment+of+morphological+and+metabolic+response+to+compressive+strain.">Mechanical loading of chondrocytes embedded in 3D constructs: in vitro methods for assessment of morphological and metabolic response to compressive strain.</a> Methods in Molecular Medicine. 100, 307-324 (2004).</li><li>McGowan, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+quantification+of+DNA+in+human+articular+and+septal+cartilage+using+PicoGreen+and+Hoechst+33258.">Biochemical quantification of DNA in human articular and septal cartilage using PicoGreen and Hoechst 33258.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10, 580-587 (2002).</li><li>Fan, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+intermittent+static+biaxial+tensile+strains+on+tissue+engineered+cartilage.">The effect of intermittent static biaxial tensile strains on tissue engineered cartilage.</a> Annals of Biomedical Engineering. 38, 1672-1682 (2010).</li><li>Kaupp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+vibrations+increase+the+proliferation+of+articular+chondrocytes+in+high-density+culture.">Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 222, 695-703 (2008).</li><li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+intermittent+shear+deformation+improves+the+quality+of+cartilaginous+tissue+formed+in+vitro.">Long-term intermittent shear deformation improves the quality of cartilaginous tissue formed in vitro.</a> Journal of Orthopaedic Research. 21, 590-596 (2003).</li><li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+application+of+cyclic+loading+can+accelerate+matrix+deposition+and+enhance+the+properties+of+tissue-engineered+cartilage.">A single application of cyclic loading can accelerate matrix deposition and enhance the properties of tissue-engineered cartilage.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 14, 323-330 (2006).</li><li>Kisiday, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dynamic+compressive+loading+on+chondrocyte+biosynthesis+in+self-assembling+peptide+scaffolds.">Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds.</a> Journal of Biomechanics. 37, 595-604 (2004).</li><li>Chowdhury, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+regulation+of+chondrocyte+metabolism+in+agarose+constructs+subjected+to+dynamic+compression.">Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

<html> השיטה המתוארת ליישום גירויים מכאניים מבוקרים לתא בעלת גרעין agarose הידרוג מאפשרת חקירה הישירה להשפעות של כוחות דחיסה דינמיים בחילוף חומרי chondrocyte. השימוש במתקן לבדיקה מותאמת אישית בשילוב עם טבעות התמך ספק מגבלת רוחב למבנים כדי להימנע מבעיות פוטנציאליות של מדגם מפנ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שמו של המגיב או ציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> החם של F-12 </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> SH3001002 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> C0130 </td><td></td></tr><tr><td> פרוטאז </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> F1051 </td><td></td></tr><tr><td> Ascorbate </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> A4034 </td><td></td></tr><tr><td> אנטיביוטיקה / antimycotics </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> A5955 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> HEP001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan כחול </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> 93595 </td><td></td></tr><tr><td> רייכרט מואר ליין Hemacytometer </td><td> אוסר מדעי </td><td> 1490 </td><td></td></tr><tr><td> קוואנט-IT PicoGreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7589 </td><td></td></tr><tr><td> פפאין מפפאיה לטקס </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> P3125 </td><td></td></tr><tr><td> תצטט אמוניום </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> A1542 </td><td></td></tr><tr><td> חומצת Ethyldiaminetetraacetic </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> DL-Dithiothreitol </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> 43819 </td><td></td></tr><tr><td> נקודת התכה נמוך agarose, סוג שביעי </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> A9045 </td><td></td></tr> &lt;p&gt; <td> מסך Mesh (200) סנן </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> S4145 </td><td></td></tr><tr><td> מאך-1 Tester micromechanical </td><td> Biomomentum בע&quot;מ </td><td> V500cs </td><td></td></tr><tr><td> דחיסה טוען לנענע </td><td> שהותקן </td><td></td><td> מוצר דומה יכול להיות מסופק על ידי Biomomentum בע&quot;מ </td></tr><tr><td> פלייט התרבות פלקון 24 ובכן </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> B353047 </td><td></td></tr><tr><td> מונה הנצנץ β-Liquid </td><td> Beckman Coulter </td><td> LS6500 </td><td></td></tr><tr><td> [3H] פרולין </td><td> פרקין אלמר- </td><td> NET323005MC </td><td></td></tr><tr><td> [35S] גופרית </td><td> פרקין אלמר- </td><td> NEX041005MC </td><td></td></tr></tbody></table>

mechanical stimulation of chondrocyte-agarose hydrogels

סחוס במפרק סובל מיכולת תיקון מוגבלת, כאשר נפגע על ידי עלבון מכאני או מושפל על ידי מחלה, כגון דלקת מפרקים ניוונית. כדי לתקן את הליקוי הזה, כמה התערבויות רפואיות פותחו. שיטה אחת כזו היא לשוב אל פני שטח לאזור הפגוע ברקמת סחוס מהונדס, אך בדרך כלל רקמה המהונדסת חסרות את המאפיינים ועמידות ביוכימיים של סחוס מקורי, חקירת השרידות ארוכות הטווח שלו. זה מגביל את יישום הנדסת רקמות סחוס לתיקון פגמי מוקד קטנים, בהסתמך על הרקמה שמסביב כדי להגן על החומר המושתל. כדי לשפר את התכונות של הרקמות המפותחות, גירוי מכאני הוא שיטה פופולרית משמשת להגברת הסינתזה של מטריקס סחוסים, כמו גם את התכונות המכאניות כתוצאה של הרקמות המהונדסות. גירוי מכאני חל כוחות לרקמה בונה מקביל לאלו בגוף חי. זההוא מבוסס על ההנחה שהסביבה המכאנית, בחלקו, מסדירה את הפיתוח והתחזוקה של 1,2 רקמת ילידים. הצורה הנפוצה ביותר מיושמת של גירוי מכאני בהנדסת רקמת סחוס היא דחיסה דינמית בזנים פיסיולוגיים של כ 5-20% בתדירות של 1 הרץ 1,3. מספר מחקרים בחנו את ההשפעה של דחיסה דינמית והראו את זה יש השפעה חיובית על חילוף חומרים וביוסינטזה chondrocyte, סופו של דבר משפיע על התכונות הפונקציונליות של 4-8 רקמות המפותחות. במאמר זה, אנו מדגימים את השיטה המכאנית כדי לעורר מבנים הידרוג chondrocyte-agarose תחת דחיסה דינמית ולנתח שינויים ביוסינתזה דרך מבחנים ביוכימיים וradioisotope. שיטה זו יכולה גם להיות שונה כדי קושי להעריך את שינויים שנגרמו פוטנציאל בתגובה תאית כתוצאה מגירויים מכאניים.

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels at JoVE.com

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

ביוסינתזה של מטריקס סחוסים ידי כונדרוציטים יכולה להיות מושפעת על ידי יישום של גירויים מכאניים. שיטה זו מתארת ​​את הטכניקה של החלת זני דחיסה דינמיים לכונדרוציטים גלומים במבני 3D וההערכה של Induced שינויים בחילוף חומרי chondrocyte.

גירוי מכאני של הידרוג Chondrocyte-agarose

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

mechanical-stimulation-of-chondrocyte-agarose-hydrogels

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Views.  Queen's University. ביוסינתזה של מטריקס סחוסים ידי כונדרוציטים יכולה להיות מושפעת על ידי יישום של גירויים מכאניים. שיטה זו מתארת ​​את הטכניקה של החלת זני דחיסה דינמיים לכונדרוציטים גלומים במבני 3D וההערכה של Induced שינויים בחילוף חומרי chondrocyte.

Video: Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace. Most are associated with repetitive, high force hand activities. The mechanisms of cellular and structural damage due to cyclical loading are not well known. The purpose of this video is to present a new system that can simultaneously load four tendons in tissue culture. The video describes the methods of sterile tissue harvest and how the tendons are loaded onto a clamping system that is subsequently immersed into media and maintained at 37&deg;C. One clamp is fixed while the other one is moved with a linear actuator. Tendon tensile force is monitored with a load cell in series with the mobile clamp. The actuators are controlled with a LabView program. The four tendons can be repetitively loaded with different patterns of loading, repetition rate, rate of loading, and duration. Loading can continue for a few minutes to 48 hours. At the end of loading, the tendons are removed and the mid-substance extracted for biochemical analyses. This system allows for the investigation of the effects of loading patterns on gene expression and structural changes in tendon. Ultimately, mechanisms of injury due to overuse can be studies with the findings applied to treatment and prevention.

A new in vitro system for simultaneously loading four tendons in culture is described.

Ex vivo טוען מכני של גיד

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain

The role of mechanical forces in the development and maintenance of biological tissues is well documented, including several mechanically regulated phenomena such as bone remodeling, muscular hypertrophy, and smooth muscle cell plasticity. However, the forces involved are often extremely complex and difficult to monitor and control in vivo. To better investigate the effects of mechanical forces on cells, we have developed an in vitro method for applying uniaxial cyclic tensile strain to adherent cells cultured on elastic membranes. This method utilizes a custom-designed bioreactor with a motorized cam-rotor system to apply the desired force. Here we present a step-by-step video protocol demonstrating how to assemble the various components of each "stretch chamber", including, in this case, a silicone membrane with micropatterned topography to orient the cells with the direction of the strain. We also describe procedures for sterilizing the chambers, seeding cells onto the membrane, latching the chamber into the bioreactor, and adjusting the mechanical parameters (i.e. magnitude and rate of strain). The procedures outlined in this particular protocol are specific for seeding human mesenchymal stem cells onto silicone membranes with 10 &micro;m wide channels oriented parallel to the direction of strain. However, the methods and materials presented in this system are flexible enough to accommodate a number of variations on this theme: strain rate, magnitude, duration, cell type, membrane topography, membrane coating, etc. can all be tailored to the desired application or outcome. This is a robust method for investigating the effects of uniaxial tensile strain applied to cells in vitro.

It is widely understood that mechanical forces in the body can influence cell differentiation and proliferation. Here we present a video protocol demonstrating the use of a custom-built bioreactor for delivering uniaxial cyclic tensile strain to stem cells cultured on flexible micropatterned substrates.

גירוי מכני של גזע תאים באמצעות מסננים uniaxial מחזורי

The role of mechanical forces in the development and maintenance of biological tissues is well documented, including several mechanically regulated ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

Encapsulation נייד ב הידרוג 3D עבור הנדסת רקמות

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the brain, liver, retina, cochlea and vasculature. In experimental settings, intercellular Ca2+-waves can be elicited by applying a mechanical stimulus to a single cell. This leads to the release of the intracellular signaling molecules IP3 and Ca2+ that initiate the propagation of the Ca2+-wave concentrically from the mechanically stimulated cell to the neighboring cells. The main molecular pathways that control intercellular Ca2+-wave propagation are provided by gap junction channels through the direct transfer of IP3 and by hemichannels through the release of ATP. Identification and characterization of the properties and regulation of different connexin and pannexin isoforms as gap junction channels and hemichannels are allowed by the quantification of the spread of the intercellular Ca2+-wave, siRNA, and the use of inhibitors of gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-wave in monolayers of primary corneal endothelial cells loaded with Fluo4-AM in response to a controlled and localized mechanical stimulus provoked by an acute, short-lasting deformation of the cell as a result of touching the cell membrane with a micromanipulator-controlled glass micropipette with a tip diameter of less than 1 &mu;m. We also describe the isolation of primary bovine corneal endothelial cells and its use as model system to assess Cx43-hemichannel activity as the driven force for intercellular Ca2+-waves through the release of ATP. Finally, we discuss the use, advantages, limitations and alternatives of this method in the context of gap junction channel and hemichannel research.

Intercellular Ca2+-waves are driven by gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-waves in cell monolayers in response to a local single-cell mechanical stimulus and its application to investigate the properties and regulation of gap junction channels and hemichannels.

הרבייה מכאנית מושרה גירוי סיד גל בmonolayers הסלולרי: דוגמה לתאי אנדותל קרני שור

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, the effect of tissue elasticity on cell function is a major area of mechanobiology research because tissue stiffness modulates with disease, development, and injury. Static tissue-mimicking materials, or materials that cannot alter stiffness once cells are plated, are predominately used to investigate the effects of tissue stiffness on cell functions. While information gathered from static studies is valuable, these studies are not indicative of the dynamic nature of the cellular microenvironment in vivo. To better address the effects of dynamic stiffness on cell function, we developed a DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel system (DNA gels). Unlike other dynamic substrates, DNA gels have the ability to decrease or increase in stiffness after fabrication without stimuli. DNA gels consist of DNA crosslinks that are polymerized into a polyacrylamide backbone. Adding and removing crosslinks via delivery of single-stranded DNA allows temporal, spatial, and reversible control of gel elasticity. We have shown in previous reports that dynamic modulation of DNA gel elasticity influences fibroblast and neuron behavior. In this report and video, we provide a schematic that describes the DNA gel crosslinking mechanisms and step-by-step instructions on the preparation DNA gels.

Our laboratory has developed DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels, a dynamic hydrogel system, to better understand the effects of modulating tissue stiffness on cell function. Here, we provide schematics, descriptions, and protocols to prepare these hydrogels.

הכנת-crosslinked DNA polyacrylamide הידרוג

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. It has been discovered and rigorously studied using the patch-clamp technique for almost three decades. Its basic role of translating tension applied to the cell membrane into permeability response makes it a strong candidate to function as a mechanoelectrical transducer in artificial membrane-based biomolecular devices. Serving as building blocks to such devices, droplet interface bilayers (DIBs) can be used as a new platform for the incorporation and stimulation of MscL channels. Here, we describe a micropipette-based method to form DIBs and measure the activity of the incorporated MscL channels. This method consists of lipid-encased aqueous droplets anchored to the tips of two opposing (coaxially positioned) borosilicate glass micropipettes. When droplets are brought into contact, a lipid bilayer interface is formed. This technique offers control over the chemical composition and the size of each droplet, as well as the dimensions of the bilayer interface. Having one of the micropipettes attached to a harmonic piezoelectric actuator provides the ability to deliver a desired oscillatory stimulus. Through analysis of the shapes of the droplets during deformation, the tension created at the interface can be estimated. Using this technique, the first activity of MscL channels in a DIB system is reported. Besides MS channels, activities of other types of channels can be studied using this method, proving the multi-functionality of this platform. The method presented here enables the measurement of fundamental membrane properties, provides a greater control over the formation of symmetric and asymmetric membranes, and is an alternative way to stimulate and study mechanosensitive channels.

Bacterial mechanosensitive channels can be used as mechanoelectrical transducers in biomolecular devices. Droplet interface bilayers (DIBs), cell-inspired building blocks to such devices, represent new platforms to incorporate and stimulate mechanosensitive channels. Here, we demonstrate a new micropipette-based method of forming DIBs, allowing the study of mechanosensitive channels under mechanical stimulation.

רב תכליתיים, Micropipette מבוסס שיטה להתאגדות וגירוי של ערוצים בקטריאלי Mechanosensitive יון בbilayers ממשק אגל

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of assisted reproduction techniques such as oocyte in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF) and cloning of domestic animals by nuclear transfer from somatic cell. IVM is the method particularly of significance. It is the platform technology for the supply of mature, good quality oocytes for applications such as reduction of the generation interval in commercially important or endangered species, research concerning in vitro human reproduction, and production of transgenic animals for cell therapies. The term oocyte quality includes its competence to complete maturation, be fertilized, thereby resulting in healthy offspring. This means that oocytes of good quality are paramount for successful fertilization including IVF procedures. This poses many difficulties to develop a reliable culture method that would support growth not only of human oocytes but also of other large mammalian species. The first step in IVM is the in vitro culture of oocytes. This work describes two protocols for the 3D culture of porcine oocytes. In the first, 3D model cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in a fibrin-alginate bead interpenetrating network, in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. In the second one, COCs are suspended in a drop of medium and encapsulated with fluorinated ethylene propylene (FEP; a copolymer of hexafluoropropylene and tetrafluoroethylene) powder particles to form microbioreactors defined as Liquid Marbles (LM). Both 3D systems maintain the gaseous in vitro culture environment. They also maintain COCs 3D organization by preventing their flattening and consequent disruption of gap junctions, thereby preserving the functional relationship between the oocyte, and surrounding follicular cells.

Presented here are two protocols for the encapsulation of porcine oocytes in 3D culture conditions. In the first, cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in fibrin-alginate beads. In the second, they are enclosed with fluorinated ethylene propylene powder particles (microbioreactors). Both systems ensure optimal conditions to maintain their 3D organization.

הידרוג'לים אלג'ינאט מפורקים ופרוטאוליטית ומיקרוביו-סיבה לאנקלוסציה של פורצין אוציט

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...