עבודה זו נתמכה על ידי הקרן השוויצרית הלאומית למדע (מענקי N ° PZ00P2_126430 / 1 וPZ00P2_144595). פרופ &#39;ג Leumann הוא הודה בהכרת תודה למתן חלל המעבדה וציוד, כמו גם לתמיכה המתמדת שלו. הגב &#39;סו Knecht הוא הודה לדיונים פוריים.

1. סינתזה של triphosphates נוקלאוזידים השתנה הגישה סינתטית נבחרה להלן השיטה שפותחה על ידי לודוויג ואקשטיין מאחר ושיטה זו היא בדרך כלל אמינה ומובילה למעט מאוד תופעות לוואי (איור 1 א) 39. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coevaporate נוקלאוזידים המוגן 3&#39;-OAC כראוי (בדרך כלל 0.1 מילימול) פעמיים עם פירידין נטול מים (2 מיליליטר) ולאחר מכן יבש תחת ואקום הלילה. במקביל, pyrophosphate היבש tributylammonium (0.13 מילימול) תחת ואקום הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את נוקלאוזידים במינימום של פירידין היבש (0.2 מיליליטר) ולהוסיף dioxane היבש (0.4 מיליליטר) כcosolvent. לבסוף, להוסיף 2-כלורו-1-,3,2 benzodioxaphosphorin-4-אחד (0.11 מילימול) ומאפשר להגיב בטמפרטורת חדר למשך 45 דקות. הערה: ראוי לציין כי טיפול מסוים צריך לקחת עם המגיב ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-2-אחד כלורו-1. ואכן, גם אחסון של המגיב הזה, לפי atmosp גז אינרטיכאן הוא לא מספיק כדי למנוע הפירוק שלה. לפיכך, אפשר וצריך לגרד הלבן מוצקים שנוצר בפירוק זה לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של pyrophosphate tributylammonium בDMF היבש (0.17 מיליליטר) וtributylamine טרי מזוקק (58 μl; לא להוסיף מסננות מולקולריות). מוסיף את הפתרון שהתקבל לתערובת התגובה (משקע לבן מופיע אבל מהר נעלם) ומאפשר להגיב בטמפרטורת חדר למשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של יוד (0.16 מילימול) בפירידין (0.98 מיליליטר) ו-H 2 O (20 μl) ולהוסיף לתערובת התגובה על מנת לחמצן Pα (שלישי) במרכז. אפשר הפתרון הכהה שנוצר כדי לעורר בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתמיסה מימית 10% מNAS 2 O 3 כדי להרוות את עודפי 2. הסר את הממס תחת ואקום (הטמפרטורה של אמבט המים של המאייד הסיבובי חייבת להישמר מתחת 30 מעלות צלזיוס). הוספת H 2 O (5 מיליליטר) ולאפשר למילxture לעמוד בטמפרטורת חדר במשך 30 דקות לhydrolyze מחצית אדנוזין המחזורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, קבוצות הגנת מוסרים בדרך כלל (כלומר, 3&#39;-OAC והקבוצות ברשתות בצד של Nucleobase). כתוצאה מכך, להוסיף 4 OH NH (30% H 2 O, 10 מיליליטר) לגולמי ומערבבים ל1.5 שעות בטמפרטורת חדר, ולהסיר את הממס תחת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של H 2 O ופיצול ל 2 צינורות. הוספת 12 מיליליטר של פתרון 2% מ4 NaClO באצטון וצנטריפוגה (1,000 XG) במשך 30 דקות. הליך זה חוזר על עצמו עוד פעם אחת. משקעים זה מאפשר את ההפרדה של הממסים וחומרים כימיים המשמשים בסינתזה מאדנוזין (שיזרז), ובכך לפשט את טיהור RP-HPLC שהתפתח באופן משמעותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי אוויר ייבוש של השאריות שומניות, להקליט ספקטרום P-NMR יום 31 של גולמי (בעקבות הליכים סטנדרטיים, ראה גם רשימה של חומרים ואיור 3) ולפזר ב4 מיליליטר H 2 O. הערה: הליך סינטטי זה מתמקד בעיקר בדור של triphosphates deoxynucleoside שונה, אבל הליך דומה מאוד יכול להיות מיושם לעמיתי RNA שלהם (פשוט על ידי שימוש 2 &#39;, 3&#39;-BIS-acetylated O מבשרים). </li></ol> 2. טיהור HPLC של triphosphates נוקלאוזידים השתנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון M מניית 1 של יקרבונט triethylammonium (TEAB): 40 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של שומה 1 של triethylamine (139 מיליליטר) ב≈ 600 מיליליטר של H 2 O. מזוקק והמסונן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בועת CO 2 (באמצעות קרח יבש וbubbler גז) לתוך התמיסה תחת ערבוב נמרץ, עד pH של 7.6 הוא הגיע (זה ייקח לפחות 10 hr). פתרון מניות זה ניתן לאחסן במקרר לתקופה של עד חודש אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני פתרונות חיץ ממניות 1 M: 2 L של 50 מ&quot;מ TEAB במי ultrapure (eluent)nd 1 ליטר של 50 מ&quot;מ TEAB ב50% MeCN (eluent ב &#39;). דגה גם eluents תחת ואקום וערבוב במשך 20 דקות (נדרש תשומת לב קפדנית על מנת שלא לשנות את רמת החומציות על ידי הסרת ה-CO 2 במהלך degassing). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדגם אנליטית על ידי המסת 10 μl של אדנוזין הגולמי ב300 μl מזוקק H 2 O ולהזריק לתוך מערכת HPLC מצוידת בעמודה למחצה preparative RP (C18) ובאמצעות שיפוע החל 0-100% B ב40 דקות (איור 4). התאם את תכנית HPLC לפי t R של אדנוזין (שהיא בדרך כלל השיא העיקרי בהכרומתוגרמה) ודיפוספט (שבה יש לא R מעט נמוך יותר). לטהר את התערובת גולמי באמצעות תנאים אלה ועל ידי הסרת שברים מוקדמים שעשויים להכיל כמה דיפוספט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את כל השברים המכילים את המוצר ולהקפיא יבשים (שהוא העדיף אידוי על המאייד הסיבובי על מנת למזער הידרוליזה לdiphosph לא רצויאכלתי). Coevaporate מספר פעמים עם המים ultrapure (כדי להסיר triethylamine שריד מeluents). להעריך את הטוהר של אדנוזין ידי תמ&quot;ג (שני H 1 וNMR 31 בP) וMALDI-TOF על ידי יישום של פרוטוקולים סטנדרטיים (ראה איור 5). תשואות אופייניות מתקבלות על ידי יישום של פרוטוקול זה בדרך כלל לשקר בטווח של 30-70%, בהתאם למצע. </li></ol></li></ol> 3. תגובות הארכת פריימר ופלמור TdT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג סוף 5&#39;-של פריימר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 30 pmol של פריימר המתאים (למשל P1, רשימה של חומרים) עם 4 μl של 10x קינאז Polynucleotide חיץ (PNK), 3 μl של γ-[P 32]-ATP, μl 1 של PNK, וDDH 2 O (עבור בסך הכל תגובת נפח 40 μl). דגירה את תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולאחר מכן חום לבטל את קינאז (10 דקות ב 70 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תגובת התיוג להכיןעמודת G10 Sephadex ידי חיבור קצה פיפטה 1 מיליליטר עם צמר זכוכית silanized וממלא את הקצה עם פתרון G10 (10% בDDH 2 O, autoclaved). ספין למטה לשטוף שלוש פעמים עם 500 μl DDH 2 O ולשטוף סופיים אחד עם DDH μl 50 2 O. הפעל את תערובת התגובה דרך G10 (כדי להסיר את תווית רדיואקטיבית חינם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ל לטהר (עמוד 20%) פריימר radiolabeled ולשחזר על ידי יישום של ההתאהבות ולספוג שיטה (elution כלומר עם 500 μl של תמיסה מימית המכילה 1% LiClO 4 ו 1 מ&quot;מ נטה 3 (pH 8) בשעה 72 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות). משקע אתנול וG10 desalt oligonucleotide eluted. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובת הארכת פריימר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשל 1 pmol של P1 פריימר radiolabeled, 10 P1 פריימר pmol, ו10 pmol של T1 תבנית (רשימה של חומרים) בחיץ 10x תגובה (המסופק על ידי הספק של פולימראז לשמש) על ידי הצבת tאופה ב( 90-95 מעלות צלזיוס) מים חמים ועל ידי מתן אפשרות להתקרר בהדרגה לטמפרטורת חדר (מעל 45 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הצינור על קרח ולהוסיף (בתורו) קוקטייל dNTP (המכיל גם שונה וtriphosphates הטבעי, 100 מיקרומטר ריכוז סופי) ו1 U של DNA פולימרז (Vent (Exo -), Klenow, PWO או 9 ° N מ &#39;) ולהשלים עם מים (על סך נפח תגובה של 20 μl). דגירה בטמפרטורה האופטימלית העבודה של האנזים (למשל 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כאשר Vent (Exo -) נמצא בשימוש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של להפסיק פתרון (פוראמיד (70%), חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA; 50 מ&quot;מ), bromophenol הכחול (0.1%), cyanol קסילן (0.1%)), לחמם את הדגימות (95 ° C, 5 דקות), מגניב למטה (0 מעלות צלזיוס), וליישב בdenaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide. דמיין ידי Phosphorimager. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פילמור TdT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 7 pmol של אחד גדילים, P2 פריימר ללא תווית (רשימת החומרים), pmol 1 של פריימר radiolabeled במאגר TdT μl 1 10x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הצינור על קרח ולהוסיף (בתורו) קוקטייל dNTP (בריכוז נאות המורכב בין 10 200 מיקרומטר) ופולימראז TdT (4 U). לדגור על C ° 37 במשך שעה 1. הוסף 10 μl של להפסיק פתרון, לחמם את הדגימות (95 ° C, 5 דקות), להתקרר (0 מעלות צלזיוס), וליישב בdenaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד 15%). דמיין ידי Phosphorimager. </li></ol></li></ol> 4. PCR עם triphosphates נוקלאוזידים השתנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 8 pmol של שני קדימה לאחור פריימרים עם 0.5 pmol של התבנית להיות מוגבר. הוספת 10x חיץ תגובה וקוקטייל dNTP (לצורך ריכוז סופי 200 מיקרומטר) ולשים את הצינור על קרח. הוסף 1 U של פולימראז ה-DNA ולהשלים עם H 2 O להגיע נפח סופי של μl 20. מעביר את התערובת לתוך בקבוקון PCR ולבצע 30 מחזורי ה-PCR.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 6 μl עם 6 μl של חיץ טעינת סוכרוז 2x ולפתור על ידי 2% agarose (מוכתם ברומיד ethidium) אלקטרופורזה. דמיין ידי Phosphorimager. </li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הכללת שינויים בחומצות גרעין היא עניין של יישומים מעשיים רבים, כולל הפיתוח של סוכני antisense וantigene 42,43, תיוג ותיוג פונקציונלי של oligonucleotides 41, ובמאמצים להרחיב את האלפבית הגנטי 44-46. שינויים כימיים וקבוצות פונקציונליות בדרך כלל מוכנסים חומצות גרעין על ידי י?...

<html> triphosphates 5&#39;-נוקלאוזידים ((ד) NTPs) מייצג סוג של ביומולקולות חיונית כי הם מעורבים בתהליכים אינספור פונקציות הנעים מלהיות המטבע האוניברסלי של אנרגיה לרגולטורים של חילוף חומרים בתא. בנוסף לתפקידם בשינויים הביולוגיים הבסיסיים אלה, עמיתים השונים קידמו כפלטפורמה תכליתית וקלה לכניסתה של קבוצות פונקציונליות לoligonucleotides, המתודולוגיה שיפה משלימה את הסינתזה מוצק שלב האוטומטי המיושמת בדרך כלל 1,2. ואכן, בתנאי NTPs (ד) יכול לפעול כמצעים לpolymerases RNA ו-DNA 3, עושר של קבוצות פונקציונליות כוללים חומצות אמינו 4-13, חומצות boronic 14,15, nornbornene 16, שאריות כמו diamondoid 17, תופעות שרשרות ל organocatalysis 18, חומצות מרה 19, ואפילו oligonucleotides 20 יכול להיות מוחדר oligonucleotides. _content &quot;&gt; מעבר לייצוג וקטור נוח לfunctionalization של חומצות גרעין, יכול להיות מעורב dNTPs שונה בSelex ושיטות אחרות הקשורים קומבינטורית של בחירה במבחנה לייצור חומצות גרעין שונה קטליטי 21-30 וaptamers ליישומים מעשיים שונים 10, 31-36. צד רשתות נוספות שהוצגו על ידי פילמור של dNTPs שונה הם חשבו להגדיל את השטח הכימי שניתן לחקור בניסוי בחירה ולהשלים את הארסנל התפקודי עני למדי של חומצות גרעין 37. עם זאת, למרות אלה תכונות אטרקטיביות וההתקדמות האחרונה שנעשתה בפיתוחם של שני סינטטי ושיטות אנליטיות, לא ישימה באופן אוניברסלי והליך תשואה גבוהה קיימים לצורפות של triphosphates נוקלאוזידים הותאם 2,38. מטרת הפרוטוקול נוכחי זה היא לשפוך אור לתוך (לפעמים) לא מובילים הליכים מורכביםo הסינתזה והאפיון ביוכימי של אבני הבניין הופעל אלה (איור 1). דגש מיוחד יינתן על כל הפרטים סינטטיים שלעתים קרובות קשים למצוא או נעדרים בסעיפי ניסיוני, אבל הם עדיין חיוניים להשלמה המוצלחת של המסלול הסינתטי שהובילה לבידודה של NTPs הטהור (ד) (איור 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="799">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">tributylammonium pyrophosphate&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P8533</td>
			<td style="width:215px;">Hygroscopic solid, keep under Ar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">324124</td>
			<td>Moisture sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Pyridine</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">82704</td>
			<td>Under molecular sieves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Dioxane</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">296309</td>
			<td>Under molecular sieves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">dimethylformamide (DMF)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">40248</td>
			<td>Under molecular sieves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Acetonitrile&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Triethylamine</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">90342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Tributylamine</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">90781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:333px;">ddH2O</td>
			<td style="width:109px;">Milli-Q</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">159220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:333px;">D2O</td>
			<td style="width:109px;">Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:143px;">DLM-4-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Biochemical reagents</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">g-[32P]-ATP</td>
			<td style="width:109px;">Hartmann Analytics</td>
			<td style="width:143px;">FP-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Natural dNTPs</td>
			<td style="width:109px;">Promega</td>
			<td style="width:143px;">U1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:333px;">Vent (exo-) DNA polymerase</td>
			<td style="width:109px;">NEB</td>
			<td style="width:143px;">M0257S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment</td>
			<td style="width:109px;">NEB</td>
			<td style="width:143px;">MO210S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:333px;">9&#176;Nm DNA polymerase</td>
			<td style="width:109px;">NEB</td>
			<td style="width:143px;">MO260S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)</td>
			<td style="width:109px;">Promega</td>
			<td style="width:143px;">M828A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Pwo DNA polymerase</td>
			<td style="width:109px;">Peqlab</td>
			<td style="width:143px;">01 01 5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:109px;">Thermo Scientific</td>
			<td>EK0032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%)</td>
			<td style="width:109px;">Serva</td>
			<td align="right" style="width:143px;">10679.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Agarose</td>
			<td style="width:109px;">Apollo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BIA1177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">G10 Sephadex</td>
			<td style="width:109px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">G10120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Urea</td>
			<td style="width:109px;">Apollo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BIU4110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Equipment</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300&#197;)</td>
			<td style="width:109px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Gene Q Thermal Cycler</td>
			<td style="width:109px;">Bioconcept</td>
			<td style="width:143px;">BYQ6042E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">PCR vials</td>
			<td style="width:109px;">Bioconcept</td>
			<td style="width:143px;">3220-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:333px;">HPLC system</td>
			<td style="width:109px;">Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>&#196;kta basic 10/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">5&#39;-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:333px;">5&#39;-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">5&#39;-GAATTCGATATCAAG P2</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:333px;">More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 &#8211; 13330</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F.</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleoside triphosphates - from synthesis to biochemical characterization

האסטרטגיה המסורתית להקדמה של פונקציות כימיות היא השימוש בסינתזה מוצק שלב על ידי צירוף מבשרי phosphoramidite הותאמו כראוי לרשת המתהווה. עם זאת, תנאי שימוש במהלך הסינתזה וההגבלה לרצפים קצרים ולא לעכב את תחולתה של מתודולוגיה זו. מצד השני, triphosphates נוקלאוזידים שונה מופעלים אבני בניין שכבר מועסק להקדמה קלה של קבוצות פונקציונליות רבות לחומצות גרעין, אסטרטגיה שסוללת את הדרך לשימוש בחומצות גרעין שונה בפלטה רחבה של יישומים מעשיים כגון תיוג ודור תפקודיים של ribozymes וDNAzymes. אחד האתגרים הגדולים מתגורר במורכבות של המתודולוגיה שמוביל לבידוד והאפיון של אנלוגים נוקלאוזידים אלה. במאמר זה וידאו, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לסינתזה של thesדואר שונה אנלוגים באמצעות זרחן ריאגנטים מבוסס (III). בנוסף, ההליך לאפיון ביוכימי שלהם הוא חשף, עם דגש מיוחד על תגובות הארכה תחל ופילמור עוקב TdT. פרוטוקול מפורט זה יהיה שימוש לצורפות של dNTPs שונה והשימוש נוסף שלהם בביולוגיה כימית.

triphosphates נוקלאוזידים שינוי הינו מפתים מטרות סינתטיות שכן הם מאפשרים להקדמה הקלילה של מגוון רחב של קבוצות פונקציונליות לחומצות גרעין 41. עם זאת, הבידוד והאפיון של אבני הבניין הופעל אלה מתגלים לעתים קרובות להיות מפרכים. כתוצאה מכך, התוצאות הראו במסמך זה נחשבות לספ?...

Watch this Scientific Journal Video about Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization at JoVE.com

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

הפרוטוקול המתואר במסמך זה נועד להסביר ולקצר מספר רב של מכשולים בדרכו של המסלול המורכב המוביל לtriphosphates נוקלאוזידים שונה. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה מאפשר גם לסינתזה של אבני הבניין הופעל אלה וזמינותם ליישומים מעשיים.

נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

nucleoside-triphosphates-from-synthesis-to-biochemical

Research

JoVE Journal

Chemistry

17.0K Views.  University of Bern.  הפרוטוקול המתואר במסמך זה נועד להסביר ולקצר מספר רב של מכשולים בדרכו של המסלול המורכב המוביל לtriphosphates נוקלאוזידים שונה. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה מאפשר גם לסינתזה של אבני הבניין הופעל אלה וזמינותם ליישומים מעשיים. 

Video: Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

סינתזה מפוצלת וברכה ואפיון של הספרייה אמידה השלישון פפטיד

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

מסגרות סינתזה ואפיון של פונקציונליות מתכת אורגנית

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

The Synthesis, Characterization and Reactivity of a Series of Ruthenium N-triphosPh Complexes

Herein we report the synthesis of a tridentate phosphine ligand N(CH2PPh2)3 (N-triphosPh) (1) via a phosphorus based Mannich reaction of the hydroxylmethylene phosphine precursor with ammonia in methanol under a nitrogen atmosphere. The N-triphosPh ligand precipitates from the solution after approximately 1 hr of reflux and can be isolated analytically pure via simple cannula filtration procedure under nitrogen. Reaction of the N-triphosPh ligand with [Ru3(CO)12] under reflux affords a deep red solution that show evolution of CO gas on ligand complexation. Orange crystals of the complex [Ru(CO)2{N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (2) were isolated on cooling to RT. The 31P{1H} NMR spectrum showed a characteristic single peak at lower frequency compared to the free ligand. Reaction of a toluene solution of complex 2 with oxygen resulted in the instantaneous precipitation of the carbonate complex [Ru(CO3)(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (3) as an air stable orange solid. Subsequent hydrogenation of 3 under 15 bar of hydrogen in a high-pressure reactor gave the dihydride complex [RuH2(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (4), which was fully characterized by X-ray crystallography and NMR spectroscopy. Complexes 3 and 4 are potentially useful catalyst precursors for a range of hydrogenation reactions, including biomass-derived products such as levulinic acid (LA). Complex 4 was found to cleanly react with LA in the presence of the proton source additive NH4PF6 to give [Ru(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P{CH3CO(CH2)2CO2H}-&#954;2O](PF6) (6).

The Synthesis, Characterization and Reactivity of a Series of Ruthenium N-triphosPh Complexes

Ruthenium phosphine complexes are widely used for homogeneous catalytic reactions such as hydrogenations. The synthesis of a series of novel tridentate ruthenium complexes bearing the N-triphos ligand N(CH2PPh2)3 is reported. Additionally, the stoichiometric reaction of a dihydride Ru&#8211;N-triphos complex with levulinic acid is described.

הסינתזה, אפיון ותגובתיות של סדרה של רותניום<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; Ph</sup&gt; מכלולים

Herein we report the synthesis of a tridentate phosphine ligand N(CH2PPh2)3 (N-triphosPh) (1) via a phosphorus based Mannich reaction of the ...

Synthesis, Characterization, and Functionalization of Hybrid Au/CdS and Au/ZnS Core/Shell Nanoparticles

Plasmonic nanoparticles are an attractive material for light harvesting applications due to their easily modified surface, high surface area and large extinction coefficients which can be tuned across the visible spectrum. Research into the plasmonic enhancement of optical transitions has become popular, due to the possibility of altering and in some cases improving photo-absorption or emission properties of nearby chromophores such as molecular dyes or quantum dots. The electric field of the plasmon can couple with the excitation dipole of a chromophore, perturbing the electronic states involved in the transition and leading to increased absorption and emission rates. These enhancements can also be negated at close distances by energy transfer mechanism, making the spatial arrangement of the two species critical. Ultimately, enhancement of light harvesting efficiency in plasmonic solar cells could lead to thinner and, therefore, lower cost devices. The development of hybrid core/shell particles could offer a solution to this issue. The addition of a dielectric spacer between a gold nanoparticles and a chromophore is the proposed method to control the exciton plasmon coupling strength and thereby balance losses with the plasmonic gains. A detailed procedure for the coating of gold nanoparticles with CdS and ZnS semiconductor shells is presented. The nanoparticles show high uniformity with size control in both the core gold particles and shell species allowing for a more accurate investigation into the plasmonic enhancement of external chromophores.

The synthesis of uniform gold nanoparticles coated with semiconductor shells of CdS or ZnS is performed. The semiconductor coating is conducted by first depositing a silver sulfide shell and exchanging the silver cations for zinc or cadmium cations.

סינתזה, אפיון, ואת Functionalization של תקליטורים היברידי Au / ו Au / ZnS Core / Shell חלקיקים

Plasmonic nanoparticles are an attractive material for light harvesting applications due to their easily modified surface, high surface area and large ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical properties for applications in photonics, drug delivery and coating technology. Here we present a new family of colloidal building blocks, coined supramolecular colloids, whose self-assembly is controlled through surface-functionalization with a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) derived supramolecular moiety. Such BTAs interact via directional, strong, yet reversible hydrogen-bonds with other identical BTAs. Herein, a protocol is presented that describes how to couple these BTAs to colloids and how to quantify the number of coupling sites, which determines the multivalency of the supramolecular colloids. Light scattering measurements show that the refractive index of the colloids is almost matched with that of the solvent, which strongly reduces the van der Waals forces between the colloids. Before photo-activation, the colloids remain well dispersed, as the BTAs are equipped with a photo-labile group that blocks the formation of hydrogen-bonds. Controlled deprotection with UV-light activates the short-range hydrogen-bonds between the BTAs, which triggers the colloidal self-assembly. The evolution from the dispersed state to the clustered state is monitored by confocal microscopy. These results are further quantified by image analysis with simple routines using ImageJ and Matlab. This merger of supramolecular chemistry and colloidal science offers a direct route towards light- and thermo-responsive colloidal assembly encoded in the surface-grafted monolayer.

A protocol for the synthesis and characterization of colloids coated with supramolecular moieties is described. These supramolecular colloids undergo self-assembly upon the activation of the hydrogen-bonds between the surface-anchored molecules by UV-light.

סינתזה ואפיון של קולואידים מולקולריים

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and validated for the quantification of extracellular purine nucleotides and nucleosides produced by purified chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells under different culture conditions. The chromatographic separation of adenosine 5&#39;-monophosphate (AMP), adenosine (ADO) and inosine (INO) is performed at RT on a silica-based, reversed-phase column that is used for polar compound retention. The method includes a binary mobile phase, which consists of 7 mM ammonium acetate and acetonitrile with a flow rate of 1.00 ml/min. The eluates are monitored using a Photodiode Array UV detector set at 260 nm. A standard calibration curve is generated to calculate the equation for the analytical quantification of each purine compound. System control, data acquisition and analysis are then performed. Applying this protocol, AMP, INO and ADO elute at 7, 11 and 11.9 min, respectively, and the total run time for each sample is 20 min. This protocol may be applied to different cell types and cell lines (both suspension and adherent), using culture media as matrix. The advantages are easy and fast sample preparation and the requirement of a small amount of supernatant for analysis. Furthermore, the use of a serum-free medium allows skipping the protein precipitation step with acetonitrile that impacts the final concentration of purine compounds. One of the limitations of the method is the requirement of the equilibration column run before each single sample run, making the total run time of the experiment longer and preventing high throughput screening applications.

The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.

HPLC מבוססי Assay לפקח תאיים נוקלאוטיד / מטבוליזם nucleoside בתאי לוקמיה לימפוציטית כרונית

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Synthesis and Characterization of Fe-doped Aluminosilicate Nanotubes with Enhanced Electron Conductive Properties

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe aims at lowering the band gap of imogolite, an insulator with the chemical formula (OH)3Al2O3SiOH, and at modifying its adsorption properties towards azo-dyes, an important class of organic pollutants of both wastewater and groundwater.
Fe-doped nanotubes are obtained in two ways: by direct synthesis, where FeCl3 is added to an aqueous mixture of the Si and Al precursors, and by post-synthesis loading, where preformed nanotubes are put in contact with a FeCl3&#8226;6H2O aqueous solution. In both synthesis methods, isomorphic substitution of Al3+ by Fe3+ occurs, preserving the nanotube structure. Isomorphic substitution is indeed limited to a mass fraction of ~1.0% Fe, since at a higher Fe content (i.e., a mass fraction of 1.4% Fe), Fe2O3 clusters form, especially when the loading procedure is adopted. The physicochemical properties of the materials are studied by means of X-ray powder diffraction (XRD), N2 sorption isotherms at -196 &#176;C, high resolution transmission electron microscopy (HRTEM), diffuse reflectance (DR) UV-Vis spectroscopy, and &#950;-potential measurements. The most relevant result is the possibility to replace Al3+ ions (located on the outer surface of the nanotubes) by post-synthesis loading on preformed imogolite without perturbing the delicate hydrolysis equilibria occurring during nanotube formation. During the loading procedure, an anionic exchange occurs, where Al3+ ions on the outer surface of the nanotubes are replaced by Fe3+ ions. In Fe-doped aluminosilicate nanotubes, isomorphic substitution of Al3+ by Fe3+ is found to affect the band gap of doped imogolite. Nonetheless, Fe3+ sites on the outer surface of nanotubes are able to coordinate organic moieties, like the azo-dye Acid Orange 7, through a ligand-displacement mechanism occurring in an aqueous solution.

Here, we present a protocol to synthesize and characterize Fe-doped aluminosilicate nanotubes. The materials are obtained by either sol-gel synthesis upon addition of FeCl3&#8226;6H2O to the mixture containing the Si and Al precursors or by post-synthesis ionic exchange of preformed aluminosilicate nanotubes.

סינתזה ואפיון של Fe-מסומם aluminosilicate צינורות עם מאפייני מוליכות אלקטרונים משופרים

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. Their synthesis by conventional organic chemistry often requires tedious multi-step synthesis processes, with difficult control of the stereochemical outcome. We present a protocol to enzymatically synthetize amino alcohols starting from the readily available L-lysine in 48 h. This protocol combines two chemical reactions that are very difficult to conduct by conventional organic synthesis. In the first step, the regio- and diastereoselective oxidation of an unactivated C-H bond of the lysine side-chain is catalyzed by a dioxygenase; a second regio- and diastereoselective oxidation catalyzed by a regiodivergent dioxygenase can lead to the formation of the 1,2-diols. In the last step, the carboxylic group of the alpha amino acid is cleaved by a pyridoxal-phosphate (PLP) decarboxylase (DC). This decarboxylative step only affects the alpha carbon of the amino acid, retaining the hydroxy-substituted stereogenic center in a beta/gamma position. The resulting amino alcohols are therefore optically enriched. The protocol was successfully applied to the semipreparative-scale synthesis of four amino alcohols. Monitoring of the reactions was conducted by high performance liquid chromatography (HPLC) after derivatization by 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Straightforward purification by solid-phase extraction (SPE) afforded the amino alcohols with excellent yields (93% to &#62;95%).

Chiral amino alcohols are versatile molecules for use as scaffolds in organic synthesis. Starting from L-lysine, we synthesize amino alcohols by an enzymatic cascade reaction combining diastereoselective C-H oxidation catalyzed by dioxygenase followed by cleavage of the carboxylic acid moiety of the corresponding hydroxyl amino acid by a decarboxylase.

תגובות אנזימטיות אשד לסינתזה של כהלים אמינו כיראלי מ L-ליזין

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Synthesis and Characterization of 1,2-Dithiolane Modified Self-Assembling Peptides

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting self-assembled supramolecular structures. The synthetic route takes advantage of solid-phase peptide synthesis with the on-resin coupling of the dithiolane precursor molecule, 3-(acetylthio)-2-(acetylthiomethyl)propanoic acid, and the microwave-assisted thioacetate deprotection of the peptide N-terminus before final cleavage from the resin to yield the 1,2-dithiolane modified peptide. After the high-performance liquid chromatography (HPLC) purification of the 1,2-dithiolane peptide, derived from the nucleating core of the A&#946; peptide associated with Alzheimer&#39;s disease, the peptide is shown to self-assemble into cross-&#946; amyloid fibers. Protocols to characterize the amyloid fibers by Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR), circular dichroism spectroscopy (CD) and transmission electron microscopy (TEM) are presented. The methods of N-terminal modification with a 1,2-dithiolane moiety to well-characterized self-assembling peptides can now be explored as model systems to develop post-assembly modification strategies and explore dynamic covalent chemistry on supramolecular peptide nanofiber surfaces.

A protocol for the synthesis of a 1,2-dithiolane modified peptide and the characterization of the supramolecular structures resulting from the peptide self-assembly.

סינתזה ואפיון של 1, 2-Dithiolane ששינה פפטידים וההספק עצמית

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting ...

Synthesis and Characterization of Amphiphilic Gold Nanoparticles

Gold nanoparticles covered with a mixture of 1-octanethiol (OT) and 11-mercapto-1-undecane sulfonic acid (MUS) have been extensively studied because of their interactions with cell membranes, lipid bilayers, and viruses. The hydrophilic ligands make these particles colloidally stable in aqueous solutions and the combination with hydrophobic ligands creates an amphiphilic particle that can be loaded with hydrophobic drugs, fuse with the lipid membranes, and resist nonspecific protein adsorption. Many of these properties depend on nanoparticle size and the composition of the ligand shell. It is, therefore, crucial to have a reproducible synthetic method and reliable characterization techniques that allow the determination of nanoparticle properties and the ligand shell composition. Here, a one-phase chemical reduction, followed by a thorough purification to synthesize these nanoparticles with diameters below 5 nm, is presented. The ratio between the two ligands on the surface of the nanoparticle can be tuned through their stoichiometric ratio used during synthesis. We demonstrate how various routine techniques, such as transmission electron microscopy (TEM), nuclear magnetic resonance (NMR), thermogravimetric analysis (TGA), and ultraviolet-visible (UV-Vis) spectrometry, are combined to comprehensively characterize the physicochemical parameters of the nanoparticles.

Amphiphilic gold nanoparticles can be used in many biological applications. A protocol to synthesize gold nanoparticles coated by a binary mixture of ligands and a detailed characterization of these particles is presented.

סינתזה ואפיון חלקיקי זהב אמפיפילי

Gold nanoparticles covered with a mixture of 1-octanethiol (OT) and 11-mercapto-1-undecane sulfonic acid (MUS) have been extensively studied because of ...