עבודה זו מומנה על ידי NIH מענקי DA15169 וDA035224 לHEM

כל הטיפול בבעלי החיים וקצירת רקמה בוצע בהתאם להנחיות של אוניברסיטת ועדת שימוש בבעלי חיים מוסדי טיפול בית הספר לרפואה של מסצ&#39;וסטס (IACUC), בעקבות # פרוטוקול A1506 אישר (Melikian, PI). פתרונות נדרשים נוזל השדרתי מלאכותי (ACSF) - הפוך טרי מדי יום 125 mM NaCl, 2.5 מ&quot;מ KCl, 1.2 מ&quot;מ אא 2 PO 4, 1.2 מ&quot;מ MgCl 2, 2.4 מ&quot;מ CaCl 2, 26 מ&quot;מ NaHCO 3, ו11 מ&quot;מ גלוקוז הערה: הכן ACSF כפתרון מניות 10x, למעט NaHCO 3 וגלוקוז. הפוך את הפתרונות עובדים 1x יומי מהמניות 10x, להשלים עם גלוקוז NaHCO 3 וטרי. ACSF-תוספת סוכרוז (SACSF) - הפוך טרי מדי יום 250 suc מ&quot;מעלה, 2.5 מ&quot;מ KCl, 1.2 מ&quot;מ אא 2 PO 4, 1.2 מ&quot;מ MgCl 2, 2.4 מ&quot;מ CaCl 2, 26 מ&quot;מ NaHCO 3, ו11 גלוקוז מ&quot;מ הערה: הכן SACSF כפתרון מניות 10x, למעט NaHCO 3 וגלוקוז. הפוך את הפתרונות עובדים 1x יומי מהמניות 10x, להשלים עם גלוקוז NaHCO 3 וטרי. Sulfo-N-hydroxysuccinyl-SS-ביוטין (sulfo-NHS-SS-ביוטין, פירס כימיקלים) פתרונות מניות צריכים להיות 200 מ&quot;ג / מיליליטר בDMSO והם עמידים להקפאה / הפשרה מחזורים מרובים. Aliquots מאוחסנים ב -20 ° C. אסתר succinyl היא הידרוליזה במהירות בתמיסה מימית, ולכן צריכים להיות מוכנים פתרונות לעבוד מייד לפני הגשת בקשה לפרוסות. פורסים להרוות פתרון ACSF בתוספת גליצין 100 מ&quot;מ ריפה תמוגה Buffer 10 מ&quot;מ טריס, 7.4 pH, 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA, 1% Triton-X-100, 0.1% SDS, 1% deoxycholate Na ריפה עם מעכבי פרוטאז (ריפה / PI) - הפוך טרי מדי יום ריפה בתוספת leupeptin 1 מיקרומטר, pepstatin 1 מיקרומטר, aprotinin 1 מיקרומטר, ופלואוריד sulfonyl 1 מ&quot;מ phenylmethyl. 1. הכן את פרוסות המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך SACSF 1x הטרי ו1x ACSF </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל SACSF על קרח בכוס קטנה. זה ישמש כדי להחזיק את מוח עכבר שזה עתה נקטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את ACSF וSACSF עם חמצן על ידי מבעבע עם O 95% / 5% 2/2 CO, 20 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להשתמש P30-38 עכברים לכדאיות רקמות אופטימליות. להקריב בעלי חיים על ידי נקע בצוואר הרחם ועריפת ראש, ומהירות להסיר את המוח לSACSF prechilled, מחומצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות microtome רוטט, להפוך 300 חלקים במוח מיקרומטר באזור של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, פרוסות יכולות להיות גזורים נוספות לפני ההתאוששות להעשיר לאזורים מסוימים במוח או זכות נפרדת וההמיספרות עזבו לשימוש כבקרה ופרוסות ניסיוניות, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר אש מלוטשת, להעביר פרוסות לרשת תחתית-תאים להגדיר ל24 גם צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר פרוסות להתאושש במשך 40 דקות, ביום 31 במעלות צלזיוס בACSF מחומץ, עם בעבוע מתמיד, עדין. </li></ol> 2. טיפול תרופתי (במידת צורך) ופורסים Biotinylation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התאוששות, לשטוף פרוסות 3x בprewarmed (37 מעלות צלזיוס), מבעבע ACSF מחומצן עם 95% / 5% O 2 / CO 2 כל הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת תרכובות מבחן ודגירה עם חמצון מתמשך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוחיותכם, להוסיף 1/10 ה נפח של 10x תרופה מרוכזת, ומערבבים בעדינות על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake צלחות בעדינות באמבט מים בטמפרטורה הרצויה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול תרופתי שלאחר מכן, במהירותפרוסות צינה על ידי שטיפת 3x בACSF הקר כקרח. </li></ol> 3. משטח חלבונים Biotinylate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1.0 מ&quot;ג / מיליליטר sulfo-NHS-SS-ביוטין בACSF הקר קרח מייד לפני התיוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.75 מיליליטר sulfo-NHS-SS-ביוטין לפרוסות ודגירת פרוסות על קרח, 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פרוסות שלוש פעמים במהירות עם ACSF הקר כקרח, ואז דגירה של 10 דקות בACSF קר כקרח על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פרוסות שלוש פעמים עם חיץ להרוות הפרוסה קר כקרח ודגירה עם 0.75 מיליליטר חיץ להרוות פרוס שתי פעמים, 25 דקות, על קרח כדי להרוות sulfo-NHS-SS-ביוטין בחינם. </li></ol> 4. הכן Lysates רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פרוסות שלוש פעמים בACSF קר כקרח ולהעביר כל פרוסה לצינור microcentrifuge באמצעות פיפטה פסטר אש מלוטשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות גלולה פרוסה ידי צנטריפוגה XG 200, 1 דקות וACSF זהירות לשאוב הנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 400 ריפה / PI הקרח קר μl ולשבור את הרקמה על ידי pipetting למעלה ולמטה פעם דרך פיפס P200ette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה ניתקה פרוסה / ריפה לצינור טרי ודגירת 30 דקות, 4 ° C, מסתובבת, כדי להשלים תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה פסולת הסלולר על ידי צנטריפוגה, 18,000 XG, 15 דקות, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוזי חלבון lysate באמצעות assay חלבון BCA, עם אלבומין בסרום שור (BSA) כסטנדרט. </li></ol> 5. לבודד חלבונים Biotinylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל ביד / סך הכל יחס חלבון. הערה: רמות ביטוי חלבון בודדות יכולות להשתנות במידה רבה על פני אזורים שונים במוח. אלא אם כן כל חלבון biotinylated בכמות נתונה של lysate הרקמה הוא נתפס, לא ניתן לזהות במדויק כל שינויים אפשריים בביטוי על פני השטח. לכן, קיים הכרח לקבוע באופן אמפירי את החרוז / סך הכל יחס חלבון האופטימלי לאזור חלבון / מוח בפרט לפני היציאה על מחקר biotinylation פרוסה חדש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 25 חרוזים agarose streptavidin μl עם כמות הולכת וגדלהים של lysate רקמות (מיקרוגרם 25-200 הטווח משוער), ולאחר מכן להמשיך כמתואר בהמשך לכריכה, שלבי כביסה וelution. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את להקות immunoreactive וכתוצאה מכך ולבחור יחס חרוז / lysate בטווח ליניארי של מחייב שיאפשר כימות מדויק של או להגדיל או להקטין את הביטוי פני חלבון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חרוזים streptavidin-Agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע חרוז כולל דרוש לכל דגימות נפח. הכן מספיק חרוז נפח לסכום זה ועוד אחד (כלומר 4 דגימות נוספות ב25 μl / מדגם = 100 חרוזים μl = 125 חרוזים μl נוספים + אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ורטקס מניות חרוזים Streptavidin ו פיפטה את הנפח רצוי. אם באמצעות פיפטה P200, לחתוך את הקצה של הקצה כדי למנוע נזק חסימה או חרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים 3 פעמים ב0.5-1.0 מיליליטר ריפה / PI כדי להסיר חומרים משמרים, vortexing לאחר כל הוספת ריפה וחרוזים איסוף בין שוטף על ידי צנטריפוגה 18,000 XG, 1 דקות, ברוח חדרשבמקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את החיץ בין שוטף באמצעות פיפטה פסטר זכוכית שמחוברת לבקבוק ריק. טיפ P200 פלסטיק מצורף בסוף של הזכוכית פיפטה פסטר מספק שליטה עדינה יותר כאשר נשיפה. אין זה הכרחי כדי להסיר לחלוטין את כל המאגר לשתי שטיפות הראשונות, כפי שהוא מסתכן בחרוזי נשיפה לתוך פיפטה. לאחר לשטוף הסופי, להסיר כמה שיותר עודפי חיץ ככל האפשר בלי נשיפת חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת ריפה / PI להביא חרוזים חזרה לנפח המקורי שלהם, pipetting למעלה ולמטה כדי resuspend. הימנע vortexing בשלב זה, כפי שחרוזים יהיו להיצמד לקיר הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים aliquot לתוך צינורות microcentrifuge באמצעות P200 עם הקצה החתוך. פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים בין הדגימה כדי להבטיח חרוזים להישאר באופן שווה על תנאי ופורד בין הצינורות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבוני biotinylated להיקשר streptavidin חרוזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ lysates תא לצינורות המכילים חרוזים agarose. עבור ניסויים whe<html> מחדש דגימות מרובות עוברות בהשוואה, הקפד להשתמש באותה הכמות של חלבון עבור כל דגימה להשוואות מדויקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת ריפה / PI נוסף כדי להביא לדגימות לנפח מינימאלי μl 200. זה מבטיח כי דגימות תהיה לערבב כראוי במהלך הדגירה וגם מאחדת את ריכוזי חלבון על פני דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צינורות במסובבים צינור ומערבבים לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינורות נפרדים, לוותר מקביל של סך lysate משמש עבור כל נפח דגימה. לחלופין, אם כרכי המדגם הם גבוהים, כל חלק בסך הכל lysate נפח יכול להיות שמורות במקום, כדי להתאים כרכי עומס מקסימאלי על ג&#39;לי-SDS. אלה ישמשו כדי לנרמל את הביטוי על פני השטח לסך כמות החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה או נפח שווה של 2x או 1/5 בנפח של חיץ מדגם SDS-PAGE 6x וגם דגירה על 4 מעלות צלזיוס, במקביל לדגימות חרוז, או בחנות ב-20 ° C עד דגימות מנותחות. </li></ol></li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Elute ולנתח דגימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה החרוזים על ידי צנטריפוגה 18,000 XG, 2 דקות, בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים לשאוב supernatant ולשטוף שלוש פעמים עם 0.75 מיליליטר ריפה. כדי להקטין את איבוד חרוז, להשאיר את הראש נפח קטן של חיץ מעל חרוזים בין שוטף. לאחר לשטוף הסופי, להסיר כמה שיותר ריפה ככל האפשר, מבלי לשבש את גלולה חרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute חלבוני biotinylated מחרוזי streptavidin על ידי הפחתת הצמדת דיסולפיד. הוסף 25 μl 2x-SDS צמצום חיץ מדגם, מערבולת היטב ולסובב את דגימות 30 דקות, בטמפרטורת חדר. שים לב: יש לי חלבוני קרום רבים יש נטייה גבוהה לצבירה כאשר מבושל בחיץ מדגם SDS-PAGE, קשה לפגוע ניידות electrophoretic שלהם. אם זה במקרה של החלבון הנחקר, להימנע מחימום דגימות, ובמקום זאת, elute לאט בטמפרטורת חדר. אם רותח הוא הכרחי (למשל, אם חלבון אחר העריך במקביל דורש רתיחה), samplחיץ דואר ניתן בתוספת 2 M אוריאה (ריכוז סופי) כדי למזער את הצבירה. אמנם יעיל בהפחתת הצטברות בחלק ממקרים, אוריאה לעתים קרובות פשרות הופעות להקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות על ידי immunoblot. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר כוללת דגימות lysate ולסובב במקביל לדגימות חרוז, 30 דקות, בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבונים נפרדים על ג&#39;לי-SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי חלבון (ים) של עניין על ידי immunoblotting. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הייה בטוח כי להקות מזוהות בטווח ליניארי של זיהוי לכימות נכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח שמגיב biotinylation לא קבל גישה לחלבונים תאיים באמצעות תאים פגועים / בסכנה. המטרה זו מושגת על ידי מיטב immunoblotting במקביל לחלבון תאיים ספציפי לסוג התא הנחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת צפיפויות להקה ולחשב צפיפות פני חלבון יחסית כאחוז מרמת ביטוי חלבון בסך הכל. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Conner, S. D., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+portals+of+entry+into+the+cell.">Regulated portals of entry into the cell.</a> Nature. 422, 37-44 (2003).</li><li>Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway.">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li><li>Leto, D., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+transport+by+insulin:+traffic+control+of+GLUT4.">Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).</li><li>Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+membrane+trafficking+defects+of+disease-associated+dynamin+2+mutations.">Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations.</a> Traffic. 12, 1620-1633 (2011).</li><li>Li, X., DiFiglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recycling+endosome+and+its+role+in+neurological+disorders.">The recycling endosome and its role in neurological disorders.</a> Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).</li><li>Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-independent+endocytosis:+mechanisms+and+function.">Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).</li><li>Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+unplugged:+multiple+ways+to+enter+the+cell.">Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell.</a> Cell Res. 20, 256-275 (2010).</li><li>Barry, M. F., Ziff, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+trafficking+and+the+plasticity+of+excitatory+synapses.">Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).</li><li>Bredt, D. S., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+trafficking+at+excitatory+synapses.">AMPA receptor trafficking at excitatory synapses.</a> Neuron. 40, 361-379 (2003).</li><li>Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+synapses+and+the+emergence+of+a+postsynaptic+mechanism+for+LTP.">Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).</li><li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity.">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).</li><li>Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+cocaine-induced+potentiation+of+synaptic+strength+in+the+ventral+tegmental+area:+electrophysiological+and+behavioral+correlates+in+individual+rats.">Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats.</a> J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).</li><li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine-induced+potentiation+of+synaptic+strength+in+dopamine+neurons:+Behavioral+correlates+in+GluRA(-/-)+mice.">Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice.</a> PNAS. 101, 14282-14287 (2004).</li><li>Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+mechanisms+of+addiction:+the+role+of+reward-related+learning+and+memory.">Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).</li><li>Thomas, M. J., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+in+the+mesolimbic+dopamine+system.">Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).</li><li>Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+and+protein+kinase+C-induced+internalization+of+the+dopamine+transporter+is+mediated+by+a+clathrin-dependent+mechanism.">Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism.</a> Traffic. 6, 157-170 (2005).</li><li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical,+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization.">Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li><li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines.">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li><li>Melikian, H. E., Buckley, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+trafficking+regulates+the+activity+of+the+human+dopamine+transporter.">Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter.</a> J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).</li><li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+trafficking+of+the+human+dopamine+transporter.+Clathrin-mediated+internalization+and+lysosomal+degradation+in+response+to+phorbol+esters.">Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters.</a> J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).</li><li>Sorkina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+screen+reveals+an+essential+role+of+Nedd4-2+in+dopamine+transporter+ubiquitination+and+endocytosis.">RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis.</a> J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).</li><li>Eriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+dopamine+transporter+trafficking+in+live+neurons+by+use+of+fluorescent+cocaine+analogs.">Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs.</a> J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).</li><li>Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+subcellular+distribution+of+endosomal+compartments+and+the+dopamine+transporter+in+dopaminergic+neurons.">Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons.</a> Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).</li></ol>

יש המחברים אין אינטרסים כלכליים סכסוך שעם העבודה הזאת.

למרות ידע רב שנים שסחר endocytic ביקורתי איתות הסינפטי משפיע במוח, זה הוכיח מאתגר למדוד כמותית שינויים בביטוי פני חלבון בתאי עצב בוגרים. בעבודה זו, אנו מדווחים גישה אמינה לתייג חלבון משטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות. יש הכנות פרוסה מוח בעל היסטוריה ארוכה של שירות עבו?...

סחר endocytic הוא מנגנון סלולארי בכל מקום שמכוונן מצגת קרום הפלזמה של מגוון רחב של חלבוני קרום נפרד. אנדוציטוזה מספקת חומרים מזינים חיוניים לסביבה תאית 1 וdesensitizes איתות קולטן בתגובה לקולטן הפעלה 2. Endocytic מחזור חזרה לקרום הפלזמה יכולה בנוסף לשפר את האיתות תאית על ידי הגדלת רמות ביטוי חלבון על פני תא 3. יתר על כן, הפרעות סחר קרום הם מעורבים במספר רב של מחלות ומצבים פתולוגיים 4,5, והדגישו את הצורך לחקור את המנגנונים המולקולריים השולטים בסחר endocytic חלבון. בעוד חלבונים רבים לנצל מנגנונים קלאסיים clathrin תלוי הפנמה, הרכבה ראיות בשנים האחרונות מוכיח כי מנגנוני endocytic clathrin עצמאי מרובים לשלוט בפוטנציאל endocytic של מערך הולך וגדל שלחלבונים 6,7. לכן, הצורך לחקור את מנגנוני endocytic הקלת סחר במערכות רלוונטיות פיסיולוגיות גדל במידה ניכרת. במוח, סחר endocytic של קולטנים, תעלות יונים ומובילי הנוירוטרנסמיטר יש תפקיד עיקרי בהקמת פלסטיות הסינפטית 8-11 ותגובה לתרופות של התעללות 12-15, סופו של דבר משפיעות על רגישות עצבית ותגובות הסינפטי. עד כה רוב מחקרי סחר עצביים להסתמך על שני מערכות ביטוי Heterologous או נוירונים בתרבית ראשוניים, אף אחד מהם עשוי באופן מהימן משקפים מנגנונים במשחק בנוירונים בוגרים. כאן אנו מדווחים גישה המשתמשת biotinylation פני השטח כדי למדוד באופן כמו רמות חלבון פני השטח בפרוסות מוח חריפות הנגזרות ממכרסמים מבוגרים. שימוש בגישה זו, אנו מציגים נתונים שמראים כי טרנספורטר דופאמין striatal העכבר במהירות מפנים מחדשsponse ל-C phorbol תיווך אסתר החלבון kinase הפעלה (PKC).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">sulfo NHS-SS-biotin</td>
			<td style="width:83px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">21331</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Streptavidin agarose</td>
			<td style="width:83px;">Pierce</td>
			<td>20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Vibrating microtome sectioner</td>
			<td style="width:83px;">Various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Shaking water bath</td>
			<td style="width:83px;">various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Milli-cell mesh-bottomed inserts (8&#181;m pore size)</td>
			<td style="width:83px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">PI8P 012 50</td>
			<td>These can be washed by hand and re-used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons

סחר endocytic מוסדר הוא המנגנון המרכזי המאפשר מגוון רחב של אירועי neuromodulatory, על ידי השליטה באופן דינמי קולט, ערוץ יון, והצגה פני תא טרנספורטר בזמן בקנה מידה דקות. יש מגוון רחב של מנגנונים ששולטים בסחר endocytic של חלבונים בודדים. מחקרים חוקרים את הבסיס המולקולרי של סחר הסתמכו בעיקר על biotinylation פני השטח כדי למדוד באופן כמו שינויים בביטוי פני חלבון קרום בתגובה לגירויים אקסוגניים ומניפולציה גנטית. עם זאת, גישה זו הייתה מוגבלת בעיקר לתאים בתרבית, אשר לא יכול לשקף נאמנה את המנגנונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית במשחק בנוירונים בוגרים. יתר על כן, גישות תאים בתרבית עשויות לזלזל הבדלי אזור ספציפי במנגנוני סחר בנשים. כאן, אנו מתארים את הגישה המרחיבה biotinylation פני תא להכנת פרוסה המוח החריף. אנחנולהוכיח כי שיטה זו מספקת גישה באיכות גבוהה למדידת שינויים מהירים ברמות פני חלבון קרום בנוירונים בוגרים. גישה זו עלולה להיות כלי רחב בתחום הסחר בendocytic העצבית.

טרנספורטר דופאמין העצבי הפנים בתגובה להפעלת PKC בשורות תאי 16-20. למרות דיווחים רבים הוכחת הפסדי משטח DAT-Induced PKC במגוון רחב של שורות תאים ומערכות ביטוי, זה כבר מאתגר כדי לאשר את הממצא הזה בנוירונים דופאמין בתרבית 21-23. אנחנו השתמשנו פרוסות של הסטריאטום עכבר כדי ?...

Watch this Scientific Journal Video about Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons at JoVE.com

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

סחר קרום עצבי דינמי שולט זמינה פלזמה קרום חלבון ומשמעותי עצבית משפיע. נכון להיום, זה כבר מאתגר למדוד סחר endocytic עצבי בנוירונים בוגרים. כאן אנו מתארים שיטה יעילה מאוד, כמוני למדידת שינויים מהירים בביטוי חלבון פני השטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות.

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

brain-slice-biotinylation-an-ex-vivo-approach-to-measure-region

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

12.8K Views.  University of Massachusetts Medical School.  סחר קרום עצבי דינמי שולט זמינה פלזמה קרום חלבון ומשמעותי עצבית משפיע. נכון להיום, זה כבר מאתגר למדוד סחר endocytic עצבי בנוירונים בוגרים. כאן אנו מתארים שיטה יעילה מאוד, כמוני למדידת שינויים מהירים בביטוי חלבון פני השטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות. 

Video: Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

הדמית pHluorin-תויגה הכנסת קולט לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell surface mobility1-7. To study receptor cell surface localization and endocytosis, the technique described here combines the use of fluorescent &#945;-bungarotoxin with cells expressing constructs containing an &#945;-bungarotoxin (Bgt) binding site (BBS). The BBS (WRYYESSLEPYPD) is based on the &#945; subunit of the muscle nicotinic acetylcholine receptor, which binds Bgt with high affinity8,9. Incorporation of the BBS site allows surface localization and measurements of receptor insertion or removal with application of exogenous fluorescent Bgt, as previously described in the tracking of GABAA and metabotropic GABAB receptors2,10. In addition to the BBS site, we inserted a pH-sensitive GFP (pHGFP11) between amino acids 4 and 5 of the mature GABAAR subunit by standard molecular biology and PCR cloning strategies (see Figure 1)12. The BBS is 3&#39; of the pH-sensitive GFP reporter, separated by a 13-amino acid alanine/proline linker. For trafficking studies described in this publication that are based on fixed samples, the pHGFP serves as a reporter of total tagged GABAAR subunit protein levels, allowing normalization of the Bgt labeled receptor population to total receptor population. This minimizes cell to cell Bgt staining signal variability resulting from higher or lower baseline expression of the tagged GABAAR subunits. Furthermore the pHGFP tag enables easy identification of construct expressing cells for live or fixed imaging experiments.

Using an &amp;#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Here we demonstrate the use of fluorescent Alexa dye coupled to &#945;-bungarotoxin to measure GABA A receptor surface localization and endocytosis in hippocampal neurons. Through the use of constructs bearing a short extracellular tag that binds &#945;-bungarotoxin, analysis of plasma membrane protein endocytic trafficking can be achieved.

שימוש בתג אתר איגוד α-bungarotoxin ללמוד GABA קולטן ממברנה לוקליזציה וסחר

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

פורסים אותו חם: אקוטי למבוגרים מוח חיתוך בטמפרטורה פיזיולוגית

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; חוט השדרה מושרה לייזר הפגיעה דגם להערכת מנגנוני axonal הניוון בזמן אמת

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

תמונות בשידור חי של GLUT4 חלבון בבני אדם העכבר נוירונים היפותלמי העיקרי באמצעות מיקרוסקופ Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

גישה חלופית ללמוד העיקרי אירועים הקשורים ניוון מוחיים לשעבר Vivo עכברוש המוח בפרוסות

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

שימוש בקרוב-אינפרא אדום פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה סריקה למדוד חלבון הביטוי במוח מכרסם

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...