Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni R01NS062842 dall&#39;Istituto nazionale dei disordini neurologici e ictus, National Institutes of Health (VVD) e da sovvenzioni R21 NS064403 dall&#39;Istituto nazionale dei disordini neurologici e ictus, National Institutes of Health, attraverso ARRA (VVD) e R21 EB006301 National Institute of Biomedical Imaging e Bioingegneria, National Institutes of Health (VVD).

Il metodo è adatto per paraffina, sezioni di tessuto formaldeide-fisso. La tecnica è illustrata qui nella sua applicazione alla corsa sperimentale nel ratto. 1. Componenti Preparazione per Tyramide Signal Amplification (TSA) Sistema Sebbene il miglioramento basato TSA è utilizzato nella fase finale di etichettatura, preparazione per questa reazione può richiedere più di 1 ora. Pertanto è conveniente fare i reagenti TSA prima di iniziare l&#39;etichettatura. <ol><li> Fai soluzione stock fluoroforo tiramide. Utilizzare il reagente fluoroforo tiramide forniti in fiale individuali con il kit di etichettatura TSA. Aggiungere 300 microlitri DMSO alla fiala reagente tiramide. Fluoroforo tiramide magazzino soluzione è stabile per almeno 3 mesi se conservato a 4 ° C. </li><li> Fai tampone di lavaggio TNT contenente: 0.1 M Tris-HCl, pH 7.5; 0,15 M NaCl; 0,05% Tween-20. Se necessario, 0,3% Triton X-100 può essere sostituito per il Tween-20 0,05%. Alternattivamente PBS può essere utilizzato come tampone di lavaggio. </li><li> Fai TNB tampone bloccante contenente: 0.1 M Tris-HCl, pH 7.5; 0,15 M NaCl; 0,5% reagente di blocco (fornito con il kit). Per dissolvere completamente il reagente bloccante, aggiungere lentamente in piccoli incrementi al buffer agitando. Scaldare questa soluzione gradualmente a 55 ° C con agitazione continua. Questo può richiedere 30-60 min. La soluzione appare lattiginosa. Portare a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. Aliquota e conservare a -20 ° C per l&#39;uso a lungo termine. </li></ol> 2. Preparazione delle sezioni Utilizzare le diapositive montate con 5 sezioni micron di spessore tagliate da tessuti fissati in formalina. <ol><li> Trattare le sezioni con xilene per 15 min. </li><li> Reidratare le sezioni come segue: immergere nel 96% EtOH 2x per 5 minuti ciascuno; immergere nel 80% EtOH per 5 min; lavare con 2x acqua per 5 minuti ciascuno. </li><li> Preparare la soluzione di lavoro proteinasi K diluendo soluzione madre proteinasi K a 50 mg / ml in PBS. </li><li> Aggiungi proteinasiK soluzione di lavoro alle sezioni. Incubare 15 min a 23 ° C. Il volume della soluzione e il tempo di digestione può essere necessario regolare a seconda delle dimensioni delle sezioni e tipi di tessuto. Per una sezione piccola (inferiore a 5 mm di diametro) 50 ml di soluzione di proteinasi sarebbe sufficiente. Sezione per una dimensione media (circa 10 mm di diametro), aggiungere 100 ml di soluzione di proteinasi K. Per molto ampie sezioni il volume della soluzione può essere scalata. In ogni caso aver cura di evitare overdigestion di sezioni che porta alla completa perdita di segnale e distrugge morfologia tissutale. Questo accade spesso se il tempo di incubazione supera i 25 min. </li><li> Lavare le sezioni in 2x acqua distillata per 5 minuti ciascuno. Preparare la miscela di etichettatura contenente sonda attiva mentre le sezioni sono in acqua. </li></ol> 3. Colorazione a base di TOPO VACC <ol><li> Preparare la soluzione della sonda attiva combinando il seguente: Acqua - 11.75 microlitri 1 M Tris-HCl, pH 7,4-1,25 μl 100 pmol di 12-base oligonucleotide sbalzo suicidio - 1 ml 100 pmol dell&#39;adattatore oligonucleotide - 1 ml 50 pmol VACC TOPO - 10 ml </li><li> Mescolare delicatamente pipettando. Incubare a temperatura ambiente (23 ° C) per 15 minuti per consentire l&#39;attivazione della sonda. </li><li> Prendere sezioni dal vaso di lavaggio e aspirare l&#39;acqua residua. Quindi applicare la soluzione sonda attiva preparato al punto 3.1 (25 pl per ~ sezione 10 x 10 mm). </li><li> Coprioggetti sezioni e incubare per 15 min a 23 ° C. Immergere i vetrini in acqua per rimuovere delicatamente lamelle. Lavare in 3x acqua per 5 minuti ciascuno. </li></ol> 4. TSA Valorizzazione di segnale <ol><li> Coprire sezioni di tessuto con TNB tampone bloccante preparato in precedenza e incubare i vetrini in una camera umidificata per 30 minuti a temperatura ambiente (23 ° C). </li><li> Preparare una diluizione 1:100 di coniugati streptavidina-perossidasi di rafano (SA-HRP) in TNB tampone di bloccaggio. Aspirare TNBtampone di bloccaggio e applicare la soluzione SA-HRP. Incubare i vetrini con SA-HRP per 30 min a temperatura ambiente. Utilizzare un adeguato volume di reagente per coprire la sezione di tessuto, generalmente 100 pl per sezione. </li><li> Lavare i vetrini 3x per 5 minuti ciascuno in tampone di lavaggio TNT (o PBS) a temperatura ambiente. </li><li> Preparare una diluizione 1:50 di fluoroforo tiramide magazzino in 1x Amplification diluente dal kit. Pipettare la soluzione di lavoro fluoroforo tiramide su ogni diapositiva. Utilizzare soluzione di lavoro sufficiente a coprire completamente la sezione di tessuto, generalmente 100 microlitri per sezione. Preparare la soluzione di lavoro fluoroforo tiramide immediatamente prima di ogni etichettatura. La soluzione non può essere riutilizzato, in modo da scartare qualsiasi parte inutilizzata di esso dopo l&#39;etichettatura. </li><li> Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 3 a 10 min. Monitorare aumento della fluorescenza sotto il microscopio fino ai primi accenni di strutture può essere visto. Procedere rapidamente per lavare passo. </li><li> Lavare i vetrini 3x per 5 minuti ciascuno in tampone di lavaggio TNT (o PBS) a Temperatura con agitazione. </li><li> Aggiungere la soluzione antiscolorimento con DAPI e coprioggetto. Osservare al microscopio a fluorescenza. Per visualizzare DAPI e FITC fluorescenza utilizzano un set di filtri passa-banda: FITC di eccitazione D490/40, emissione 520/10; DAPI eccitazione D360/40, emissione 460/20, o simile. </li></ol>

<ol>
	<li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>Schilling, M., Besselmann, M., M&#252;ller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia:+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice.">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).</li><li>Faustino, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cells+contribute+to+endogenous+brain+defenses+after+acute+neonatal+focal+stroke.">Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke.</a> J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).</li><li>Thored, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+accumulation+of+microglia+with+proneurogenic+phenotype+concomitant+with+persistent+neurogenesis+in+adult+subventricular+zone+after+stroke.">Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke.</a> Glia. 57 (8), 835-849 (2009).</li><li>Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Janus-faced+microglia:+beneficial+and+detrimental+consequences+of+microglial+phagocytosis.">Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).</li><li>Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+DNA+end-joining+reactions+catalyzed+by+vaccinia+topoisomerase.">Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase.</a> Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK/Cdc42-mediated+microglial+motility+and+gliapse+formation+lead+to+phagocytosis+of+degenerating+dopaminergic+neurons+in+vivo.">ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo.</a> Sci. Rep. . 2, 809 (2012).</li><li>Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+irreparable+ischemic+damage+in+brain+by+selective+labeling+of+double-strand+blunt-ended+DNA+breaks.">Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks.</a> Mol. Med. 8, 818-823 (2002).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

In questo video si dimostra, nel formato sezione di tessuto, come etichettare fagociti attivi che chiare morte delle cellule in ischemia cerebrale focale. La tecnica presentata è il primo approccio che le etichette specificamente solo le celle di gestione dei rifiuti che hanno inghiottito e digerire attivamente cadaveri cellulari. Questo rende più vantaggiosa rispetto ad altri metodi esistenti per l&#39;etichettatura dei fagociti, che non hanno questa capacità. Il metodo utilizza un indic...

Ictus ischemico induce profondi cambiamenti nel tessuto cerebrale colpito. Si avvia morte cellulare massiccia, che porta alla rapida attivazione delle cellule fagocitiche residenti di origine microglia. Essa stabilisce inoltre off infiltrazione di cervello ischemico da vari tipi di fagociti professionali emoderivati ​​compresi neutrofili, macrofagi, dendritiche e mastociti 1,2. E &#39;ancora in discussione se questa risposta al danno ischemico svolge un positivo o un ruolo negativo. Anche se la fagocitosi dopo l&#39;ictus può essere utile perché elimina le cellule morte e sopprime l&#39;infiammazione, ma genera anche tossici specie reattive dell&#39;ossigeno che influenzano la sopravvivenza neuronale e aggravando il danno tissutale 1-5. Mentre diversi tipi di fagociti infiltrano cerebrale ischemico, non tutti partecipano in-gestione dei rifiuti inglobando cadaveri delle cellule e aprendo la strada a processi rigenerativi 1-3. Questo creates un requisito per l&#39;identificazione selettiva delle cellule di gestione dei rifiuti che effettuano la clearance fagocitica della morte cellulare in corsa. Quando l&#39;imaging tali cellule di gestione dei rifiuti attivi, è importante anche per rispondere alla domanda di come efficacemente si degradano i cadaveri delle cellule inghiottito. Il degrado efficace e completa del DNA della cellula morente nella fagocitosi è essenziale perché evita l&#39;auto-immunizzazione e il rilascio di materiale nucleare patologico 6. Qui vi presentiamo nuove sonde che utilizzano specifici rotture del DNA come marcatori di fagociti attivi. Queste interruzioni di firma sono prodotti esclusivamente durante la composizione dei nuclei inghiottito dentro le celle di gestione dei rifiuti funzionale. Pertanto, le sonde selettivamente etichetta solo i fagociti che tracimano e digeriscono attivamente cadaveri cellulari. Essi permettono anche osservando l&#39;intensità e completamento di ripartizione DNA dopo la engulfment. Le sonde sono utili nelle valutazioni di intensità e efficirenza della clearance fagocitica. Le nuove sonde basano su un marcatore non proteico-based e quindi può essere particolarmente vantaggiosa in studi di ictus, quali un&#39;intensa danno ischemico può interrompere morfologia cellulare o esaurire marcatori a base di proteine, in particolare all&#39;interno della zona ischemica nucleo. Il principio della tecnica è presentata nella Figura 1. La figura mostra sonde oligonucleotidiche a forma di forcina ligati per l&#39;enzima topoisomerasi vaccinia (VACC TOPO) al DNA 5&#39;OH finisce generato da lisosomiale DNasi II durante la digestione DNA 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="696">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:312px;">Name of the reagent or material</td>
			<td style="width:99px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:129px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9490-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vaccinia Topoisomerase I</td>
			<td colspan="2">Vivid Technologies</td>
			<td>5 pmol/&#956;L stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3&#8217; ; B &#8211; Biotin-dT; 100 pmol/&#956;L stock in ddH2O&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Adapter Oligonucleotide</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TAG AAT CGT ATC-3&#8217;; 100 pmol/&#956;L stock in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M Tris-HCl, PH 7.4</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSA, Fluorescein System&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>NEL701A001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;">22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">Rat Brain Sections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;">Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6&#956;m-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Video camera and software</td>
			<td>Micromax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software</td>
			<td>Metamorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing phagocytic clearance of cell death in experimental stroke by ligatable fluorescent probes

Descriviamo un nuovo approccio istochimica per la visualizzazione della clearance fagocitica in ischemia cerebrale focale. L&#39;approccio consente lo studio di eliminazione delle cellule morte in corsa dai fagociti di gestione dei rifiuti di qualsiasi lignaggio cellulare. Sebbene numerose cellule di origine diversa che sono capaci di fagocitosi sono presenti nel cervello ischemico, solo una parte di essi attivamente fagocitare e digerire corpi cellulari. La visualizzazione selettiva, quantificazione e analisi di tali attività di gestione dei rifiuti fagocitica sono utili nella valutazione della risposta del cervello ad ischemia. Efficiente liquidazione morte cellulare è importante per il recupero cervello dalla lesione ischemica, in quanto apre la strada per i successivi processi rigenerativi. La mancata pulizia cadaveri comporterebbe una reazione tossica causata da DNA non degradato e proteine. La procedura descritta utilizza sonde fluorescenti selettivamente legatura da un topoisomerasi virale di caratteristici rotture del DNA prodotte in tutti i fagociti durante la fagocitazionee la digestione delle cellule irreversibilmente danneggiato da ischemia. Il metodo è un nuovo strumento per lo studio della reazione del cervello al danno ischemico.

Il principio della tecnica per l&#39;etichettatura fagociti gestione dei rifiuti attivi è illustrata nella Figura 1. Lo schema dimostra che il ricavato di rilevazione in tre fasi. La prima fase comprende l&#39;attivazione della sonda (Figura 1A); nella seconda fase la sonda attivato viene ligato a specifiche rotture del DNA in sezioni di tessuto (Figura 1C); la terza fase comprende fluorescente amplificazione del segnale (Figura 1D). In una spiegazione...

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Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes

Vi presentiamo una nuova tecnica di fluorescenza per l&#39;etichettatura selettiva in situ di fagociti attivi, che chiaramente fuori cadaveri cellulari in corsa. L&#39;approccio è importante per valutare la reazione di ischemia cerebrale perché solo una piccola parte dei fagociti presenti nel cervello ischemico partecipare nella clearance di cellule morte.

Valutare Liquidazione fagocitaria della morte cellulare in corsa sperimentale da Ligatable Fluorescent Probes

We describe a new histochemical approach for visualization of phagocytic clearance in focal brain ischemia. The approach permits the study of elimination ...

assessing-phagocytic-clearance-cell-death-experimental-stroke

Research

JoVE Journal

Medicine

8.1K Views.  Baylor College of Medicine.  Vi presentiamo una nuova tecnica di fluorescenza per l'etichettatura selettiva in situ di fagociti attivi, che chiaramente fuori cadaveri cellulari in corsa. L'approccio è importante per valutare la reazione di ischemia cerebrale perché solo una piccola parte dei fagociti presenti nel cervello ischemico partecipare nella clearance di cellule morte. 