מחקר זה נתמך על ידי מענק R01NS062842 מהמכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ, המכונים לאומיים לבריאות (VVD) ועל ידי מענקי R21 NS064403 מהמכון הלאומיים להפרעות נוירולוגיות ושבץ, המכונים לאומיים לבריאות באמצעות ערה (VVD) וR21 מכון EB006301 הלאומי ביו הדמיה וההנדסה ביוטכנולוגיה, מכון הלאומי לבריאות (VVD).

השיטה מתאימה ל, סעיפי רקמות פרפין מוטבעים קבוע פורמלדהיד. הטכניקה מודגמת כאן ביישום שלה ללטף ניסיוני בחולדה. 1. רכיבי כנות לקראת מערכת tyramide איתותים ההגברה (TSA) למרות השיפור המבוסס על ה-TSA משמש בשלב הסופי של תיוג, נערך לתגובה זו יכולה לקחת שעות יותר מ 1. לכן זה נוח לעשות את ריאגנטים TSA לפני שמתחיל את התיוג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון מניות tyramide fluorophore. השתמש במגיב tyramide fluorophore מסופק בבקבוקונים בודדים עם ערכת תיוג ה-TSA. הוסף 300 DMSO μl לבקבוקון מגיב tyramide. פתרון מניות tyramide Fluorophore הוא יציב במשך לפחות 3 חודשים, כאשר הם מאוחסנים ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך לשטוף חיץ TNT המכיל: 0.1 M טריס-HCl, pH 7.5; 0.15 M NaCl; -20 Tween 0.05%. אם 0.3% נזקקו טריטון X-100 ניתן להחליף לTween-20 0.05%. Alternatively PBS עשוי לשמש כחיץ לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך TNB חסימת מאגר המכיל: 0.1 M טריס-HCl, pH 7.5; 0.15 M NaCl; 0.5% מגיב חסימה (מסופק בערכה). כדי לפזר את החסימה מגיב לחלוטין, להוסיף באיטיות אותו במרווחים קטנים למאגר תוך ערבוב. מחממים את הפתרון הזה בהדרגה ל-C ° 55 עם ערבוב מתמיד. זה יכול לקחת דקות 30-60. הפתרון יופיע חלבי. מביא לטמפרטורת חדר לפני השימוש. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C לשימוש לטווח ארוך. </li></ol> 2. הכנת סעיפים השתמש בשקופיות עם 5 סעיפים מיקרומטר בעובי רכובים לחתוך מרקמות קבועות פורמלין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את החלקים עם קסילן במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם סעיפים כדלקמן: לטבול ב96% 2x EtOH במשך 5 דקות כל אחד; להשרות בEtOH 80% למשך 5 דקות; לשטוף עם 2x מים במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון עובד proteinase K על ידי דילול מניות פתרון proteinase K 50 מיקרוגרם / מיליליטר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת proteinaseK עובד פתרון לחלקים. דגירה 15 דקות ב 23 ° C. היקף הפתרון והזמן של עיכול ייתכן שיצטרכו להיות מותאם בהתאם לגודל של חלקים וסוגי רקמות. לסעיף קטן (מתחת ל -5 מ&quot;מ קוטר) 50 μl של פתרון proteinase יהיה מספיק. סעיף לגודל ממוצע (~ 10 מ&quot;מ קוטר), להוסיף לפתרון proteinase K 100 μl. עבור חלקים גדולים מאוד בנפח של הפתרון וניתן לשנותם. בכל המקרים לטפל כדי למנוע overdigestion סעיפים שמוביל לאובדן מוחלט של אות והורסת את רקמת מורפולוגיה. זה קורה לעתים קרובות, אם זמן דגירה עולה 25 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים ב2x מים מזוקקים במשך 5 דקות כל אחד. מכין את תערובת התיוג המכילה בדיקה פעילה בזמן שחלקים נמצאים במים. </li></ol> 3. מכתים מבוסס TOPO VACC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון הבדיקה הפעיל על ידי שילוב של הפעולות הבאות: מים - 11.75 μl 1 M טריס-HCl, pH 7.4-1.25 μl של oligonucleotide התאבדות הסככה 12 בסיס 100 pmol - 1 μl של oligonucleotide מתאם 100 pmol - 1 μl TOPO VACC 50 pmol - 10 μl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות על ידי pipetting. דגירה בטמפרטורת חדר (23 מעלות צלזיוס) במשך 15 דקות, כדי לאפשר הפעלת חללית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח חלקים מצנצנת לשטוף ולשאוב את המים הנותרים. לאחר מכן להחיל את פתרון הבדיקה הפעיל מוכן בשלב 3.1 (25 μl ל~ סעיף מ&quot;מ 10 x 10). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip סעיפי דגירה במשך 15 דקות ב23 ° C. טובלים שקופיות במים כדי להסיר בעדינות coverslips. לשטוף במי 3x במשך 5 דקות כל אחד. </li></ol> 4. TSA איתותים שיפור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה סעיפי רקמות עם TNB חסימת חיץ שהוכן קודם לכן ודגירת שקופיות בחדר humidified ל30 דקות בטמפרטורת חדר (23 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול 1:100 של conjugates peroxidase streptavidin-החזרת (SA-HRP) בTNB חסימת מאגר. לשאוב TNBחסימת החיץ וליישם פתרון SA-HRP. דגירה שקופיות עם SA-HRP ל30 דקות בטמפרטורת חדר. השתמש נאות מגיב נפח כדי לכסות את קטע הרקמה, לכל סעיף בדרך 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות 3x עבור 5 דקות כל אחד במאגר TNT לשטוף (או PBS) בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול 1:50 של מניית tyramide fluorophore ב1x הגברה ממסה מהערכה. פיפטה הפתרון עובד tyramide fluorophore על כל שקופית. השתמש פתרון עובד מספיק כדי לכסות את קטע הרקמה, לכל סעיף בדרך 100 μl לחלוטין. הפוך פתרון עובד tyramide fluorophore מייד לפני כל תיוג. הפתרון לא ניתן לעשות שימוש חוזר, כך לבטל את כל חלק בשימוש שלו לאחר תיוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות בטמפרטורת חדר במשך 3 עד 10 דקות. לפקח על עליית הקרינה תחת מיקרוסקופ עד הרמזים הראשונים של מבנים שניתן לראות. מהר להמשיך לשטוף את הצעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות 3x עבור 5 דקות כל אחד במאגר TNT לשטוף (או PBS) בזמן t החדרemperature עם תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את פתרון antifading עם DAPI וcoverslip. שים לב תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי להמחיש DAPI וקרינת FITC להשתמש בערכת מסנן להקה עוברת: D490/40 עירור FITC, פליטת 520/10; D360/40 DAPI עירור, פליטת 460/20, או דומה. </li></ol>

<ol>
	<li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>Schilling, M., Besselmann, M., M&#252;ller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia:+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice.">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).</li><li>Faustino, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cells+contribute+to+endogenous+brain+defenses+after+acute+neonatal+focal+stroke.">Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke.</a> J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).</li><li>Thored, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+accumulation+of+microglia+with+proneurogenic+phenotype+concomitant+with+persistent+neurogenesis+in+adult+subventricular+zone+after+stroke.">Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke.</a> Glia. 57 (8), 835-849 (2009).</li><li>Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Janus-faced+microglia:+beneficial+and+detrimental+consequences+of+microglial+phagocytosis.">Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).</li><li>Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+DNA+end-joining+reactions+catalyzed+by+vaccinia+topoisomerase.">Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase.</a> Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK/Cdc42-mediated+microglial+motility+and+gliapse+formation+lead+to+phagocytosis+of+degenerating+dopaminergic+neurons+in+vivo.">ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo.</a> Sci. Rep. . 2, 809 (2012).</li><li>Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+irreparable+ischemic+damage+in+brain+by+selective+labeling+of+double-strand+blunt-ended+DNA+breaks.">Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks.</a> Mol. Med. 8, 818-823 (2002).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

בסרטון הזה אנחנו מדגימים, בפורמט קטע רקמה, איך לתייג phagocytes הפעיל שמוות של תאים ברורים באיסכמיה המוחית המוקדים. הטכניקה המוצגת הינה הגישה הראשונה בי במיוחד תוויות רק אלה תאי פסולת הניהול שפקד את ופעיל לעכל גופות סלולריות. זה עושה את זה יתרון ביחס לשיטות קיימות אחרות ל?...

שבץ איסכמי גורם לשינויים עמוקים ברקמת המוח שנפגעה. הוא יוזם מוות של תאים מסיבי, מה שמוביל להפעלה המהירה של תאי phagocytic תושב ממוצא microglial. הוא גם מגדיר את חדירה של מוח איסכמי על ידי סוגים שונים של phagocytes המקצועי דם נגזרות כוללים נויטרופילים, מקרופאגים, הדנדריטים, ותאי פיטום 1,2. הוא עדיין התלבט אם את התגובה הזאת לפגיעה איסכמית משחקת תפקיד חיובי או שלילי. למרות phagocytosis לאחר שבץ יכול להיות מועיל, כי זה מנקה את תאים מתים ומדכא דלקת, היא גם מייצרת מיני חמצן תגובתי רעילים המשפיעה על הישרדות עצבית ומחריפה את נזק לרקמות 1-5. בעוד מספר סוגים של תאי phagocytic לחדור מוח איסכמי, לא כולם להשתתף בפסולת ניהול על ידי האופפת גופות תא ופינית את הדרך לתהליכי התחדשות 1-3. CR זהeates דרישה לזיהוי סלקטיבי של תאי פסולת ניהול המבצעות סליקת phagocytic של מוות של תאים בשבץ מוחי. כאשר תאי הדמיה פסולת ניהול פעילים כזה, זה גם חשוב כדי לענות על השאלה של מידת יעילותם לבזות את גופות תא אפופות. השפלה היעילה ומלאה של ה-DNA של התא למות בphagocytosis היא חיונית משום שהוא מונע חיסון עצמי ושחרורו של חומר גרעיני פתולוגי 6. כאן אנו מציגים בדיקות חדשות העושות שימוש בהפסקות DNA ספציפיות כסמנים של תאי phagocytic פעילים. הפסקות חתימה אלה מיוצרות באופן בלעדי במהלך הפירוק של גרעינים נבלעו בתוך תאים פונקציונליים פסולת ניהול. לכן הבדיקות באופן סלקטיבי רק את תווית phagocytes כי לבלוע ולעכל באופן פעיל גופות סלולריות. הם גם מאפשרים התבוננות בעוצמה והשלמת פירוק ה-DNA לאחר הבליעה. הבדיקות מועילות בהערכות של אינטנסיביות וefficiency של פינוי phagocytic. הבדיקות חדשות מסתמכות על סמן שאינו מבוסס על חלבון ולכן יכולות להיות יתרון במיוחד במחקרים של שבץ, שבו נזק איסכמי נרחב יכול לשבש את המורפולוגיה תאית או לרוקן סמנים המבוססים על חלבונים, בעיקר בתוך אזור איסכמי הליבה. העיקרון של הטכניקה מוצג באיור 1. איור מציג בדיקות oligonucleotide בצורת סיכת ראש ligated ידי topoisomerase vaccinia האנזים (VACC TOPO) ל5&#39;OH DNA מסתיים נוצר על ידי lysosomal DNase השני במהלך עיכול ה-DNA 7.

<table><tbody><tr><td>Xylene</td><td>JT Baker</td><td>9490-22</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>PBS Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Topoisomerase I</td><td>Vivid Technologies</td><td></td><td>5 pmol/&amp;mu;l stock</td></tr><tr><td>12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AAG GGA CCT GC&lt;strong&gt;B&lt;/strong&gt; GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3&amp;rsquo;; B &amp;ndash; Biotin-dT; 100 pmol/&amp;mu;l stock in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Adapter Oligonucleotide</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TAG AAT CGT ATC-3&amp;rsquo;; 100 pmol/&amp;mu;l stock in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, PH 7.4</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td></td></tr><tr><td>TSA, Fluorescein System&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer&amp;nbsp;</td><td>NEL701A001KT</td><td></td></tr><tr><td>1 M NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td></td><td></td><td>22 x 22 mm or 22 x 40 mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section.</td></tr><tr><td>Rat Brain Sections</td><td></td><td></td><td>Rat brain taken 48 hr after reproduction of ischemic stroke as described in Didenko &lt;em&gt;et al&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;. 5-6 &amp;mu;m-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digital Video camera and software</td><td>Micromax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Metamorph</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessing phagocytic clearance of cell death in experimental stroke by ligatable fluorescent probes

אנו מתארים גישת histochemical חדשה להדמיה של פינוי phagocytic באיסכמיה המוחית המוקדים. הגישה מאפשרת הלימוד של חיסול של תאים מתים בשבץ מוחי על ידי phagocytes פסולת הניהול של כל שושלת סלולרית. למרות מספר רב של תאים ממקורות שונים כי הם מסוגלים phagocytosis נמצאים במוח איסכמי, רק חלק מהם באופן פעיל לבלוע ולעכל את גופות תא. ההדמיה סלקטיבית, כימות והניתוח של פסולת ניהול phagocytic פעיל אלה מסייעים בהערכת תגובת המוח לאיסכמיה. ניקוי יעיל מוות של תאים חשוב להתאוששות מפציעה המוח איסכמי, כפי שהוא פותח את הדרך לתהליכי התחדשות שלאחר מכן. אי לנקות את הגופות יביאו לתגובה רעילה הנגרמת על ידי דנ&quot;א וחלבונים שאינם מושפלים. ההליך המתואר משתמש בבדיקות ניאון ligated אופן סלקטיבי על ידי topoisomerase נגיפי להפסקות DNA אופייניות המיוצרים בכל phagocytes במהלך היבלעותועיכול של תאים שניזוקו באופן בלתי הפיך על ידי איסכמיה. השיטה היא כלי חדש לחקירה של תגובת המוח לפגיעה איסכמית.

העיקרון של השיטה לתיוג phagocytes הפעיל פסולת ניהול מוצג באיור 1. סכמטי מוכיח כי תמורת זיהוי בשלושה שלבים. הצעד הראשון כולל הפעלת בדיקה (איור 1 א); בשלב השני הבדיקה הופעלה גבעול להפסקות DNA ספציפיות בסעיפי רקמות (איור 1 ג); השלב השלישי כולל הגברה אות ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes at JoVE.com

Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes

אנו מציגים טכניקה חדשה לקרינה סלקטיבית בתיוג באתרו של תאי phagocytic פעילים, אשר ברור מעל גופות תא בשבץ מוחי. הגישה היא חשובה להערכת תגובת המוח לאיסכמיה כי רק חלק קטן מphagocytes נוכח במוח איסכמי להשתתף בפינוי של מוות של תאים.

הערכת עמילות phagocytic של מוות של תאים בשבץ ניסויי על ידי בדיקות ניאון Ligatable

We describe a new histochemical approach for visualization of phagocytic clearance in focal brain ischemia. The approach permits the study of elimination ...

assessing-phagocytic-clearance-cell-death-experimental-stroke

Research

JoVE Journal

Medicine

8.1K Views.  Baylor College of Medicine.  אנו מציגים טכניקה חדשה לקרינה סלקטיבית בתיוג באתרו של תאי phagocytic פעילים, אשר ברור מעל גופות תא בשבץ מוחי. הגישה היא חשובה להערכת תגובת המוח לאיסכמיה כי רק חלק קטן מphagocytes נוכח במוח איסכמי להשתתף בפינוי של מוות של תאים. 

Video: Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Immunology and Infection

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

Assay היבלעות: פרוטוקול להעריך אינטראקציות בין מערכת העצבים המרכזית וPhagocytes נוירונים

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Neuroscience

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

משולב האינפרה-אדום הקרוב הדמיה פלורסנט וטומוגרפיה-מחושב מיקרו ישירות חזותי מוחין Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a variety of particles. Normally, BMDMs are restricted from the central nervous system (CNS), but following an injury, they can readily infiltrate. Once within the injured CNS tissue, BMDMs are the primary cell type responsible for the clearance of injury-derived cellular debris, including large quantities of lipid rich myelin debris. The neuropathological ramifications of BMDM infiltration and myelin debris phagocytosis within the CNS are complex and not well understood. The protocols described here, allow for the direct in vitro study of BMDMs in the context of CNS injury. We cover murine BMDM isolation and culture, myelin debris preparation, and assays to assess BMDM myelin debris phagocytosis. These techniques produce robust quantifiable results without the need for significant specialized equipment or materials, yet can be easily customized to meet the needs of researchers.

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

We present methods to assess the phagocytic capacity of primary murine bone marrow-derived macrophages using fluorescently labeled myelin debris and intracellular lipid droplet staining.

במבחנה Phagocytosis של המיאלין פסולת על ידי מקרופאגים הנגזרות מח עצם

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

במבחנה הדמיה כמותית אסאי עבור פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה מתים על ידי iPSC-מקרופאגים

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to study the process of neuronal survival upon cytotoxic stress. Most methods are based on biochemical approaches that do not allow single-cell resolution or involve complex and costly methodologies. Presented here is a versatile, inexpensive, and effective experimental paradigm to study neuronal survival. This method takes advantage of sparse fluorescent labeling of the neurons followed by live imaging and automated quantification. To this aim, the neurons are electroporated to express fluorescent markers and co-cultured with non-electroporated neurons to easily regulate cell density and increase survival. 
Sparse labeling by electroporation allows a simple and robust automated quantification. In addition, fluorescent labeling can be combined with the co-expression of a gene of interest to study specific molecular pathways. Here, we present a model of stroke as a neurotoxic model, namely, the oxygen-glucose deprivation (OGD) assay, which was performed in an affordable and robust homemade hypoxic chamber. Finally, two different workflows are described using IN Cell Analyzer 2200 or the open-source ImageJ for image analysis for semi-automatic data processing. This workflow can be easily adapted to different experimental models of toxicity and scaled up for high-throughput screening. In conclusion, the described protocol provides an approachable, affordable, and effective in vitro model of neurotoxicity, which can be suitable for testing the roles of specific genes and pathways in live imaging and for high-throughput drug screening.

Here, we present a simple, potent, and versatile methodology to investigate neuronal survival upon cytotoxic stress in primary cortical neurons with cellular resolution in real time or in fixed material.

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to ...

<meta charset="utf8"></head><body>צביעה אימונופלואורסצנטית לחקר מוות תאים במודלים של שבץ MCAO של חולדות

Evaluating Cell Death Signaling by Immunofluorescence in a Rat Model of Ischemic Stroke

Stroke is a leading cause of death and disability worldwide. Most cases of stroke are ischemic and result from the occlusion of the middle cerebral artery (MCA). Current pharmacological approaches for the treatment of ischemic stroke are limited; therefore, novel therapies providing effective neuroprotection against ischemic injury following stroke are urgently needed. In the brain tissue following ischemic stroke, the area of the ischemic penumbra is salvageable but at risk of progressing to irreversible damage. The penumbral area surrounding the infarcted core is a conceptual target for neuroprotection. Since the blood flow is partially maintained in the penumbral area, neuronal and non-neuronal cells in this area transiently survive after stroke, and these cells that are still viable may be rescued by appropriate medical interventions. Understanding the pathophysiology of the penumbra is important in the development of neuroprotective therapies because the cell death pathways activated in the ischemic penumbra may indicate therapeutic targets, such as RUNX1 and cathepsins. These protein targets functioning as mediators of programmed cell death can be further exploited in translational research. With moderate size and similarity to the human brain, the in vivo rat model of MCA occlusion (MCAO) mimics the human ischemic stroke and offers an applicable tool to investigate the penumbral pathology, examine the cell death signaling, and evaluate the effects of potential targets in the context of MCAO. Here, we describe how to induce MCAO in rats and how to perform immunofluorescence staining for the detection of cell death signaling in the rat brain following MCAO.

<meta charset="utf8"></head><body>הערכת איתות מוות תאי על ידי אימונופלואורסצנציה במודל חולדה של שבץ איסכמי

Rat in vivo models are indispensable tools to investigate the pathological mechanisms and therapeutic targets for ischemic stroke. This work will describe performing immunofluorescence staining in infarcted brain slices following middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats.

הערכת איתות מוות תאי על ידי אימונופלואורסצנציה במודל חולדה של שבץ איסכמי

Stroke is a leading cause of death and disability worldwide. Most cases of stroke are ischemic and result from the occlusion of the middle cerebral artery ...