Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero (Grants n ° PZ00P2_126430 / 1 e PZ00P2_144595). Prof. C. Leumann Si ringrazia per la fornitura di spazi e attrezzature di laboratorio, nonché per il suo costante sostegno. La signora Sue Knecht è riconosciuto per le discussioni fruttuose.

1. Sintesi dei nucleosidi trifosfati modificati L&#39;approccio sintetico prescelto segue la procedura sviluppata da Ludwig e Eckstein poiché questo metodo è generalmente affidabile e porta a pochissimi collaterali prodotti (Figura 1A) 39. <ol><li> Coevaporate nucleoside 3&#39;-OAc protetto adeguatamente (tipicamente 0,1 mmol) due volte con piridina anidra (2 ml) e quindi asciugare sotto vuoto durante la notte. Allo stesso tempo, pirofosfato secco tributylammonium (0,13 mmol) sottovuoto durante la notte. </li><li> Sciogliere il nucleoside in un minimo di piridina secca (0,2 ml) e aggiungere diossano secco (0,4 ml) come co-solvente. Infine, aggiungere 2-cloro-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one (0,11 mmol) e lasciare reagire a temperatura ambiente per 45 min. Nota: È interessante notare che particolare cura deve essere presa con il 2-cloro-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one reagente. Infatti, anche stoccaggio di questo reagente sotto un atmosp gas inertequi non è sufficiente per evitare la decomposizione. Così, il solido bianco che si forma in questa decomposizione può e deve essere raschiata prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare una soluzione di tributylammonium pirofosfato a secco DMF (0,17 ml) e tributilammina distillata (58 ml; mai aggiungere setacci molecolari). Aggiungere la soluzione risultante alla miscela di reazione (un precipitato bianco ma scompare rapidamente) e lasciare reagire a temperatura ambiente per 45 min. </li><li> Preparare una soluzione di iodio (0,16 mmol) in piridina (0,98 ml) e H 2 O (20 mL) e aggiungere alla miscela di reazione per ossidare il Pα (III) centro. Lasciare la soluzione scura risultante agitazione a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Utilizzare una soluzione acquosa al 10% NAS 2 O 3 per placare l&#39;eccesso I 2. Rimuovere il solvente sotto vuoto (temperatura del bagno d&#39;acqua dell&#39;evaporatore rotante deve essere mantenuta al di sotto di 30 ° C). Aggiungere H 2 O (5 ml) e consentire l&#39;kmxture riposare a temperatura ambiente per 30 min per idrolizzare il trifosfato parte ciclica. </li><li> In questa fase, i gruppi di protezione vengono solitamente rimossi (cioè il 3&#39;-OAc ei gruppi delle catene laterali del nucleobase). Conseguentemente, aggiungere NH 4 OH (30% in H 2 O, 10 ml) al grezzo e mescolare per 1,5 ore a temperatura ambiente, e rimuovere il solvente sotto vuoto. </li><li> Aggiungere 2 ml di H 2 O e suddivisa in 2 tubi. Aggiungere 12 ml di una soluzione al 2% di NaClO 4 in acetone e centrifuga (1000 xg) per 30 min. Questa procedura viene ripetuta ancora una volta. Questa precipitazione consente la separazione dei solventi e reagenti utilizzati nella sintesi del trifosfato (che precipitare), semplificando così la conseguente purificazione con RP-HPLC sostanzialmente. </li><li> Dopo l&#39;essiccazione all&#39;aria del residuo oleoso, registrare un 31 P-NMR spettro del grezzo (seguendo le procedure standard, vedere anche elenco dei materiali e figura 3) esciogliere in 4 ml di H 2 O. Nota: Questa procedura sintetica concentra principalmente sulla generazione di deossinucleoside trifosfati modificati, ma una procedura molto simile può essere applicato per i loro omologhi RNA (semplicemente utilizzando 2 &#39;, 3&#39;-bis-O-acetilato precursori). </li></ol> 2. HPLC purificazione dei nucleosidi trifosfati modificati <ol><li> Preparazione di una M soluzione stock di trietilammonio bicarbonato (Teab) 1: 40 <ol><li> Preparare una soluzione di 1 mole di trietilammina (139 ml) in ≈ 600 ml di acqua distillata e filtrata H 2 O. </li><li> Bubble CO 2 (tramite ghiaccio secco e un gorgogliatore gas) nella soluzione sotto agitazione vigorosa fino a raggiungere un pH di 7,6 (questo richiederà almeno 10 ore). Questa soluzione madre può essere conservato in frigorifero per fino a un mese. </li></ol></li><li> Purificazione: <ol><li> Preparare due soluzioni tampone dal magazzino 1 M: 2 L di 50 Teab mM in acqua ultrapura (eluente A)nd 1 L di 50 mM in Teab 50% MeCN (eluente B). Degas due eluenti sottovuoto e agitazione per 20 min (attenzione è richiesta al fine di non alterare il pH rimuovendo CO 2 durante degasaggio). </li><li> Preparare un campione da analizzare sciogliendo 10 ml di trifosfato grezzo in 300 ml di H 2 O distillata e iniettare in un sistema HPLC con una colonna RP semi-preparativa (C18) e con pendenza che varia da 0-100% B in 40 min (Figura 4). Regolare il programma HPLC con R t del trifosfato (che di solito è il picco principale sul cromatogramma) e il difosfato (che ha una leggermente inferiore R t). Purificare la miscela grezza utilizzando tali condizioni e rimuovendo prime frazioni che potrebbero contenere qualche difosfato. </li><li> Combinare tutte le frazioni che contengono il prodotto e la liofilizzazione (che viene preferito evaporazione nell&#39;evaporatore rotante al fine di minimizzare l&#39;idrolisi alla diphosph indesideratoate). Coevaporate più volte con acqua ultrapura (per rimuovere trietilammina residuo dalle eluenti). Valutare la purezza del trifosfato mediante NMR (sia 1 H e 31 P NMR) e MALDI-TOF applicando protocolli standard (vedere la Figura 5). Le rese ottenute mediante l&#39;applicazione di questo protocollo tipicamente si trovano nell&#39;intervallo 30-70%, a seconda del substrato. </li></ol></li></ol> 3. Reazioni primer extension e TdT polimerizzazione <ol><li> Etichettatura 5&#39;-end del primer <ol><li> Mescolare 30 pmol di primer appropriato (ad esempio P1, elenco dei materiali) con 4 ml di 10x Polinucleotide chinasi (PNK) tampone, 3 ml di γ-[32 P]-ATP, 1 ml di PNK, e DDH 2 O (per un volume di reazione totale di 40 microlitri). Incubare la miscela di reazione a 37 ° C per 30 min e poi termicamente disattivare la chinasi (10 min a 70 ° C). </li><li> Durante la reazione di marcatura preparareuna colonna Sephadex G10 inserendo una punta della pipetta da 1 ml con lana di vetro silanizzata e riempiendo la punta con la soluzione G10 (10% in DDH 2 O, autoclave). Spin down e lavare tre volte con 500 microlitri DDH 2 O e un lavaggio finale con 50 microlitri DDH 2 O. Eseguire la miscela di reazione attraverso il G10 (per rimuovere l&#39;etichetta radioattivo gratuito). </li><li> Gel purificare (PAGE 20%) il primer radiomarcato e recuperare mediante l&#39;applicazione del metodo di compressione e ammollo (cioè eluizione con 500 ml di una soluzione acquosa contenente 1% LiClO 4 e 1 mM rete 3 (pH 8) a 72 ° C per 15 min). Etanolo precipitato e G10 desalt l&#39;oligonucleotide eluito. </li></ol></li><li> Reazione di primer extension <ol><li> Anneal 1 pmol di innesco radiomarcato P1, 10 pmol di primer P1, e 10 pmol di modello T1 (elenco dei materiali) in tampone di reazione 10x (fornito dal fornitore della polimerasi da utilizzare) posizionando il tUbe a (90-95 ° C) acqua calda e consentendo di raffreddare gradualmente fino a temperatura ambiente (oltre 45 min). </li><li> Mettere la provetta in ghiaccio e aggiungere (a sua volta) cocktail dNTP (contenenti sia modificato e trifosfati naturali, 100 pM concentrazione finale) e 1 U di DNA polimerasi (Vent (exo -), Klenow, Pwo o 9 ° N m) e terminare con acqua (per un volume totale di reazione di 20 microlitri). Incubare alla temperatura ottimale di lavoro dell&#39;enzima (ad esempio 60 ° C per 30 min quando Vent (Exo - viene utilizzato)). </li><li> Aggiungere 20 ml di soluzione di arresto (formammide (70%), etilendiamminotetraacetico (EDTA, 50 mm), blu di bromofenolo (0,1%), xilene cyanol (0,1%)), riscaldare i campioni (95 ° C, 5 min), fresco verso il basso (0 ° C), e risolvere da denaturazione elettroforesi su gel di poliacrilammide. Visualizza da phosphorimager. </li></ol></li><li> TdT polimerizzazione <ol><li> Diluire 7 pmol di singolo filamento, Senza etichetta Primer P2 (Elenco dei materiali), 1 pmol di primer radioattivo in 1 microlitri di buffer TdT 10x. </li><li> Mettere la provetta in ghiaccio e aggiungere (a sua volta) il cocktail dNTP (ad un&#39;adeguata concentrazione compresa tra 10 e 200 mM) e la polimerasi TdT (4 U). Incubare a 37 ° C per 1 ora. Aggiungere 10 ml di soluzione di stop, riscaldare i campioni (95 ° C, 5 min), raffreddare (0 ° C), e risolvere da denaturazione elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE 15%). Visualizza da phosphorimager. </li></ol></li></ol> 4. PCR con modificati nucleosidi trifosfati <ol><li> Mescolare 8 pmol sia del forward e reverse primer con 0,5 pmol del modello da amplificare. Aggiungere 10x tampone di reazione e il cocktail dNTP (per una concentrazione finale di 200 mM) e mettere la provetta in ghiaccio. Aggiungere 1 U di DNA polimerasi e completo di H 2 O a raggiungere un volume finale di 20 microlitri. Trasferire il composto in una provetta per PCR e di effettuare 30 cicli di PCR.</li><li> Diluire 6 ml con 6 ml di 2x tampone di caricamento saccarosio e risolvere per via di agarosio 2% (colorati con bromuro di etidio) elettroforesi. Visualizza da phosphorimager. </li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;inclusione di modifiche in acidi nucleici è di interesse per numerose applicazioni pratiche, tra cui lo sviluppo di agenti antisenso e antigene 42,43, l&#39;etichettatura e tagging funzionale di oligonucleotidi 41, e negli sforzi per espandere l&#39;alfabeto genetico 44-46. Le alterazioni chimiche e gruppi funzionali sono generalmente introdotti in acidi nucleici mediante l&#39;applicazione di protocolli di sintesi in fase solida standard e automatizzati. Tuttavia, i mattoni Phosp...

<html> 5&#39;-trifosfato (nucleosidi (d) PTR) rappresentano una classe di biomolecole vitali che sono coinvolti in innumerevoli processi e funzioni che vanno dall&#39;essere la valuta universale di energia regolatori del metabolismo cellulare. Oltre al loro ruolo in queste trasformazioni biologiche fondamentali, loro omologhi modificati hanno avanzato come piattaforma versatile e delicato per l&#39;introduzione di gruppi funzionali in oligonucleotidi, una metodologia che integra piacevolmente la sintesi in fase solida automatizzata che viene solitamente applicato 1,2. Infatti, a condizione che i (d) PTR possono agire come substrati per RNA e DNA polimerasi 3, una ricchezza di gruppi funzionali, tra cui aminoacidi, acidi 4-13 boronici 14,15, nornbornene 16, residui diamondoide-17, come catene laterali per organocatalisi 18, acidi biliari 19, e anche oligonucleotidi 20 può essere introdotto in oligonucleotidi. _content &quot;&gt; Oltre che rappresenta una comoda vettoriale per la funzionalizzazione di acidi nucleici, dNTPs modificati possono essere impegnati in SELEX e altri metodi combinatori correlate di selezione in vitro per la generazione di modificati acidi nucleici catalitici 21-30 e aptameri per varie applicazioni pratiche 10, 31-36. Le ulteriori catene laterali che vengono introdotti dalla polimerizzazione dei dNTP modificati sono pensati per aumentare lo spazio chimico che può essere esplorato durante un esperimento di selezione e integrare l&#39;arsenale funzionale piuttosto povera di acidi nucleici 37. Tuttavia, nonostante questi tratti interessanti e recenti progressi nello sviluppo sia di sintesi e di analisi, universalmente applicabile e alla procedura ad alto rendimento esiste per la lavorazione di modificati trifosfati nucleosidici 2,38. L&#39;obiettivo del presente protocollo è quello di far luce nel (a volte) le procedure intricate leader to la sintesi e caratterizzazione biochimica di questi blocchi attivati ​​(Figura 1B). Sarà data particolare enfasi su tutti i dettagli sintetici che spesso sono difficili da trovare o sono assenti nelle sezioni sperimentali, ma sono ancora cruciali per il buon esito del percorso di sintesi che porta all&#39;isolamento di puri (d) PTR (Figura 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="799">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">tributylammonium pyrophosphate&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P8533</td>
			<td style="width:215px;">Hygroscopic solid, keep under Ar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">324124</td>
			<td>Moisture sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Pyridine</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">82704</td>
			<td>Under molecular sieves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Dioxane</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">296309</td>
			<td>Under molecular sieves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">dimethylformamide (DMF)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">40248</td>
			<td>Under molecular sieves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Acetonitrile&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Triethylamine</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">90342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Tributylamine</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">90781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:333px;">ddH2O</td>
			<td style="width:109px;">Milli-Q</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:143px;">159220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:333px;">D2O</td>
			<td style="width:109px;">Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:143px;">DLM-4-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Biochemical reagents</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">g-[32P]-ATP</td>
			<td style="width:109px;">Hartmann Analytics</td>
			<td style="width:143px;">FP-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Natural dNTPs</td>
			<td style="width:109px;">Promega</td>
			<td style="width:143px;">U1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:333px;">Vent (exo-) DNA polymerase</td>
			<td style="width:109px;">NEB</td>
			<td style="width:143px;">M0257S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment</td>
			<td style="width:109px;">NEB</td>
			<td style="width:143px;">MO210S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:333px;">9&#176;Nm DNA polymerase</td>
			<td style="width:109px;">NEB</td>
			<td style="width:143px;">MO260S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)</td>
			<td style="width:109px;">Promega</td>
			<td style="width:143px;">M828A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Pwo DNA polymerase</td>
			<td style="width:109px;">Peqlab</td>
			<td style="width:143px;">01 01 5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:109px;">Thermo Scientific</td>
			<td>EK0032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%)</td>
			<td style="width:109px;">Serva</td>
			<td align="right" style="width:143px;">10679.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Agarose</td>
			<td style="width:109px;">Apollo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BIA1177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">G10 Sephadex</td>
			<td style="width:109px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">G10120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Urea</td>
			<td style="width:109px;">Apollo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BIU4110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Equipment</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300&#197;)</td>
			<td style="width:109px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Gene Q Thermal Cycler</td>
			<td style="width:109px;">Bioconcept</td>
			<td style="width:143px;">BYQ6042E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">PCR vials</td>
			<td style="width:109px;">Bioconcept</td>
			<td style="width:143px;">3220-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:333px;">HPLC system</td>
			<td style="width:109px;">Amersham Pharmacia Biotech</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>&#196;kta basic 10/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">5&#39;-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:333px;">5&#39;-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">5&#39;-GAATTCGATATCAAG P2</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:333px;">More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 &#8211; 13330</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:333px;">Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F.</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleoside triphosphates - from synthesis to biochemical characterization

La strategia tradizionale per l&#39;introduzione di funzionalità chimiche è l&#39;uso di sintesi in fase solida aggiungendo precursori Phosphoramidite opportunamente modificati alla catena nascente. Tuttavia, le condizioni utilizzate durante la sintesi e la restrizione di sequenze piuttosto brevi ostacolano l&#39;applicabilità di questa metodologia. D&#39;altra parte, nucleosidi trifosfati modificati vengono attivati ​​blocchi che sono stati impiegati per l&#39;introduzione mite di numerosi gruppi funzionali in acidi nucleici, una strategia che apre la strada per l&#39;uso di acidi nucleici modificati in una tavolozza ampia di applicazioni pratiche come codifica funzionale e generazione di ribozimi e DNAzymes. Una delle maggiori difficoltà risiede nella complessità della metodologia che porta all&#39;isolamento e caratterizzazione di questi analoghi nucleosidici. In questo articolo video, presentiamo un protocollo dettagliato per la sintesi di these analoghi modificati utilizzando reagenti a base di fosforo-(III). Inoltre, la procedura per la loro caratterizzazione biochimica di divulgazione, con particolare attenzione alle reazioni del primer e TdT tailing polimerizzazione. Questo protocollo dettagliato sarà di uso per la lavorazione di dNTP modificati e il loro ulteriore utilizzo in biologia chimica.

Nucleosidi trifosfati modificati sono seducenti bersagli sintetici in quanto consentono l&#39;introduzione facile di una vasta gamma di gruppi funzionali in acidi nucleici 41. Tuttavia, l&#39;isolamento e la caratterizzazione di questi blocchi attivato viene rivelano spesso ardua. Di conseguenza, i risultati qui indicati sono pensati per fornire una mano per seguire le varie fasi all&#39;interno delle suddette procedure sintetiche e biochimici (Figura 1B). In part...

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Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

Il protocollo qui descritto ha lo scopo di spiegare e abbreviare i numerosi ostacoli nel cammino del percorso intricato portando a nucleosidi trifosfati modificati. Di conseguenza, questo protocollo facilita sia la sintesi di questi blocchi di costruzione attivati ​​e la loro disponibilità per applicazioni pratiche.

Nucleosidi trifosfati - Dalla sintesi di biochimica Caratterizzazione

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

nucleoside-triphosphates-from-synthesis-to-biochemical

Research

JoVE Journal

Chemistry

16.9K Views.  University of Bern.  Il protocollo qui descritto ha lo scopo di spiegare e abbreviare i numerosi ostacoli nel cammino del percorso intricato portando a nucleosidi trifosfati modificati. Di conseguenza, questo protocollo facilita sia la sintesi di questi blocchi di costruzione attivati ​​e la loro disponibilità per applicazioni pratiche. 