We thank Cora H&#252;bner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.

הצהרה אתיקה: כל הפרוצדורות היו בהתאם הדירקטיבה של האיחוד האירופי על השימוש בחיות במחקר אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מקומיים ושימוש הוועדה (Regierungspräsidium Tuebingen, מדינת באדן-וירטמברג, גרמניה) אחראי מאוניברסיטת טובינגן. 1. נוהל הזרקת stereotactic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כלי סטרילי (מספריים, סכין מנתחים, מלחציים, קודח, מחטים, חומר תפר) באמצעות מעקר. מסדרים כלים סטרילי ופתרונות נדרשים אחרים ואספקה ​​ניתוח כגון חילופי גפן סטרילי, חיטוי, בופר פוספט סטרילית (PBS, pH 7.4), ו- H 2 O 2 על וילון ניתוח סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך micropipettes זכוכית זריקות (איור 1 א &#39;, הבלעה) באמצעות נימת תיבה רחבה 3 מ&quot;מ על microelectrode אופקי חולץ על פי הוראות היצרן. הערה: עבור זריקות עמוקות, להתחדד אלקטרודה צריך להיות מספיקזמן להגיע הקואורדינטות ביותר הגחון (כ 5 מ&quot;מ;. קואורדינטות, ראה 1.10). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Premix 1 μl של פתרון וירוס ו -0.2 μl של פתרון ירוק מהיר 0.1% ב PBS סטרילית (הנראות של פתרון טוב יותר ב פיפטה זכוכית). מלאו טפטפות זכוכית עם תערובת של פתרון וירוס וירוק מהר בעזרת פיפטה מיקרוליטר עם טיפ נאה (איור 1 א &#39;, הבלעה). הערה: עבודה עם וקטורים ויראליים הקשורים מוקטורים (rAAV) נחשב בטיחות ביולוגית ברמה 1 (BSL 1) עבודה והוא חייב להתבצע במעבדה 1 BSL. rAAVs ששימשו במחקר זה (תרשים 1C) היו: 1) mPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (סרוטיפ 2/9) 16; 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (סרוטיפ 2/9) 23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (סרוטיפ 2/1) 23 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר באמצעות מכונת הרדמה חיה קטנה (Isoflurane: 3% חמצן לזירוז). הערה: עכברים ששימשו במחקר זה היו 4 -7 שבועות ישנים של הזנים גנוטיפים הבאים: סוג בר C57BL6 / J (ניסוי 2A דמויות 3A-D); GAD67-GFP 24 (ניסוי 2B דמויות 3E-H); Tac2-Cre 25 (ניסוי 2C דמויות 3I-J). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הראש בין האוזניים והעיניים. החל חיטוי (providone-יוד המבוססת) בראש מגולח באמצעות צמר גפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחת עין כדי למנוע התייבשות של עיניים במהלך הרדמה. תת עורי להזריק עכבר עם משכך כאבים (מבוסס-meloxicam, 0.1 מ&quot;ל של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכבר בתוך מסגרת stereotactic (איור 1A) ולשמור הרדמה באמצעות מסכת גז הרדמה (Isoflurane: 2% חמצן לצורך תחזוקה). בדוק עומק ההרדמה באמצעות רפלקס נסיגה איבר לפני שתמשיך. הערה: לשמור על תנאים סטריליים טוב ככל האפשר במהלך ההליך הכירורגי כולו; ללבוש facemask חד פעמי, ללכת כירורגיתwn, וכפפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חתך עור על החלק העליון של הראש באמצעות מספריים. משוך בעדינות את עור לצד באמצעות מלקחיים בוטים, לתקן עם מלחציים לחשוף פני גולגולת, וגולגולת נקיה עם H 2 O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוזרקים מארק על הגולגולת באמצעות חורים סמן וצינורות קידוח קבע טיפ נאה עבור ההמיספרות הן (איור 1B). קואורדינאטות זריקות במחקר זה הם (מ גבחת (מ&quot;מ)): mPFC: קדמית 1.9, לרוחב ± 0.3, הגחון 2.1; MGM / PIN: אחורי 3.0, לרוחב ± 1.8, גחון 3.8; mpITC / BLA: אחורי 1.45, לרוחב ± 3.35, ועל גחון 4.75. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר פיפטה זכוכית מלאה על מסגרת stereotactic מחוברת להתקן הזרקה בלחץ ולהביא פיפטה לעמדת גבחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את קצה פיפטה הזכוכית באמצעות מלקחיים ישר-טיפ נאה. האם זה בעדינות כדי למנוע דור אירוסול של פתרון וירוס. ודא קצה פיפטה פתוח ידי החלת פולסים הלחץ כמה והתבוננות שחול של טיפות Viruהפתרון של. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל קואורדינטות הזרקה הרצויות ולהזריק מחצית תוכן פיפטה (~ 0.5 μl) באמצעות ההגדרות הבאות בהתקן ההזרקה בלחץ: לחץ: 20 psi, אורך הפולס ממוצע: 30 ms, מספר הממוצע של פעימות: 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו פיפטה במקום דקות ~ 1 לפני לאט (1 מ&quot;מ / דקה) חוזרת בה זה. הערה: הפוך פיפטה בטוח אינו חסום לפני חזרה הליך עם פיפטה אותו על אונה אחרת. במקרה של קצה חסום, נקי או לנתק קצה ומצבת פיפטה אפס גבחת שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גולגולת נקיה עם PBS (pH 7.4), להסיר מלחציים, משוכה בעדינות את העור יחד, תפרה את החתך עם תפר כפתור פרט (3 - 4 קשרים). החל החיטוי (providone-יוד המבוססת) באזור הפצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור ההרדמה ואל תשאירו עכבר ללא השגחה עד שהוא ער לחלוטין. שמור יחיד שוכן או לחזור לחברה של בעלי חיים אחרים רק כאשר התאוששו לחלוטין. לאחר ניתוח, ממשיך לעקוב אחר מצב הבריאות, ואת המנהלמשכך כאבים ter במידת הצורך. בצע את ההליכים על פי כללים שהועלו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המקומית. </li></ol> 2. הכנת פרוסות חריפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן ACSF, פתרון חיתוך, כלים (מספריים, סכין מנתחים, מלקחיים, מרית, פיפטה פסטר), וחוסם אגר. הערה: 1 ליטר של נוזל מלאכותי השדרה Cerebro (ACSF) נדרש לכל ניסוי, והוא הוכן על ידי המסת חומרים כימיים H פעמיים מזוקקים 2 O כפי שפורסם בעבר 16,23. פתרון חיתוך הוא הוכן על ידי השלמת 200 מ&quot;ל של ACSF עם 0.87 מ&quot;ל של 2 מניות פתרון M MgSO 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ACSF וחיתוך חמצן פתרון לאורך הניסוי עם 95% O 2, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמוק להרדים העכבר באמצעות מכונת הרדמה חיה קטנה באמצעות isoflurane (3% חמצן). בדוק עומק ההרדמה באמצעות רפלקס נסיגה איבר לפני שתמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף עכבר באמצעות מספריים גדולים ומיד לצנןראש בתמיסת חיתוך קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גולגולת נפתחת בידי חתך קו אמצע אחת מן הזנב מקורי ודחף בעדינות פיסות גולגולת לצדדים באמצעות מלקחיים. במהירות להסיר מוח על ידי הרמתו מתוך הגולגולת בעדינות בעזרת מרית מעוגלת קטנה. חותכי מוח קטן עם אזמל. מניחים המוח בפתרון חיתוך קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת המוזרקים mPFC: לחתוך חלק הקדמי של המוח (המכיל mPFC) באמצעות אזמל ולשים פתרון חיתוך קר כקרח עד חיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון חיתוך עודף עם נייר סינון ודבק בחלק האחורי של המוח לבמה vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור פרוסות האמיגדלה מוטות, מדביק את המוח על לחסום את אגר (4%) לחתוך בזווית 35 מעלות (1D איור, באמצע). עבור פרוסות האמיגדלה העטרה, המוזרקים MGM / PIN ו המוזרקים mPFC, מדביקים את המוח באופן ישיר על הבמה (איור 1D, על ימין ועל שמאל). הוסף בלוק אגר נוסף מאחורי המוח ליציבות בזמן שחתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> placדואר שלב חיתוך קאמרי עם פתרון חיתוך מחומצן קר כקרח שמתוחזק על 4 מעלות צלזיוס באמצעות יחידת קירור. כן פרוסות חריפות של האמיגדלה (320 מיקרומטר) באמצעות סכין ספיר. מניחים פרוסות בתא ממשק המסופק עם ACSF מחומצן ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההכנה של פרוסות האמיגדלה חריפות, מניח את חדר הממשק בתוך waterbath על 36 ° C להתאושש פרוסות עבור 35 - 45 דקות. בהמשך לכך, לחזור לתא ממשק RT. עבור הקלטה מ פרוסות אלה, להמשיך עם שלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תחילת השלב 2.10, לחתוך פרוסות המוזרקות כפי שתואר קודם לכן עבור פרוסות האמיגדלה חריפות (שלבי 2.8 - 2.9). שחזור של פרוסות waterbath אינו נדרש כאן. אופציונלי: כדי להעריך ההזרקה מיקום במהירות, להתבונן פרוסות על סטריאוסקופ מצויד מנורת פלורסנט וערכות מסנן מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן פרוסות המכילות מוזרקים עבור ניתוח פוסט הוק על ידי רבדה אותם בין שני ניירות לסנן submerגינג אותם paraformaldehyde 4% (PFA) ב N / O פתרון PBS. באשר לניתוח מוזרק להמשיך בשלב 4.1. </li></ol> 3. ויזואליזציה גירוי של סיבי Presynaptic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן מיקרוסקופ תיקון עבור הפעלת optogenetic של סיבים ותאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכז את דיודה הרכובה פולטות אור (LED) על מסלול מסירת האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את עוצמת אור LED במישור המוקד האחורי ו במוצא של כל מטרה עם מד כוח בבחירת אורך הגל המתאים של 470 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את עוצמת האור ב mW / 2 מ&quot;מ וליצור עקומת כיול (עוצמת LED (%) לעומת תפוקת האור (mW / מ&quot;מ 2)) לכל מטרה עבור הערכים הנמדדים עבור 470 ננומטר אורך גל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזור פרוסת האמיגדלה חריפה מאולם ממשק המקום בתא הפרוס רכוב על גבי מיקרוסקופ הזקוף מצויד מנורת פלורסנט. תשמור על עצמך כדי למקם את הפרוסה כזו כי slicמשטח דואר פונה כלפי מעלה בתא הממשק גם הוא מופנה כלפי מעלה בחדר ההקלטה. Perfuse פרוסה עם ASCF טריים, מחומצן בשיעור של 1 - 2 מ&quot;ל / דקה בטמפרטורה של כ -31 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים סיבי presynaptic של הפרוסה באמצעות מנורת פלורסנט בשילוב עם מערכות סינון מתאימות עבור חלבון פלואורסצנטי הספציפי לידי ביטוי. השתמש המטרה 5x להשיג סקירה (איור 1E), ואובייקטיבי 60x להערכת צפיפות סיבים בתוך אזור היעד. הערה: GFP ו YFP, להגדיר מסנן השימוש &quot;ירוק&quot; (עירור 472/20, beamsplitter 495, פליטה 490 LP) עבור mCherry להשתמש במסנן להגדיר &quot;אדום&quot; (עירור 560/40, beamsplitter 585, פליטה 630/70) כמפורט בטבלת חומרים / ציוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח או להגביל את הצמצם במסלול אור מיקרוסקופ כפי רצוי עבור הניסוי (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל הקלטה תיקון, למלא פיפטה תיקון עם פתרון פנימי ו הר iבעל אלקטרודה n. החל לחץ חיובי פיפטה את התיקון ולאט לאט להוריד את זה קודם לתוך התמיסה אמבטיה ולאחר מכן תחת שליטה חזותית לתוך הפרוסה באמצעות micromanipulator. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתקרבים נוירון עניינים עם פיפטה את התיקון מהצד ומלמעלה. שחרר לחץ חיובי כאשר פיפטה על פני השטח של התא (גלוי גומה על פני התא) ולקבל &quot;gigaseal&quot; על ידי הפעלת לחץ שלילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל יניקה נוספת כדי לקרוע את קרום תיקון להשיג הקלטה כל תא. בהמשך לכך, לעורר סיבים שכותרתו עם LED המחוברים באמצעות אורך הגל המתאים להפעלת chr (470 ננומטר) בעת הקלטת תגובות חשמל מהתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור גירוי הסינפטי להתחיל עם עוצמת LED נמוכה ולהגדיל עד משרעת הנוכחית הסינפטי הרצויה הוא הגיע. לעורר את LED על ידי הגדרת יציאות דיגיטליות בתוכנת רכישת נתונים לשלוט באורך העיתוי דופק (דוגמאות באיור3). הערה: תוכנות אחרות ו / או המניבה TTL התקנים יכולים לשמש כדי להפעיל LED. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גירוי חזור עם צמצם פתוח או מוגבל (שלב 3.4) במסלול אור מיקרוסקופ כפי רצוי בתא הסמוך רשם ו / או בנוכחות תרופות ספציפיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקלטת, לתקן פרוסות לניתוח פוסט-הוק על ידי הרבדה אותם בין שני ניירות לסנן ו השריית אותם 4% PFA O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח נתונים אלקטרו. הערה: תוכנה מתאימה השתמש כדי להמחיש נתונים לטאטא מוקלטים לכל מחובר גירוי יחיד. כאשר מנתחים השפעת סמים, השתמש רוטינות לגילוי השיא להשיג מהלך הזמן של אפקט התרופה על אמפליטודות הנוכחית הסינפטי עבור כל מטאטא הפרט. לקבוע מתי השפעת התרופה מגיעה למצב יציב. כדי להכין תשובות ממוצעות מייצגות עבור דמויות, להשתמש בתוכנה כדי ממוצע ≥10 מטאטא בודד לכל תנאי ניסוי (cf איור 3B-D, FHפנל ימני, J). הערה: מספר חבילות תוכנות חלופיות יכולות לשמש לניתוח נתונים. </li></ol> ניתוח 4. פוסט-הוק של מוזרקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פרוסות מוזרקות (משלב 2.12) והקלטת אתרים (אם הוא רצוי ההדמיה מחדש, משלב 3.7) שלוש פעמים PBS. הדבר נעשה על ידי החלפת פתרון שוב ושוב עם PBS הטרי על שייקר מסתובב שלוש פעמים במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון אגר-אגר 2% ב PBS, ולתת לו להתקרר ~ 65 מעלות צלזיוס. פרוסות מקום שטוח על החלק התחתון של צלחת פטרי בקוטר קטן 30 מ&quot;מ, להטביע הפרוסות-אגר אגר ולתת לו להתקרר עד מוצק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדביק בלוק אגר עם פרוסה מוטבעת או פרוס לשלב של vibratome ומניח במת חיתוך קאמרי עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כריתה מוטבעת פרוסות עד 70 מיקרומטר עובי. אופציונלי: לאחר resectioning, יכול להיות מוכתם פרוסות, כלומר, עם Neurotrace לחשוף cytoarchitecture (איור 3 א, ג), ו / או במכתים immunofluorescence y עבור YFP או mCherry כדי להגביר את האות מן החלבון היתוך Chr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות הר בשקופיות ו coverslip עם תקשורת גוברת. המוזרקים תמונה, אם תרצה בכך, גם פרוסות תמונה המכיל סיבי בתחומי הקרנה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מיקרוסקופ לייזר סריקה confocal (איור 2 א-ג). </li></ol>

<ol>
	<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse.">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).</li><li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emotion+circuits+in+the+brain.">Emotion circuits in the brain.</a> Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).</li><li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition,+expression,+and+extinction+of+conditioned+fear.">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li><li>Myers, K. M., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fear+extinction.">Mechanisms of fear extinction.</a> Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150 (2007).</li><li>Quirk, G. J., Mueller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+mechanisms+of+extinction+learning+and+retrieval.">Neural mechanisms of extinction learning and retrieval.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72 (2008).</li><li>Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstimulation+reveals+opposing+influences+of+prelimbic+and+infralimbic+cortex+on+the+expression+of+conditioned+fear.">Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear.</a> Learn Mem. 13 (6), 728-733 (2006).</li><li>Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociable+roles+of+prelimbic+and+infralimbic+cortices,+ventral+hippocampus,+and+basolateral+amygdala+in+the+expression+and+extinction+of+conditioned+fear.">Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538 (2011).</li><li>Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+encoding+of+fear+extinction+in+mPFC-amygdala+circuits.">Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1491-1507 (2013).</li><li>Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-Selective+Adjustment+of+Prefrontal-Amygdala+Transmission+during+Fear+Encoding.">Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding.</a> J Neurosci. 34 (47), 15601-15609 (2014).</li><li>Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+dissection+of+optogenetically+activated+mPFC+and+hippocampal+inputs+to+neurons+in+the+basolateral+amygdala:+implications+for+fear+and+emotional+memory.">Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory.</a> Front Behav Neurosci. 8, 64 (2014).</li><li>Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+and+Auditory+Input+to+Intercalated+Neurons+of+the+Amygdala.">Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala.</a> Cell Rep. 10 (9), 1435-1442 (2015).</li><li>Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+in+the+amygdala:+a+cellular+mechanism+of+fear+learning.">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li><li>Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+inhibitory+circuits+and+the+control+of+fear+memory.">Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory.</a> Neuron. 62 (6), 757-771 (2009).</li><li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intercalated+cells+of+the+amygdala.">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li><li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala.">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li><li>Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intercalated+paracapsular+islands+as+a+module+for+integration+of+signals+regulating+anxiety+in+the+amygdala.">The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala.</a> Brain Res. 1476, 211-234 (2012).</li><li>Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala.">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li><li>Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+expression+and+colocalization+with+calretinin,+parvalbumin,+and+somatostatin+in+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse.">Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse.</a> J Comp Neurol. 467 (1), 60-79 (2003).</li><li>Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+marking+and+characterization+of+Tac2-expressing+neurons+in+the+central+and+peripheral+nervous+system.">Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system.</a> Mol Brain. 5, (2012).</li><li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission.">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> J Neurosci. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li><li>Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+modification+of+a+central+amygdala+fear+circuit.">Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit.</a> Nat Neurosci. 16 (3), 332-339 (2013).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li><li>Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLA+to+vHPC+inputs+modulate+anxiety-related+behaviors.">BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors.</a> Neuron. 79 (4), 658-664 (2013).</li><li>Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-specific+suppression+of+GABA+release+from+parvalbumin+interneurons+in+the+basolateral+amygdala+by+dopamine.">Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine.</a> J Neurosci. 32 (42), 14815-14820 (2012).</li><li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel.">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li><li>Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+and+behavioral+profile+of+multiple+glutamatergic+inputs+to+the+nucleus+accumbens.">Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens.</a> Neuron. 76 (4), 790-803 (2012).</li><li>Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity.">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li><li>Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+suppression+of+plasticity+in+amygdala+inputs+from+temporal+association+cortex+by+the+external+capsule.">Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule.</a> J Neurosci. 31 (1), 339-345 (2011).</li><li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364 (2003).</li><li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transduction+efficiency,+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1,+2,+5,+6,+8,+and+9+in+the+mouse+brain.">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), (2013).</li><li>Salegio, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+adeno-associated+viral+vectors+is+serotype-dependent.">Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent.</a> Gene Ther. 20 (3), 348-352 (2013).</li><li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala.">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neurosci. 15, (2014).</li><li>McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transduction+efficiency+of+recombinant+AAV+serotypes+1,+2,+5,+and+8+in+the+rat+nigrostriatal+system.">Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system.</a> J Neurochem. 109 (3), 838-845 (2009).</li><li>Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+channelrhodopsin-2+(ChR2)+expression+can+induce+abnormal+axonal+morphology+and+targeting+in+cerebral+cortex.">Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex.</a> Front Neural Circuits. 7, (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

פרוטוקול זה מתאר שיטה לחקירת vivo לשעבר optogenetic של מעגלים עצביים וקישוריות מקומית שניתן ליישם בקלות על רוב, אם לא כל, setups ההקלטה תיקון- clamp הפרוס זקוף על ידי לאבזר אותם עם ננומטר ~ 470 LED בנמל אור epifluorescence. יתרון עיקרי של גירוי optogenetic של תחזיות axonal בפרוסה הוא שהיא מאפשרת ה...

כלים מדויקים להדמית הפעלה במקבילה של קשרים ספציפיים בין אזורים במוח לבין סוגים מסוימים של נוירונים הם הופכים חשובים יותר בהבנת מדינות תפקוד המוח ומחלות הבריאות הבסיסיות הקישוריות התפקודית. באופן אידיאלי, זה כרוך בחקירה פיזיולוגית של נכסים הסינפטי מדויקים עם אשר זיהו נוירונים לתקשר. זה נכון במיוחד עבור חיבורים בין אזורים במוח שלא ניתן להישמר פרוסה מוחית חריף יחידה. בעבר, זו הושגה בעיקר ניסויים נפרדים. מצד אחד, קליעים נותבים עצביים מוזרקים in vivo הועסק בשילוב עם אור עוקב או ניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים של שותפים טרום postsynaptic. מצד השני, כאשר שטחי סיבים מהאזור מהמוצא נשמרים ונגישים בהכנת הפרוסה, גירוי חשמלי נעשה שימוש כדי להעריך מנגנוני תקשורת סינפטית עם תאים באזור היעד. עם כניסתו של optogenetics, הביטוי הממוקד של-ערוצי קטיון אור המגודרים, כגון Channelrhodopsins (ChRs) התמזג חלבוני ניאון, מאפשר כעת הפעלה של נוירונים מסלולי axonal שלהם, ובמקביל לאפשר להדמיה שלהם פוסט הוק ניתוח אנטומי 1- 4. בגלל CHR להביע אקסונים יכול להיות מגורה גם כאשר ניתק מהורה somata 5, אפשר פרוסות המוח אל: 1) להעריך תשומות מאזורים במוח שלא היו נגישים עם גירוי חשמלי קונבנציונלי, כי שטחי סיבים אינם להפרדה או מסלול ספציפי הוא לא ידוע; 2) באופן חד משמעי לזהות את האזור המוצא לתשומות ספציפיות שהיו הניחו אך באופן חלקי הבינו; ו -3) לחקור את הקישוריות התפקודית בין סוגי תאים מוגדרים, הן מקומי והן בתחזיות ארוך טווח. בגלל מספר יתרונות, מיפוי optogenetic זו של מעגלים פרוסות המוח הפך רחבly בשימוש בשנים האחרונות, וכן מגוון של וקטורים ויראליים עבור ביטוי ChRs fluorescently-tagged זמין מספקי מסחרי. כמה יתרונות מרכזיים של הפעלת optogenetic על גירוי חשמלי קונבנציונלי הם ללא ניזק לרקמות עקב מיקום של אלקטרודות גירוי, ספציפי של גירוי סיבים כי גירוי חשמלי יכול גם לגייס סיבי מעבר או תאים סמוכים אחרים, וכן גירוי מהיר לא פחות ובזמן מדויק. בנוסף, הזרקת stereotactic של וקטורים ויראליים ניתן לכוון בקלות לאזורים ספציפיים במוח 6 וביטוי ספציפי מותנה או תאים מסוג יכול להיות מושגים באמצעות ביטוי Cre שונה ו / או מקדם 7 ספציפיים. הנה, טכניקה זו מיושמת למיפוי של ארוכי טווח ומעגלים מקומיים במערכת הפחד. האמיגדלה היא אזור מפתח לרכישה והבעה של פחד, ואחסון של פחד זכרונות רגשיים 8,9. חוץ הלוך ושובמ האמיגדלה, קליפת המוח הקדם חזיתית המדיאלי (mPFC) ובהיפוקמפוס (HC), מבנים המחוברים באופן הדדי לאמיגדלה, הם מעורבים בהיבטים של הרכישה, איחוד ואחזור של זיכרונות פחד הכחדה 10,11. פעילות מחוזות של mPFC תנוגן תפקיד כפול זה לשלוט פחד גבוה ונמוך מקובעת 12,13. זה יכול בחלקו להיות מתווך על ידי קשרים ישירים מן mPFC לאמיגדלה שצפויה לשלוט פעילות האמיגדלה ופלט. לכן, בשנים האחרונות, מספר מחקרים אשר נכתבו בניסויים פרוסים vivo לשעבר לחקור אינטראקציות הסינפטי בין afferents mPFC ותאי יעד ספציפיים באמיגדלה 14-17. במהלך הלמידה פחד, מידע חושי על גירויים ממוזגים מותנית מגיע האמיגדלה באמצעות תחזיות מאזורים התלמוס ואת קליפת המוח ספציפיים. פלסטיות של תשומות אלה לנוירונים בחלק לרוחב (LA) של basolהאמיגדלה ateral (BLA) היא מנגנון חשוב שבבסיס פחד מיזוג 9,18. ראיות הגדלה עולות כי תהליכי פלסטיק במקביל באמיגדלה כרוכות באלמנטים מעכבים לשלוט זיכרון פחד 19. קבוצת נוירונים מעכבים אשכולות הם תאי המדיאלי GABAergic intercalated paracapsular (mpITCs), אבל הקישוריות והתפקוד המדויקת שלהם מובנת 20-22 חלקית. כאן, מיפוי מעגל optogenetic משמש כדי להעריך קישוריות מביאה ו efferent של תאים אלה והשפיעו על הנוירונים היעד באמיגדלה, הוכחה כי mpITCs לקבל קלט חושי ישיר מתחנות ממסר התלמוס ואת קליפת מוח 23. ביטוי ספציפי של chr ב mpITCs או נוירונים BLA מאפשר מיפוי של אינטראקציות מקומיות, חושף כי mpITCs לעכב, אלא גם מופעלים הדדית, הנוירונים העיקריים BLA, הצבתם מעגלים מעכבות היזון קדימה ומשוב הרומן ששולטים ביעילות פעילות BLA23.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic frame</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>51670</td>
			<td rowspan="2">can be replaced by other stereotactic frame for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steretoxic frame mouse adaptor</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>51625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia mask for mice</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>50264</td>
			<td>no longer available, replaced by item no. 51609M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure injection device, Toohey Spritzer</td>
			<td>Toohey Company, USA</td>
			<td>T25-2-900</td>
			<td>other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Fill glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments, Germany</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine, IsoFlo</td>
			<td>Eickemeyer, Germany</td>
			<td>213261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controler and heating pad</td>
			<td>FHC, USA</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal Micropipette Puller Model P-1000</td>
			<td>Sutter Instruments, USA</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75</td>
			<td>Melag, Germany</td>
			<td>08754200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-9-26973P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)&#160;</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-9-20938M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)&#160;</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-1-20298P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fast green</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>0301.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)</td>
			<td>CP Pharma, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiseptic, Betadine (providone-iodine)</td>
			<td>Purdure Products, USA</td>
			<td>BSOL32</td>
			<td>can be replaced by other disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by other analgesics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen eye ointment</td>
			<td>Bayer, Germany</td>
			<td>0191</td>
			<td>can be replaced by other eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)</td>
			<td>Nouvag, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutranox Suture Needle</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>12050-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>18020-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Recordings, light stimulation, and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td>
			<td>for composition see references #16 and #23</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>internal patch solutions</td>
			<td>for composition see references #16 and #23</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnesiumSulfate Heptahydrate</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>P027.1</td>
			<td>prepare 2M stock solution in purified water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer, Microm HM650V</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>920120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling unit for tissue slicer, CU65</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>770180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire blade</td>
			<td>Delaware Diamond Knives</td>
			<td></td>
			<td>custom order, inquire with company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope, SZX2-RFA16</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492)</td>
			<td>Lumen Dynamics Group, Canada</td>
			<td>2012-12699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch microscope, BX51WI</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp 700B patch amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitdata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PClamp software, Version 10</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to control data acquisition and stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath temperature controler, TC05</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, Germany</td>
			<td>200-100 500 0145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three axis micromanipulator Mini 25</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, Germany</td>
			<td>210-100 000 0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator controller SM7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, Germany</td>
			<td>200-100 900 7311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass capillaries for patch pipettes</td>
			<td>World Precision Instruments, Germany</td>
			<td>GB150F-8P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber&#160;</td>
			<td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td>
			<td>13006--50----ACN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED unit, CoolLED pE</td>
			<td>CoolLED, UK</td>
			<td>244-1400</td>
			<td rowspan="4">CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolLED 100 Dual Adapt</td>
			<td>CoolLED, UK</td>
			<td>pE-ADAPTOR-50E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED unit, USL 70/470</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td>L70-000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual port adapter</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td>inquire with company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set red (excitation)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F49-560</td>
			<td rowspan="3">Filters can be bought as set F46-008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (beamsplitter)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F48-585</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (emission)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F47-630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set green (excitation)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F39-472</td>
			<td rowspan="3">Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (beamsplitter)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F43-495W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (emission)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F76-490</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaserCheck, handheld power meter</td>
			<td>Coherent, USA</td>
			<td><a>1098293</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgorPro Software, Version 6</td>
			<td>Wavemetrics, USA</td>
			<td></td>
			<td rowspan="2">for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuromatic suite of macros for IgorPro</td>
			<td><a href="http://www.neuromatic.thinkrandom.com/">http://www.neuromatic.thinkrandom.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Post hoc analysis of injections and projections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde powder (PFA)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>0335.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N-21479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar-agar for embedding and resectioning</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 x 10 mm petri dishes for embedding</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides, Super Frost</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>61303802</td>
			<td>alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>3000302</td>
			<td>alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vecta Shield mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories, USA</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>alternative mounting media can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation</td>
			<td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td>
			<td>11406--25------N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices

גישות optogenetic נמצאים כעת בשימוש נרחב כדי ללמוד את הפונקציה של אוכלוסיות נוירונים ומעגלים ידי שילוב ביטוי ממוקד של חלבוני אור מופעל והמניפולציה הבאה של פעילות עצבית על ידי אור. Channelrhodopsins (ChRs) הם אור מגודר קטיון ערוצים וכאשר התמזגו חלבון פלואורסצנטי הביטוי שלהם מאפשר להדמית הפעלה בו זמנית של סוגי תאים ספציפיים תחזיות axonal שלהם באזורים המוגדרים של המוח. באמצעות זריקה stereotactic של וקטורים ויראליים, חלבונים היתוך CHR ניתן constitutively או הביע תנאי בתאים ספציפיים של אזור במוח מוגדר, ותחזיות axonal שלהם יכול לאחר מכן להיחקר אנטומית והן מבחינה תפקודית באמצעות לשעבר vivo ההפעלה optogenetic פרוסות המוח. זה הוא בעל חשיבות מיוחדת כאשר מכוונים על מנת להבין את המאפיינים הסינפטי של קשרים שלא ניתן להתמודד עם גישות גירוי קונבנציונליות חשמליות או בזיהוי affe רומןלהשכרה וקישוריות efferent כי הובן היטב בעבר. הנה, כמה דוגמאות להמחיש עד כמה טכניקה זו ניתן ליישם לחקור שאלות אלה כדי הבהרת מעגלים הקשורות פחד באמיגדלה. האמיגדלה היא אזור מפתח לרכישה והבעה של פחד, ואחסון של פחד זכרונות רגשיים. קווים של ראיות רבים מראים כי קליפת מוח הקדם חזיתית המדיאלי (mPFC) משתתפת היבטים שונים של רכישת פחד הכחדה, אבל הקישוריות המדויקת שלה עם האמיגדלה היא רק מתחילה להיות מובנת. ראשית, הוא הראה כיצד vivo לשעבר ההפעלה optogenetic יכול לשמש כדי לחקור היבטים של תקשורת הסינפטי בין afferents mPFC ותאי היעד באמיגדלה basolateral (BLA). יתר על כן, היא המחישה עד כמה vivo לשעבר זו הגישה optogenetic ניתן ליישם כדי להעריך דפוסי קישוריות הרומן באמצעות קבוצת נוירונים GABAergic באמיגדלה, האשכול תא intercalated paracapsular (mpITC), כדוגמה.

חלק זה מציג את זרימת העבודה של vivo לשעבר הגישה optogenetic ותוצאות נציג אסטרטגיות ניסויים שונים כדי לחקור את המאפיינים הפיזיולוגיים של תחזיות ארוכות טווח חושי modulatory כדי BLA ונוירונים mpITC וכן נכסים של קישוריות מקומית בין mpITC ו BLA. <p class="jove_content" fo:keep-togethe...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices at JoVE.com

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח

גישות optogenetic נמצאים בשימוש נרחב כדי לתפעל פעילות עצבית ולהעריך את ההשלכות על תפקוד המוח. הנה, טכניקה מתוארת שעם ביטוי in vivo של המפעיל האופטי Channelrhodopsin, המאפשר ניתוח vivo לשעבר של נכסים הסינפטי של ארוכי טווח ספציפי קשרים עצביים מקומיים מעגלים הקשורות פחד.

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

ex-vivo-optogenetic-dissection-of-fear-circuits-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

15.8K Views.  University of Tuebingen.  גישות optogenetic נמצאים בשימוש נרחב כדי לתפעל פעילות עצבית ולהעריך את ההשלכות על תפקוד המוח. הנה, טכניקה מתוארת שעם ביטוי in vivo של המפעיל האופטי Channelrhodopsin, המאפשר ניתוח vivo לשעבר של נכסים הסינפטי של ארוכי טווח ספציפי קשרים עצביים מקומיים...

Video: Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding diseases, and future therapies hinge on fundamental understandings about how different retinal cells function normally. Gaining such information with biochemical methods has proven difficult because contributions of particular cell types are diminished in the retinal cell milieu. Live retinal imaging can provide a view of numerous biological processes on a subcellular level, thanks to a growing number of genetically encoded fluorescent biosensors. However, this technique has thus far been limited to tadpoles and zebrafish larvae, the outermost retinal layers of isolated retinas, or lower resolution imaging of retinas in live animals. Here we present a method for generating live ex vivo retinal slices from adult zebrafish for live imaging via confocal microscopy. This preparation yields transverse slices with all retinal layers and most cell types visible for performing confocal imaging experiments using perfusion. Transgenic zebrafish expressing fluorescent proteins or biosensors in specific retinal cell types or organelles are used to extract single-cell information from an intact retina. Additionally, retinal slices can be loaded with fluorescent indicator dyes, adding to the method&#39;s versatility. This protocol was developed for imaging Ca2+ within zebrafish cone photoreceptors, but with proper markers it could be adapted to measure Ca2+ or metabolites in M&#252;ller cells, bipolar and horizontal cells, microglia, amacrine cells, or retinal ganglion cells. The retinal pigment epithelium is removed from slices so this method is not suitable for studying that cell type. With practice, it is possible to generate serial slices from one animal for multiple experiments. This adaptable technique provides a powerful tool for answering many questions about retinal cell biology, Ca2+, and energy homeostasis.

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Imaging retinal tissue can provide single-cell information that cannot be gathered from traditional biochemical methods. This protocol describes preparation of retinal slices from zebrafish for confocal imaging. Fluorescent genetically encoded sensors or indicator dyes allow visualization of numerous biological processes in distinct retinal cell types.

הכנת פרוסות דג זברה למבוגרים עבור לשעבר Vivo הדמיה ניסויים ברשתית טריים

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic Entrainment התנודות תטא בהיפוקמפוס ב מתנהג עכברים

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

גישה חלופית ללמוד העיקרי אירועים הקשורים ניוון מוחיים לשעבר Vivo עכברוש המוח בפרוסות

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 (ChR2), is expressed by a virus vector in a particular type of neuronal cells in various Cre-driver mice. Activation of these opsins is triggered by application of light pulses which are delivered by laser or LED through optic cables, and the effect of activation is observed with very high time resolution. Experimenters are able to acutely stimulate neurons while monitoring behavior or another physiological outcome in mice. Optogenetics can enable useful strategies to evaluate function of neuronal circuits in the regulation of sleep/wakefulness states in mice. Here we describe a technique for examining the effect of optogenetic manipulation of neurons with a specific chemical identity during electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) monitoring to evaluate the sleep stage of mice. As an example, we describe manipulation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis (BNST). Acute optogenetic excitation of these neurons triggers a rapid transition to wakefulness when applied during NREM sleep. Optogenetic manipulation along with EEG/EMG recording can be applied to decipher the neuronal circuits that regulate sleep/wakefulness states.

Here, we describe methods of optogenetic manipulation of particular types of neurons during monitoring of sleep/wakefulness states in mice, presenting our recent work on the bed nucleus of the stria terminalis as an example.

מניפולציה אלקטרואופטיקה של מעגלים עצביים בזמן ניטור שינה/ערות מדינות עכברים

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית: