עבודה זו נתמכה על ידי מלגה לונדבק Junior קבוצת לידר לLNN. PWW מכיר בתמיכה במימון מענק ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (NSERC). אנו מודים גם מולקולרי מרכז bioimaging הדנית באוניברסיטת דרום דנמרק לגישה לספינינג מיקרוסקופ דיסק.

רכישה של חלבונים מתויגים EGFP בקרום הפלזמה לניתוח kICS יכולה להיעשות על מיקרוסקופ epifluorescence, התקנת TIRF או על מיקרוסקופ דיסק מסתובב מוגדר לרכוש תמונות של הקרום של עניין. גודל פיקסל המצלמה, כמו גם את הזמן בין מסגרות תמונה הוא זקוק לניתוח. רצפי תמונה של 100-1,200 מסגרות במסגרת שיעור של 4-30 הרץ יכולים לשמש לניתוח. במהלך הרכישה, חשוב לשמור על הקרום בפוקוס לאורך כל תקופת ההדמיה ולהתמקד בחלק של הקרום השטוח שבו הקרינה היא מפוזרת באופן אחיד. העברת שלפוחית, בולט אזורי קרום ואברונים בתא יכול להיות קצוץ מאוחר יותר בתהליך הניתוח. יש לבחור בזמן הרכישה, כך שאין להיסחף או תנועה של התא. כדי להשיג את תסריטי קוד kICS לMATLAB, פנה לפול וייסמן (Paul.Wiseman @ McGill.ca). בפעם הראשונה קוד kICS משמשת, MAT הפתוחLAB ולחץ על קובץ, נתיב ולאחר מכן קבע, לאחר מכן לחץ על הוספה בתיקיות משנה ולמצוא את התיקייה במחשב שבו קוד kICS ממוקם. לאחר מכן לחץ על OK, לשמור ולסגור. כעת המשכתי עם הניתוח של גידולים מתוארים בנקודות הבאות. 1. ייבא את התמונה ברצף של ריבית לתוכנית ההדמיה ניתוח כסטאק TIFF שמור את הקובץ בשם: stack1.tif. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור מלבני של עניין (ROI) בחלק השטוח של הקרום לא כולל אברונים בתא מרגשים ובולטים אזורי הממברנה. גודל היבול נבחר כך מספיק נתונים סטטיסטיים המופקים עבור k טוב 2 מגרשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את האזור ולשמור את היבול כקובץ TIFF בתיקייה מתאימה. אם יש כמה יבולים מאותו הסרט, השתמש בתוספת מספר, &quot;stack1crop.tif&quot; לדוגמא &quot;, stack1crop2.tif&quot;, &quot;stack1crop3.tif&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התיקייה המכילה את הגידולים מקומייםבמחשב, לא בשרת, בעת עושה ניתוח kICS. </li></ol> 2. ייבא את הגידולים לתוכנת אחת ניתוח אחד כדי לבצע את ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MATLAB הפתוח והסוג &quot;icsgui&quot; בחלון הפקודה ולחץ על ENTER. ICS GUI הוא שם ההפעלה עבור תכנית ממשק מתאם ספקטרוסקופיה תמונת המשתמש גרפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בGUI ICS לחץ על כרטיסיית &quot;kICS&quot;. צילום מסך של חלון הניתוח מוצג באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את התיקייה עם שם התיקייה &quot;קוד MATLAB&quot; ונווט עד הקובץ בשם הקובץ &quot;סקריפטים&quot; ולפתוח את זה על ידי לחיצה הכפולה עליו. לחלופין, לחץ לחיצה ימנית על הקובץ ובחר באפשרות &quot;לפתוח עם MATLAB&quot; או ללכת לקובץ, פתח בMATLAB ולפתוח את קובץ התסריטים. קובץ זה נקרא עורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגלילה לעורך &quot;kICS טען ערכות נתונים&quot;, ואז להעתיק או שם קובץ של סוג ומיקום תיקייה לשורת הפקודה שמתחילהעם &quot;C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif&quot; img = למשל. בשורת הפקודה שלהלן את מיקום התיקייה לקבוע את מספר המסגרות להיות מנותחים - למשל [1:500]. השתמש באותן הגדרות עבור כל הסרטים ברציפות בסדרת הנתונים. אם יש סחיפת התמקדות במסגרות מאוחר יותר, אלה צריכים להיות נכללים בניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעורך לחץ על &quot;שמור&quot; ולאחר מכן לחץ על &quot;להעריך תא&quot;. בסיס הנתונים כעת נטען לתוך לתוך תוכנת הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון kICS ניתוח בGUI, הזן את ההגדרות עבור הניתוח: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל תיבות &quot;תא T&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את המספר של זמן מפגר להיות מנותח. מספר פיגורי זמן (τ) יהיה השפעה על עלילת דיפוזיה וחייב להיבחר כך שעלילת דיפוזיה היא ליניארי. התחל עם כניסת 25 ולאחר מכן ירידה למקום שבי עלילת דיפוזיה היא ליניארי. τ הוא מספר בזמן מפגר ניתוח kICS משווה ולעתים חולפים זמן הוא ב הזמןetween מסגרת אחד למשנו. הערך הקטן ביותר שנותן עלילה ליניארית יש לבחור. המספר המרבי של זמן מפגר נבחר כך ליניארי בכושר מתקבל, בחירת ערך גבוה יותר יהיה לייצר נתונים שלא ניתן להתקין קו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את k 2 הערך המרבי (ראה עיגול 1 באיור 1), זה בדרך כלל 20-50. K 2 עלילה טובה היא עלילה שבה קיימות נקודות נתונים רבות אשר מופצות לאורך קו. התחל עם כניסת 70 ולאחר מכן ירידה לאחר שהעריך את מגרשי k 2 ודיפוזיה ובחר את הערך הנמוך ביותר שבו נקודות נתוני המקבץ סביב קו ישר. ערך 2 k הוא גודל הריבוע של k-הווקטור המרחבי במרחב פורייה. בתחילה, הניתוח יש לחזור עד לערכים הטובים ביותר נקבעים, ואז להשתמש באותן הגדרות עבור כל הסרטים ברציפות בסדרת נתונים, אבל תמיד לבדוק שההגדרות שנבחרו לתת בכושר טוב לנתונים: k טוב 2 חלקותועלילת דיפוזיה ליניארי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;הגדרות חנות ולהמשיך&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;כן&quot; כדי להציג את כל הגרפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;סדרה טען תמונה&quot; (ראה עיגול 2 באיור 1), ולאחר מכן לחץ על &quot;סביבת עבודה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;imgSerCrop&quot;, ולאחר מכן לחץ על &quot;יבוא מסביבת העבודה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את הגדרות אוסף מערכת הדמיה. ב&quot; גודל פיקסל &quot;תיבה להזין את גודל פיקסל מוקרן למערכת ההדמיה שבה ערימות התמונה נרכשות. לAQP3-EGFP, 0.111 היו בשימוש. בתיבה &quot;הזן את השעה (ים) בין מסגרות&quot;, 0.1150 שימשו לAQP3-EGFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;בחר ROIs&quot;, הזן &quot;1&quot;, לחץ על אישור ו&quot; להשתמש בתמונה כולה &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;ניתוח Do kICS&quot; ולחץ כן לעשות &quot;סינון נייח&quot;. תוצאות ייפתחו באופן אוטומטי כתמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזער את חלון הגדרות, למזער את Windo מידע תאw, ולמזער את חלון photophysics. בחלון הדינמיקה, בדוק שעלילת דינמיקת תערוכות יניארי התאמה של הנתונים לקו עם שיפוע שלילי, כלומר נקודות נתונים לתאם ודיפוזיה חופשית ניתן להניח. רשום את מקדם הדיפוזיה לפיגור זמן המסוים וk 2 הגדרות (זה לא הכרחי לציין את סטיית התקן של הכושר). נקודות נתונים בk 2 המגרשים חייבים להיות התקבצו סביב הקו בזמן נתון מפגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את התיבה &quot;שמור דמויות פתוחות כתמונות&quot;, לאחר מכן לחץ על &quot;שמור דמויות פתוחות כתמונות&quot; כדי לשמור לגרום קבצים. לשמור בתיקייה חדשה תחת C: Users Documents AQP3diffusion. לחץ על &quot;הנתונים הנוכחיים ברורים&quot; ותמשיך עם ניתוח של היבול הבא. </li></ol></li></ol> 3. הממוצע של המקדם הדיפוזיה מחושבת מחושב כדי לקבל סקירה כללית של הנתונים שנותחו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את מקדמי דיפוזיה הבודדים מהחזר על השקעה בspreadsheet (הקפד לציין τ וk 2 ערכים), השתמש בשמות של הגידולים כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מקדם הדיפוזיה הממוצע וסטיית התקן באמצעות תכנית גיליון אלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בדיקת קולמוגורוב-סמירנוב או סטודנטים מבחן t להעריך הבדלים סטטיסטיים באמצעות רמה מובהקת של 5%. השוואות Quantitave בין תאים (לדוגמא שטופלה לעומת nontreated) יכולות להתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הגיליון האלקטרוני הגרסה של חלקות דיפוזיה שנוצרה על ידי תוכנת הניתוח עבור כל יבול, ומחשבים את ממוצע הנתונים עבור כל מצב עבור כל זמן השהיה. ליצור עלילת דיפוזיה ממוצע חדשה להצגת במסמכים או מצגות. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=k-Space+image+correlation+spectroscopy:+A+method+for+accurate+transport+measurements+independent+of+fluorophore+photophysics.">k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics.</a> Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).</li><li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+Applications+to+membrane+dynamics.">Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).</li><li>Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lateral+diffusion+of+membrane+molecules+with+quantum+dots.">Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots.</a> Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li><li>Pinaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+a+glycosyl-phosphatidylinositol-anchored+protein+in+glycosphingolipid-rich+microdomains+imaged+by+single-quantum+dot+tracking.">Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking.</a> Traffic. 10, 691-712 (2009).</li><li>Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+analysis+of+single-molecule+tracking+data+by+comprehensive+testing+against+Monte+Carlo+simulations.">Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations.</a> Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).</li><li>Durisic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+correction+of+blinking+bias+in+image+correlation+transport+measurements+of+quantum+dot+tagged+macromolecules.">Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules.</a> Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).</li><li>Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+regulated+membrane+diffusion+of+a+green+fluorescent+protein-aquaporin+2+chimera.">cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera.</a> Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).</li><li>Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+the+endoplasmic+reticulum+of+an+aquaporin-2+mutant+causing+human+nephrogenic+diabetes+insipidus.">Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).</li><li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+image+correlation+spectroscopy+(PICS):+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data.">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys J. 92, 613-621 (2007).</li><li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy:+concept+and+application.">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).</li><li>Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., L&#248;cke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+cAMP+increases+aquaporin-3+plasma+membrane+diffusion.">Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מאמר זה הציג סקירת צעד אחר צעד מפורטת של איך ליישם את שיטת ניתוח kICS לקבוע מקדמי דיפוזיה מתמונות מיקרוסקופית של חלבונים מתויגים עם חלבוני ניאון. הניתוח אינו תלוי בבחירת בדיקה עם טווח דינמי רחב מאוד בצפיפות תיוג ולכן יכול להיות מיושם גם לחלבונים שכותרתו עם נקודות קוונ?...

ארגון ארבעה ממדי החלל ובזמן והניידות לרוחב של חלבוני קרום פלזמה בחוזקה מוסדרות ועשויים לשחק תפקיד בתפקוד חלבון, פעילות ואינטראקציות בין חלבונים. דיפוזיה רוחבית של חלבוני קרום פלזמה, באופן מסורתי נחקרה על ידי חישוב מקדמי דיפוזיה עבור חלקיקים בודדים מהזמן לשגות הדמיה של נקודה קוונטית או לצבוע את חלבוני קרום הפלזמה שכותרתו 2-4. גישה זו דורשת החדרת תג תאי בחלבון הפלזמה הממברנה לנקודה קוונטית או תיוג צבע, אשר יכול לסכן את קיפול חלבונים ותפקוד ובכך, לא ניתן להשיג עבור חלק מחלבונים. הנפח הסטרי של נקודה קוונטית הוכח להאט דיפוזיה של החלבון 5 ויותר מכך, רק חלק זעיר של החלבונים באוכלוסייה מסומנים עם נקודות קוונטיות, וזה לא ידוע אם חלק קטן הזה הוא נציג לסך בריכה של חלבוני קרום פלזמה. טרה חלקיק יחידהמדידות cking (SPT) של מקדמי דיפוזיה סדרת תמונה של חלבוני שכותרת נקודה קוונטית מכרוכות במיפוי עמדות שיא הדמיה של חלקיקים עם שני גאוס ממדי מתאים אחרי אלגוריתמי ניתוח נרחבים. הניתוח הוא המחשוב מאוד אינטנסיבי, הדורש עקומה שאינה ליניארי נרחב הולמת בכל מסגרת תמונה של רצף הזמן לשגות לקירובים של פונקצית התפשטות נקודת מיקרוסקופ (בדרך כלל שני Gaussians מרחבי ממדי) וקישור הבא של עמדות חלקיקים למסלולי חלקיקים המתאר את תנועה של מולקולות בודדות 6,7. טכניקת מתאם תמונה שפותחה לאחרונה, מתאם תמונת k-Space ספקטרוסקופיה (kICS) מאפשרת מדידות פשוטות היחסית של מקדמי דיפוזיה של חלבונים מתויגים fluorescently קרום פלזמה. האפשרות לחשב באופן שגרתי מקדמי דיפוזיה של חלבונים בממברנה שכותרתו עם חלבוני ניאון על ידי kICS היא כלי ייחודי המחזיקמספר יתרונות על פני קוונטים מסורתיים מנקדים ניתוח SPT: אין כניסה של תגים תאיים וזמן רב תיוג תאי נדרש (ניתן להשתמש בשורות תאים לבטא חלבוני ניאון); מקדמי דיפוזיה מופקים מכלל המאגר של חלבוני ניאון בהשוואה לקבוצת משנה שכותרתו עם נקודות קוונטיות; הניתוח הוא פשוט ללא הצורך לעקוב אחר חלבונים יחיד והניתוח יכול להתבצע באמצעות קוד קיים, ללא צורך בתכנות משתמש נוסף. השיטה היא מהירה כי זה טכניקת מיצוע המאפשרת חישוב וחישוב מהירים של מקדמי דיפוזיה. מדידות דיפוזיה המהירה אלה לאוכלוסיית החלבון משלימות את מידע תחבורה המולקולרי מפורט יותר שהושג לקבוצת משנה של כלל האוכלוסייה על ידי שיטות SPT מדקדק. זמן kICS קורלציה רצפי תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי שראשון הפכו למקום פורייה, ובכך מפריד flתנודות uorescence עקב photophysics מאלו כתוצאה מההובלה מולקולרית 1. כתוצאה מכך, kICS יכול לקבוע את צפיפות המספר, מהירות זרימה, ודיפוזיה של כותרתו fluorescently מולקולות בעת היותו בלתי משוחד על ידי photobleaching המורכב או מהבהב של fluorophores. זה עושה kICS כלי שימושי לקביעת מהירות דינמיקת דיפוזיה של חלבוני קרום תא fluorescently שהכותרת ללא הצורך בכתיבת האלגוריתמים מותאמים אישית. חלבונים חוץ מכותרתו fluorescently, יכול להיות מיושמים גם kICS לחלבוני קרום קוונטים שכותרת נקודה 8. מאמר זה מספק מבוא צעד אחר הצעד כיצד להשתמש kICS לחלץ מקדמי דיפוזיה של חלבוני קרום פלזמה מתויגים-EGFP ידי המדגים כיצד למקם את היבול, את אופן השימוש בקוד וכיצד להעריך את החלקות שנוצרו, שממנו דיפוזיה מקדמים מחולצים. כדוגמא, נתונים המתקבלים על ידי ספינינג סט דיסק מיקרוסקופיה בהשתקפות פנימית למחצה כוללת לזרוחמצב NCE (TIRF), של חלבון תעלת המים aquaporin-3 כליות (AQP3) מתויגים עם EGFP מוצג.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31600-083</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicilin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=en&amp;region=DK">13752</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15160070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11860038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol red free medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11880-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=en&amp;region=DK">D8418&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15630056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning Disk Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Ti Eclipse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:71px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">Ixon+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy measurement of diffusion coefficients of egfp-tagged plasma membrane proteins using k-space image correlation spectroscopy

דיפוזיה ומידור של חלבוני קרום פלזמה לרוחב מוסדרים בחוזקה בתאים ובכך, לומדות את התהליכים האלה יגלו תובנות חדשות לפונקציה פלזמה קרום חלבון ורגולציה. לאחרונה, מתאם תמונת k-Space ספקטרוסקופיה (kICS) 1 פותח כדי לאפשר מדידות שגרתיות של מקדמי דיפוזיה ישירות מתמונות של חלבוני קרום פלזמה מתויגים פלורסנטי, שנמנעו מהטיות שיטתיות הוצגו על ידי photophysics בדיקה. למרות הבסיס התיאורטי לניתוח הוא מורכב, השיטה יכולה להיות מיושמת על ידי nonexperts באמצעות קוד זמין באופן חופשי למדידת מקדמי דיפוזיה של חלבונים. kICS מחשבת פונקציית מתאם זמן מערימת תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר שינוי פורייה של כל תמונה למרחב גומלין (k-). בהמשך לכך, מיצוע מעגלי לוגריתם, טבעי ולהפוך ליניארי מתאים לפונקציית המתאם מניב את מקדם הדיפוזיה. זהנייר מספק מדריך צעד אחר צעד לניתוח התמונה והמדידה של מקדמי דיפוזיה דרך kICS. ראשית, תמונה ברצף במסגרת שיעור גבוהה של חלבון קרום פלזמה שכותרתו fluorescently נרכש באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר מכן, באזור של עניין (ROI) הימנעות אברונים תאיים, נע שלפוחית ​​או בולטות אזורי קרום נבחר. ערימת ההחזר על ההשקעה מיובאת לקוד זמין באופן חופשי וכמה פרמטרים שהוגדר (ראה סעיף שיטה) נקבעים לניתוח kICS. התכנית לאחר מכן יוצרת &quot;מדרון של מדרונות&quot; עלילה מפונקציות קורלציה זמן k-המרחב, ומקדם הדיפוזיה מחושב מהשיפוע של העלילה. להלן הליך kICS צעד אחר צעד כדי למדוד את מקדם הדיפוזיה של חלבון בממברנה באמצעות תעלת המים aquaporin-3 הכליות מתויגות עם EGFP כדוגמא הקנונית.

לרכישת ערימות תמונה מתאימות להיות מנותח עם kICS, ניתן להשתמש מיקרוסקופ מערכות שונות. אפשר לנתח רצפי תמונה ממיקרוסקופ עלית הקרינה, כמו גם דיסק התקנת TIRF או ספינינג. הממברנה חייבת להיות שטוחה ללא כל האברונים בתא מרגש גדולים או העברת שלפוחית ​​/ אובייקטים. מאמר זה מציג תמו...

Watch this Scientific Journal Video about Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy at JoVE.com

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד למתאם טכניקת ניתוח תנודות k-Space תמונת ספקטרוסקופיה (kICS) למדידת מקדמי דיפוזיה של כותרתו fluorescently חלבוני קרום פלזמה בתאי יונקים חיים.

קל מדידה של מקדמי דיפוזיה של חלבונים בממברנה פלזמה מתויגים-EGFP באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם תמונת k-Space

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

easy-measurement-diffusion-coefficients-egfp-tagged-plasma-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Views.  Aarhus University.  מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד למתאם טכניקת ניתוח תנודות k-Space תמונת ספקטרוסקופיה (kICS) למדידת מקדמי דיפוזיה של כותרתו fluorescently חלבוני קרום פלזמה בתאי יונקים חיים. 

Video: Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) of macromolecules, and can be applied to both in vitro and in vivo biological systems. Multi-fluorescence recovery after photobleaching is performed by photobleaching a region of interest within a fluorescent sample using an intense laser flash, then attenuating the beam and monitoring the fluorescence as still-fluorescent molecules from outside the region of interest diffuse in to replace the photobleached molecules. We will begin our demonstration by aligning the laser beam through the Pockels Cell (laser modulator) and along the optical path through the laser scan box and objective lens to the sample. For simplicity, we will use a sample of aqueous fluorescent dye. We will then determine the proper experimental parameters for our sample including, monitor and bleaching powers, bleach duration, bin widths (for photon counting), and fluorescence recovery time. Next, we will describe the procedure for taking recovery curves, a process that can be largely automated via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) for enhanced throughput. Finally, the diffusion coefficient is determined by fitting the recovery data to the appropriate mathematical model using a least-squares fitting algorithm, readily programmable using software such as MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

In this article we will describe the procedure for measuring diffusion coefficients using multi-photon fluorescence recovery after photobleaching. We will begin by aligning the laser along the optical path to the sample and determining the proper experimental parameters, then continue generating and finally fitting fluorescence recovery curves.

מדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות שחזור שני הפוטונים Fluorescence לאחר photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

מיפוי דיפוזיה מולקולרית בקרום פלזמה ידי מרובות יעד Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and product development. Stress-strain relationships are typically obtained from mechanical testing data to enable comparative assessment among samples and in some cases identification of constitutive mechanical properties. However, errors may be introduced through the use of average strain measures, as significant heterogeneity in the strain field may result from geometrical non-uniformity of the sample and stress concentrations induced by mounting/gripping of soft tissues within the test system. When strain field heterogeneity is significant, accurate assessment of the sample mechanical response requires measurement of local strains. This study demonstrates a novel biomechanical testing protocol for calculating local surface strains using a mechanical testing device coupled with a high resolution camera and a digital image correlation technique. A series of sample surface images are acquired and then analyzed to quantify the local surface strain of a vascular tissue specimen subjected to ramped uniaxial loading. This approach can improve accuracy in experimental vascular biomechanics and has potential for broader use among other native soft tissues, engineered soft tissues, and soft hydrogel/polymeric materials. In the video, we demonstrate how to set up the system components and perform a complete experiment on native vascular tissue.

We describe the use of digital image correlation to characterize the local surface strain field on vascular tissue samples subjected to uniaxial tensile testing. These measurements facilitate precise quantification of the sample mechanical response and the generation of constitutive stress-strain relations.

באמצעות מתאם תמונה דיגיטלי לאפיין זנים מקומיים בדגימות רקמת כלי דם

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...