שיטה זו יכולה לעזור להבין שאלות מפתח בשדה האינטראקציה בין תא לתא, כגון אילו קולטנים מתווים הידבקות או זיהוי באנשי קשר מתא לתא והאם ליגנדים ספציפיים מפעילים את האינטראקציות שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחקור אינטראקציות כאלה ישירות בתאים חיים ללא צורך בקיבוע תאים או הפרעה. למרות שיטה זו משמשת כדי לחקור אינטראקציות בין תאים מתורבתים, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות mono-קרום ורייקים או אפילו אורגניזמים מודל קטן.
בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו צריכים לבדוק כי המדגם שלהם הוא יציב מספיק כדי לאפשר רכישה על פני כמה דקות על ידי בדיקה זהירה של תנועת התא וריאציות אות איטי. ראשית, לזרוע את המספר המתאים של תאים לפחות ארבע בארות של צלחת שש בארות ביום לפני transfection. תרבו את התאים ב 37 מעלות צלזיוס 5%פחמן דו חמצני ב- DMEM בינוני בתוספת 10% FBS ו 1%L-גלוטמין.
כדי לבצע ניסוי בסיסי לבצע פלסמידים transfect עבור החלבון של עניין התמזגו חלבון פלואורסצנטי ירוק או צהוב חלבון פלואורסצנטי אדום בארות נפרדות. לאחר ארבע שעות להסיר את מדיום הצמיחה ולשטוף כל גם בעדינות עם מיליליטר אחד של PBS בתוספת מגנזיום וסידן הטלת PBS על הקצה היטב כדי למנוע ניתוק של התאים במהלך הכביסה. לאחר מכן הסר את ה- PBS.
הוסף כ 50 microliters של פתרון EDTA טיפה חכם לכל באר כדי להקל על ניתוק של התאים. לאחר הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות, לאט לנער את הצלחת שש בארות באופן מאוחר כדי לנתק את התאים. לאחר מכן, להוסיף 950 microliters של צמיחה בינוני לכל באר resuspend התאים על ידי pipetting כמה פעמים למעלה ולמטה ובכך לנתק את כל התאים מלמטה היטב.
ודא שהתאים יתווספו מחדש כראוי וינותקו זה מזה על-ידי בדיקה חזותית של היעדר צבירות תאים גדולות לאחר ההתכוונות מחדש. העבר את פתרון התא של באר אחת ל הבאר המתאימה. מערבבים בעדינות על ידי צינורות כמה פעמים למעלה ולמטה.
ואז לזרוע את התאים המעורבים על צלחת תחתונה זכוכית 35 מילימטר ותרבות התאים זרעים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני ליום אחד. בתוכנת מיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר להגדיר את הנתיב האופטי. כדי להימנע מצלב ספקטרלי, בחרו שתי רצועות נפרדות כדי לרגש ולזהות mEGFP או mEYFP ו-mCherry או mCardinal ברצף ובחרו 'החלף רצועות בכל קו'.
לצורך הזיהוי השתמש במסננים המתאימים עבור שני הערוצים. מניחים את המנה המכילה את התאים המעורבים על מחזיק הדגימה. לאחר המתנה של 10 דקות כדי להבטיח שיווי משקל טמפרטורה ולהפחית את סחף המיקוד, התמקד בתאים באמצעות אור השידור בתפריט איתור.
חפש זוג תאים אדומים וירוקים במגע זה עם זה. לאחר מכן, בחר נתיב סריקה בניצב ליצירת קשר בין תא לתא באמצעות לחצן חתוך. הגדל כדי להשיג גודל פיקסל של 50 עד 200 ננומטר ובחר קו במצב סריקה.
הגדר את גודל המסגרת ל- 128 בפיקסל אחד. הגדר את מהירות הסריקה לערך המרבי המותר. לאחר מכן הגדר מחזורים ל- 100, 000 עד 500, 000.
לאחר מכן, בחר את כוחות הלייזר המתאימים. הגדר את הגלאים למצב ספירת פוטון. לחץ על התחל ניסוי כדי להתחיל את הרכישה.
יצא את קובצי הנתונים הגולמיים לתדמית RGB TIF בתבנית נתונים גולמית. קובץ זה יכיל קימוגרף עם נתוני הערוץ הירוק והדדום בערוץ המונשם G ו- R של התמונה, בהתאמה. לאחר מכן, יבא את קובץ ה- TIF עם תוכנת הניתוח המתאימה והמשך לבצע את הניתוח.
ישר את הקווים על-ידי ביצוע ממוצע זמן מבחינת מקטע עם בלוקים של 500 עד 1000 שורות. קבע את מיקום הממברנה בכל בלוק. לאחר מכן הסט את כל הבלוקים לאותה תנוחה משנית.
סכם את כל הקווים המיושרים לאורך ציר הזמן והתאים לפרופיל העוצמה הממוצע באמצעות פונקציה גאוסיאנית. הגדר את הפיקסלים המתאימים לממברנה כפיקסלים בתוך פלוס או מינוס 2.5 סיגמא של מיקום הממברנה, וסכם את עוצמת הפיקסלים האלה בכל שורה כדי לקבל ערך אות פלואורסצנטי יחיד עבור כל נקודת זמן. אם נצפתה הלבנת תמונות, החל תיקון הלבנה על-ידי התאמת סדרת זמן פלואורסצנטיות הממברנה עם פונקציה מעריכית כפולה והחלת נוסחת התיקון המתאימה.
חשב את פונקציות המתאם האוטומטי וההצלבה בהתאם למשוואות המתאימות. כדי לשפר את מהימנות הניתוח ולהימנע ממצאים לבצע את החישובים עבור 10 עד 20 מקטעים שווים של המדידה הכוללת. בדוק את סדרות הזמן והמתאם של הפלואורסצנטיות בכל מקטע והסר מקטעים מעוותים בבירור.
לבסוף, ממוצע כל המקטעים שאינם מעוותים. בעת ניתוח הנתונים שלך, בדוק בזהירות את עוצמת סדרות הזמן ואת פונקציות המתאם מכל מקטע כדי למנוע עיוותים, למשל, עקב ורירית תאית בפריפריה של הממברנה. תמונה עוצמתית של תאי HEK 293T המבטאים את מיריסטילציה-פלמיוליט-mEYFP או mCardinal מוצגת כאן.
מתאם צולב יחסי קרוב לאפס נצפה בעוד פונקציות התיקון האוטומטי מראות זמני ריקבון אופייניים של 10 עד 20 אלפיות השניה עבור דיפוזיה של מיריסטילציה-palmitoylated-mEYFP ו mCardinal בממברנה פלזמה. הפונקציות חוצות המתאם של מדידות sFCCS של תאי HEK 293T המבטאים הטרודימר מעוגן קרום מיריסטוליטציה-palmitoylated-mCardinal-mEYFP היו משרעת חיובית והראה זמני ריקבון דומים כמו פונקציית תיקון אוטומטי. מדידות sFCCS באנשי קשר בין תא לתא בין תאי APLP1-mEYFP ו- APLP1-mCardinal-ביטוי הביאו למתאם חיובי יחסית של 0.45.
פונקציות המתאם sFCCS שהתקבלו ממדידות על פני אשכולות APLP1 באנשי קשר תא-תא הראו דינמיקה מופחתת מאוד כפי שניכר פעמים ריקבון גדולות בתנודות בזמני השהיה גדולים. בתוספת יון אבץ, המתאם הנגדי היחסי עלה לערך ממוצע של 0.8. בהמשך הבהירות המולקולרית גדלה באופן משמעותי מאוליגודרים קטנים למולטימרים גדולים יותר המורכבים מ-10 עד 50 מונומרים בכל תא.
אי-יציבות ארעית עלולה לגרום לפונקציה חוצת-מתאם עם ערכים שליליים או מתאם חיובי כוזב גבוה. פונקציות המתאם המתאימות בדרך כלל חורגות מאוד מאלה של רוב המקטעים. כגישה משלימה למספר מתאם צולב של sFCCS ובהירות ניתן להשתמש כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון.
בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור כי ערבוב של תאים מנוקטים הוא צעד קריטי. מערבבים בעדינות את התאים ומייעלים את יעילות ההמרה כדי להגדיל את הסיכוי למצוא תאים אדומים וירוקים במגע. לאחר התפתחותה נעשה שימוש בטכניקה זו על ידי חוקרים בתחום האימונולוגיה כדי לחקור את האינטראקציות של מולקולות איתות בסינאפסות אימונולוגיות.
