אנו מודים לד&quot;ר הנור טיילור המנוח, מח&#39; צמח ומדעי קרקע באוניברסיטת קנטאקי, על שאפשרת לנו להשתמש בדגימות מחלקות התלתן האדומות שלו למחקר זה. פרויקט זה מומן על ידי ארצות הברית מחלקת החקלאות.

1. הכנת תמצית צמח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה קגן וFlythe 10 להפקת תרכובות פנוליות מקורות חי pratense Trifolium. Kenland. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחלץ תרכובות אחרות בצמחים אחרים, בדוק את ספרות ניתוח Phytochemical לשיטות מיצוי צמחים או המטבוליט ספציפי (רבים מתוארות), או לחפש פרוטוקולים כגון אלה של חוראם et al. 7,8 שבודד תרכובות רבות עם רחב מגוון רחב של קטבים. </li></ol> 2. הכנת לוחות דק שכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות TLC נקיות על ידי פיתוח בממסים קוטביים, ניטראליים אחד או יותר, על מנת להתרחק מהאזור של פיתוח המזהמים adsorbed. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף קטר, להכין מספיק ממס ניקוי (למשל 15-100 מיליליטר של 2:1 יצטט מתנול אתיל, V / V) כדי לכסות את החלק התחתון של חדר פיתוח TLC, כמו גם את הקצה התחתון של צלחת TLC כאשר סט בתוך החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש commerזכוכית זמינה cially TLC פיתוח תאים (בגדלים שונים זמינים, עם מכסים) או כוסות פיירקס מכוסה בנייר כסף או צנצנות שימור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כדי לחתוך אלומיניום או צלחות בציפוי פלסטיק (גמישות) סיליקה ג&#39;ל, המגיעים בגדלים שונים (סנטימטר וקטן יותר 20 x 20 סנטימטר), כדי שיתאימו לתא פיתוח זמין. (זהירות: סיליקה יכולה לגרום נזק לריאות אם בשאיפה לעבוד במנדף, ולהתמודד עם צלחות TLC עם כפפות כדי להימנע מקבלת שמני עור על גבי סיליקה..) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הצלחות לתוך התא, עם צמרות נשענו על קירות החדר. צלחות לא צריכים לגעת זה בזה. כסה את החדר ולתת לי הממס להזיז את הצלחת על ידי פעולת נימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הממס הגיע לחלק העליון של הצלחות, להסיר צלחות מהחדר ולסדר בעמידה בתוך מנדף עד הממס התאדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו אם זיהומים היגרו בחלק העליון של צלחת TLC ידי מחפש להקה צהובה מתחת לעיןאור אור, או להקת ניאון מתחת לאולטרה סגול (UV) (ראה &quot;מול הטומאה&quot;, או אם באיור 2 ב). אם הרוב של הצלחת עדיין יש גוון צהבהב, חזור על תהליך הניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת צלחות TLC מהאולם, לבטל את הממס. לאפשר ממס שיורי להתאדות לחלוטין לפני השימוש בחדר לפרוטוקול 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את הלחות שיורית שיכול להשפיע על הגירה של תרכובות על סיליקה 16, לתמוך הצלחות זקופות בתנור ייבוש ב100 ° C (10-15 דקות ל20 סנטימטר x 20 צלחת סנטימטר, ו -5 דקות ל7 ס&quot;מ X 10 צלחות סנטימטר ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תנור ייבוש 100 ° C אינו זמין, צלחות חום לתקופה ארוכה יותר של זמן בטמפרטורות נמוכות יותר (כלומר 40 דקות על 60 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הצלחות יבשות, תן להם להתקרר לטמפרטורת סביבה לפני הטעינה. </li></ol></li></ol> 3. הכנת פיתוח צ&#39;יימברס להפרדת חלץ <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כדי לחתוך פיסת נייר סינון מעט מתחת לתא גובה, וכמחצית למתחם קאמרי ברוחב. מאמר זה משמש כפתילה לצייר ממס עד קיר החדר ולהרוות את החדר עם אדי חומר, ובכך לשפר את שחזור של הפרדות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף, לערבב ממסים (אתיל אצטט, מתנול 4:1, V / V, למחקר זה). יוצקים את תערובת ממס לתוך החדר ולכסות. חכה עד שכל הפתיל הוא רטוב עם ממס, מה שמעיד תא לחץ, לשים את הצלחות לתוך תא. </li></ol> 4. טעינה ופיתוח של צלחות TLC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קל לסמן את מוצאם עם עיפרון. אם בעלי כושר ספיגה צלחת TLC הוא רך ובקלות פגומה, להפוך את הסימנים בקצוות. תרכובות צריכה להיות מעל פני השטח של ממס הפיתוח כאשר צלחות מוכנסות לתוך תא TLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים תמציות במספיק ממס אורגני (במקרה זה, מתנול) יש פתרון מרוכז במקום עכורהשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות עומס וסטנדרטים כמו להקות צרות עם מזרק microliter או micropipettes נימים, משאירים גבול 1 סנטימטר בצדדים של הצלחת. לאפשר ללהקות לייבוש (מלבה את הצלחת או טוען אותו במנדף עוזר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ריכוז גדול יותר של מדגם יש צורך בצלחת, &quot;overspot&quot; על ידי דגימות טעינה שוב בלהקות מיובשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים או מלקחיים, הניח את הצלחת (ים) בתוך חדר TLC הרווי. צלחות לא צריכים לגעת בפתיל כי זה עשוי לספק ממס לצלחות בנקודות מגע, ובכך לשנות את נתיב הגירת מתחם. כסה קאמרי ולתת צלחות להתפתח. </li></ol> 5. הכנת צלחות למבדק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת (ים) מיכל TLC לפני מול הממס מגיע העליון של הצלחת, ולסמן את הגובה של חזית הממס בעיפרון. בואו יבש צלחת במנדף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח כל צלחות TLC שנותרו באותו התא TLC, שזה generally שמיש עבור כל יום אם כל הזמן סגור. מהדורה מחודשת תערובת ממס עבור חדר TLC אם כמות הממס בתא יורדת בעיקר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הצלחות יבשות, לדמיין להקות תחת אור הנראה או UV, ולהתוות להקות בעיפרון. תא צפייה עם מנורת UV ניידת הוא נוח, במיוחד אם את המנורה יכולה לזהות תרכובות בשני 254 ננומטר (UV בגלים קצרים) ו365 ננומטר (UV גל ארוך). הערה: בשלב זה או לאחר השלב הבא, יכולות להיות עטופים צלחות בניילון נצמד, מכוסות בנייר כסף, ומאוחסנות ב -20 ° C. זמן אחסון מרבי תלוי ביציבות תרכובת. בגלל סיליקה אינה ניטראלית, כמה תרכובות עלולות לבזות ואילו על צלחת TLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלם או לצייר צלחות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במערכת photodocumentation ג&#39;ל אם אחד מצויד בUV תקורה ו / או אורות גלויים הוא זמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אין מערכת photodocumentation מסחרית זמינה, צלחות צילום בתוך קופסא מרופדת בנייר או בד כהה, wiה להגדיר את המצלמה על חצובה ואור UV נייד מהודק לטבעת לעמוד 17. כאשר מצלמים צלחות שאין להן חיווי ניאון, השתמש במסנן אור כחול על עדשת המצלמה כדי לשפר את המראה של להקת 17. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לסייע באפיון להקות, לחשב גורם שימור (ו R) ערכים על ידי מדידת מרחקים נסעו במתחם וחזית ממס, וחלוקה לשעבר על ידי (איור 2 א) האחרון. </li></ol> 6. חיידקי תרבות וAssay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין ולחסן תקשורת בתנאים אנאירוביים. התרבות משמשת במקרה זה הייתה SR Clostridium sticklandii המתח, אשר התקבל מאוסף התרבות של ג&#39;יימס ב &#39;ראסל, אוניברסיטת קורנל, איתקה, ניו יורק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה Flythe ו13 קגן ורשימת החומרים לתיאור תקשורת HAB. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול התרבות לשלב מעריכי או נייח. השתמש techniqu אנאירובי סטריליes כאשר עובד עם מיקרואורגניזמים אנאירובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן התרבות (1% V / V) לתוך אגר מותך לאחר הטמפרטורה של אגר (0.75% w / v) ירד ל פחות מ 60 ° C. מערבבים בעדינות ולהביא מייד לחדר אנאירובי (95% H CO 2 -5% 2 אווירה לתקשורת HAB) לשפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים לתוך 15 מ&quot;מ x 100 צלחות פטרי פלסטיק מ&quot;מ, ומאפשר לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מספריים, לחתוך את צלחת TLC לאזורים המכילים להקה (ים) של עניין. הנח להקות עם הפנים כלפי מטה על גבי צלחות אגר, לציון להקות בגיבוי הצלחת כדי לעקוב אחר כיוון המקורי על צלחת TLC. הנח רצועת TLC שאינו בשימוש על גבי צלחת אגר כביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות אגר, אגר צד למטה, בתא אנאירובי (שעה 24, 39 מעלות צלזיוס). </li></ol> 7. ויזואליזציה של צלחות Bioassayed אגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים, להסיר להקות מצלחות אגר בזמן שהם בתא אנאירובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1% (w / v) teאדום trazolium, שהוכן במים, dropwise על גבי המשטחים של הצלחות אגר. לאפשר את הצבע לפתח לפחות 20 דקות, או עד שצלחת השליטה הופכת לאדומה לגמרי, לפני הסרת מתא אנאירובי. החיידקים אנאירוביים יתחילו לאבד את יכולת הקיום מייד לאחר ההסרה מתא אנאירובי, אבל הצבע הוא יציב יותר מ24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלם מתחת לאור הנראה. </li></ol>

<ol>
	<li>Stahl, E., Ashworth, M. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thin-layer chromatography. , (1969).</li><li>Marston, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+with+biological+detection+in+phytochemistry.">Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry.</a> J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 .</li><li>Homans, A. L., Fuchs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+bioautography+on+thin-layer+chromatograms+as+a+method+for+detecting+fungitoxic+substances.">Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances.</a> J. Chromatogr. 51, 327-329 .</li><li>Lund, B. M., Lyon, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+inhibitors+of+Erwinia+carotovora+and+E.+herbicola+on+thin-layer+chromatograms.">Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms.</a> J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).</li><li>Betina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioautography+in+paper+and+thin-layer+chromatography+and+its+scope+in+the+antibiotic+field.">Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field.</a> J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).</li><li>Weltzien, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ein+biologischer+Test+f&#252;r+fungizide+Substanzen+auf+dem+Papierchromatogramm.">Ein biologischer Test f&#252;r fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm.</a> Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).</li><li>Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activities+of+Dodonaea+viscosa+using+contact+bioautography+technique.">Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique.</a> Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).</li><li>Khurram, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+anticandidal+potential+of+Quercus+baloot+Griff.+using+contact+bioautography+technique.">Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique.</a> Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).</li><li>Robinson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Organic Constituents of Higher Plants. , (1963).</li><li>Kagan, I. A., Flythe, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+separation+and+bioactivity+of+red+clover+(Trifolium+pratense)+extracts+assayed+against+Clostridium+sticklandii,+a+ruminal+hyper+ammonia-producing+bacterium.">Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium.</a> Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).</li><li>Mattila, P., Kumpulainen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+free+and+total+phenolic+acids+in+plant-derived+foods+by+HPLC+with+diode-array+detection.">Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection.</a> J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).</li><li>Hamburger, M. O., Cordell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+bioautographic+TLC+assay+for+compounds+possessing+antibacterial+activity.">A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity.</a> J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).</li><li>Flythe, M., Kagan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+effect+of+red+clover+(Trifolium+pratense)+phenolic+extract+on+the+ruminal+hyper+ammonia-producing+bacterium,+Clostridium+sticklandii.">Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii.</a> Curr. Microbiol. 61, 125-131 .</li><li>Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioautographic+agar+overlay+method+for+the+detection+of+antifungal+compounds+from+higher+plants.">A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants.</a> Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).</li><li>Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antigonococcal+activity+of+Coscinium+fenestratum+stem+extract.">In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract.</a> J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).</li><li>Stahl, E., Kaldewey, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spurenanalyse+physiologisch+aktiver,+einfacher+Indolderivate.">Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate.</a> Hoppe-Seyler&#8217;s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 .</li><li>Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ecotype+variability+in+camalexin+production+and+reaction+to+infection+by+Alternaria+brassicicola.">Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola.</a> J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).</li><li>Kline, R. M., Golab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+in+developing+thin-layer+bioautographs.">A simple technique in developing thin-layer bioautographs.</a> J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).</li><li>Wedge, D. E., Nagle, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+2D-TLC+bioautography+method+for+the+discovery+of+novel+antifungal+agents+to+control+plant+pathogens.">A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens.</a> J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).</li><li>Beck, A. B., Knox, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acylated+isoflavone+glycosides+from+subterranean+clover+and+red+clover.">The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover.</a> Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).</li><li>Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., M&#248;ller, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+reconstitution+of+cytochrome+P450ox+and+in+vitro+reconstitution+of+the+entire+biosynthetic+pathway+of+the+cyanogenic+glucoside+dhurrin+from+sorghum.">Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum.</a> Plant Physiol. 115 (4), (1997).</li><li>Peterson, C. A., Edgington, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+estimation+of+the+fungicide+benomyl+using+a+bioautograph+technique.">Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique.</a> J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).</li></ol>

אזכור של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר הוא אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מעיד על המלצה או אישור על ידי משרד החקלאות. המחברים מצהירים שום אינטרס כלכלי מתחרה.

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה להפרדת תמצית לתוך תת קבוצות של תרכובות ומנסים לאמוד תת אלה על ידי bioautography ליצירת קשר. השיטה די דומה לזו ששמשה את Chomnawang et al. 15 למסך למטבוליטים צמח מעכבים לחיידקי גורמי זיבה. הסוג של bioautography המועסק מסך לתרכובות צמחים מיקרוביאלית תלוי בגורמים רבים, כולל בקטריה הבדיקה, התקנת המעבדה, ואת ההעדפות של האדם (ים) ביצוע המבדק. bioautography לתקשר, השיטה המשמשת במחקר זה, זכה לביקורת על תלוי ביכולת של מתחם כדי לפזר לתקשורת מחוסנת 12. אזורים של עיכוב על תרכובות בריכוזים נמוכים, או עם יכולת קטנה לנטרל לתוך תקשורת, לא יכולים להיות לגילוי אם צמיחה מתרחשת באגרה מתחת diffusate. כמו כן, אזור של עיכוב שנוצר על ידי להקה אחת עלול להתפשט מעבר ראשוני של הלהקהגבולות, ובכך אולי מיסוך אזורים מעכבים נוצרו על ידי תרכובות השכנות 14. עם זאת, bioautography המגע הוא שיטה קלה לשימוש, ואת היכולת לערום צלחות פטרי ממזערת את כמות השטח הדרושה. כמו כן, הנחת להקות TLC על אגר מבטלת את הסיכון של פירוק להקה והפצה שיכול להתרחש כאשר צלחת TLC היא ועליהן אגר מחוסן או רוססה בקטריה במבחן. קבלת מידע מכל אחד מהסוגים לעיל של bioautography תלוי בתנאי chromatographic, ריכוז מיקרואורגניזם הבדיקה, ותנאי התרבות / דגירה. רזולוציה כרומטוגרפי של להקות מיקרוביאלית היא לא הכרחית, אבל רגישות עשויה להיות גדולה יותר עבור להקה נפתרה היטב 6. ניתן להפריד להקות ידי פיתוח על צלחות ארוכות יותר או במערכות ממס מרובות בממד אחד (איור 2), או בשני ממדים על ידי הפיכת צלחת TLC 90 מעלות לפני הפיתוחב16,19 ממס שני. תרכובות קוטביות עלולות להיות קשות להפריד על סיליקה ללא שימוש בתערובות ממיסים המכילות חומצות או בסיסים. אלה עשויים להיות קטלניים למיקרואורגניזם המבחן 12, למרות שהשימוש בכמויות קטנות של חומצות דווח 14,15. מערכות ממיסים אלטרנטיביים עשויות לכלול מים או מתנול כרכיבי 20,21. יכולות גם להיפתר תרכובות פולאר על סוגים שונים של צלחות TLC, כגון צלחות מצופים C 18 בעלי כושר ספיגה או תאית מייקרו. עם זאת, צמיחת 12 או רגישות לסוכן ההדמיה מאי 14 להיות מושפעת לרעה על חלק מחומרי הספיחה אלה. שילובים שונים של מיקרואורגניזם מבחן ותקשורת יכולים לשמש לbioautography. עם זאת, מספר גורמים יש לקחת בחשבון בעת ​​בחירת מיקרואורגניזם ותקשורת. התקשורת צריכה להיבדק כדי לקבוע שאין רכיבים המצמצמים את טrazolium מלח ולגרום לשינוי צבע לא ביולוגי. אגר צריך להיות גם מספיק אור בצבע כדי לספק ניגוד בין התאים המוכתמים ואזורים בלא כתם של עיכוב. מיקרואורגניזם שיכול לגדול רק על פני השטח של אגר ניתן להסיר יחד עם להקת TLC או לרחוץ אותו בזמן הצביעה. בנוסף, הבחירה של שילוב מיקרואורגניזם / בינוני שממזערת הפקת גז תפחית בועות באגר. יגדל הכרס הפנימי HAB ב, בינוני נטולות פחמימות שנאגרו פחמה בתערובת של חומצות אמינו או פפטידים כמצע גידול. הצלחות אגר הן זהב ושקוף לאור. כאשר ג sticklandii הוא גדל בטווח הבינוני, רוב המוצרים הם מסיסים (חומצות שומן נדיפות, אמוניה). גז מעט מאוד מיוצר, שתוצאתה צלחת אגר חלקה ללא בועות. יש מבדק זה כמה יישומים פוטנציאליים. גודלו של האזור של עיכוב יכול לשמש כאומדן גס שלהסכום של המתחם המעכב, שכן את הרדיוס של האזור המעכב הוא יחסי ללוגריתם של הסכום של המתחם גורם לעיכוב 17,22. אולי השימוש הנפוץ ביותר של bioassays צלחת TLC הוא לצמצם את מגוון של תרכובות מיקרוביאלית אפשריות בתמצית צמח. לאחר אזורים מעכבים מזוהים במבדק, האזורים המתאימים בצלחת TLC כפולה ניתן eluted עם ממס, כגון מתנול או אתיל אצטט, ונותחו על ידי HPLC עם זיהוי ספקטרוסקופיה סגול כדי להתחיל אפיון תרכובות ביו 10,14.

מנסה לאמוד עבור תרכובות מיקרוביאלית בצמחים דורש הפרדת המרכיבים של תמצית צמח, חושף מיקרואורגניזם בדיקה לרכיבים אלה, וקביעה אם הצמיחה של מיקרואורגניזם הוא מעוכב על ידי כל אחת מהתרכובות. הפרדות על ידי נייר או כרומטוגרפיה בשכבה דקה (PC או TLC) הן נוחים, כי תרכובות רבות יכולות להיות מופרדות על משטח מישורי. הפרדה מבוססת על קוטביות, עם כמה תרכובות מחייבות בחוזקה לבעלי כושר ספיגה (תאית במקרה של מחשב, ועוד מגוון של חומרי ספיחה במקרה של TLC) ונודדות פחות מאחרים 1. איור 1 מספק דוגמא למיקומים היחסי של תרכובות פנוליות קוטב ופולרי לאחר הפרדה על צלחת TLC סיליקה. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51411/51411fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51411/51411fig1.jpg" /> איור 1. דיאגרמה המדגימה הפצות של תרכובות של קטבים שונים לאחר הפרדה על chromatographic דק שכבה סיליקה צלחת (TLC). תרכובות פנול של תלתן אדום (Trifolium pratense L.) משמשות כדוגמא. תרכובות קוטביות, כגון clovamide, יש זיקה חזקה עבור בעלי כושר ספיגה קוטביים כמו סיליקה ולהישאר קרובים למקור (OR), ואילו תרכובות קוטביות פחות, כגון שלושה איזופלבונים קרובים לחזית הממס (SF), מחיצה יותר בקלות לממסים (שהם פחות קוטביים מסיליקה, אלא אם כן מים, חומצות, בסיסים או כלולים) ולהעביר הלאה את הצלחת. לאחר ההפרדה של תמצית על צלחת TLC, יכולים להיחשף מיקרואורגניזמים מבחן לכל התרכובות על הצלחת, ובכך להאיץ את זיהוי של הרכיבים הפעילים של תמצית 2. אם תרבות פטרייתי או חיידקים חשופה להכרומתוגרמה, התפתחותם של חיידקים תתרחש בכל מקום פרט מעל אזורים עם צמיחת מעכביםתרכובות y. אזורים של עיכוב לאחר מכן ניתן לראות על ידי הניגוד בין צמיחת mycelial והאזורים ללא צמיחת פטריות אם כבר הוחלו 3 או על ידי ריסוס עם חומרים שמשנים את צבעם כאשר מופחת או הידרוליזה על ידי תאי חיים 4. למרות שימוש chromatograms נייר או בשכבה דקה למבחנים מיקרוביאלית יושם לראשונה לאנטיביוטיקה 5 וקוטלי פטריות 3,6, תמציות צמחים נמצאות כעת בתדירות גבוהה לגילוי תרכובות מיקרוביאלית בשיטה זו, המכונים לעתים קרובות bioautography. הפרוטוקולים שתוארו לעיל חלים על bioautography של chromatograms בשכבה דקה. TLC נעשה שימוש נרחב בגלל זה הוא מהיר יחסית ויכול להתבצע על חומרי ספיחה שונות (לדוגמא: סיליקה, עמילן, אלומינה), כמו גם לספק רזולוציה טובה ורגישות 1. ניתן להכין תמציות צמחים לTLC בדרכים רבות. שיטות נפוצות כוללות חומר צמחי חילוץ בALCתערובות ohol מים כגון 80% אתנול 7,8, אולי עם התוספת של חומצה או בסיס 9. בעקבות מיצוי בממסים כאלה, המכילים מעט מים והם אולי חומצי או בסיסיים, תמציות חייבת להיות מרוכזות, כך שהם יכולים להיות מיושמים על צלחות TLC בנפח מינימאלי. הריכוז של תמציות אלכוהול מים יכול להיות מושגת על ידי החלוקה עם ממסים אורגניים במים immiscible 8 או בתערובת של ממסים כאלו, כגון אתר אתיל אצטט, אתיל (1:1, V / V) 10,11. מטבוליטים שונים של צמחים המחולצים לממסים אורגניים שונים, בהתאם לקוטביות שלהם. כדי להבטיח כי חומצות אורגניות צמח או בסיסים המחולצים לממסים אורגניים, בשלב זה, ה-pH של תמצית אלכוהול מים יכול להיות עלה או מונמכת עם חומצה מסיס במים או בסיס להמיר analytes ניתק לצורות nondissociated, אשר לאחר מכן מסיס בממסים אורגניים ניטראליים 9. לאחר מכן השלב האורגני יכול להיות דוארvaporated תחת לחץ מופחת או תחת חנקן ומותאם להיקף הרצוי עבור TLC. ה-pH של התמצית לא סביר שיהיה קטלני למיקרואורגניזמים מבדק בשל המחיצות של analytes לממסים ניטראליים, נפח סופי קטן, ואידוי של התמצית על צלחת TLC לפני ההפרדה. פטריות וחיידקים שניהם מועסקים כמיקרואורגניזמים מבחן בbioautography של תמציות צמחים 2. נבגים של פטריות מסוימות, כגון cucumerinum Cladosporium, לנבוט על צלחות TLC (מלבד אזורים עם תרכובות מעכבות) אם ריססו על צלחות בפתרון תזונתי וטופחו בסביבה לחה במשך כמה ימים 3. התפטיר האפל של ג cucumerinum באזורי noninhibitory מספק ניגוד חריף לאזורים ללא צמיחה mycelial. למרות שחיידקים יושמו לכרומטוגרפיה בשכבה דקה צלחות (TLC) באותו אופן 4,12, חיידקים הם גם שפכו על TLCמשטחי צלחת אגרה שכבות 13,14. שמרים, כמו קנדידה אלביקנס, יכולים להיות מיושמים בשכבות אגר כמו גם 14. לחלופין, ניתן להציב צלחות TLC עם פנים כלפי מטה על גבי אגר מחוסן עם חיידקים או שמרי 10,15 8, בשיטה המכונה קשר bioautography 2. אנו מתארים שיטה לbioautography מגע מסך עבור תרכובות פנוליות מיקרוביאלית מתלתן אדום (Trifolium pratense קורות חיים. Kenland). מיקרואורגניזם המבחן הוא sticklandii Clostridium, חיידק כרס היפר לייצור אמוניה (HAB) ולחייב anaerobe. למרות הפרדות שימוש אינן פותרות את כל הרכיבים של התמצית, הם להקל על זיהוי של אזורים של פעילות מיקרוביאלית, ובכך מצמצם את הבריכה של תרכובות מיקרוביאלית אפשריות. הפרוטוקול מנצל נהלים סטנדרטיים ל1 TLC. הפרוטוקול מתאר גם כמה הטכניקות הנדרשות לobli culturingאנאירוביים שער עבור assay כגון, שימוש בקשר bioautography 15 ושיטת הדמיה עם מלח tetrazolium, אשר כתמי תאי חיים 2,4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="739">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 &#215; 20 cm</td>
			<td>EMD Chemicals&#160;</td>
			<td>5554/7</td>
			<td>These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm.&#160; Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background.&#160; Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka.&#160; Adsorbents other than silica may be needed.&#160; Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp, heavy-duty scissors&#160;</td>
			<td>any sewing supply company</td>
			<td>similar to Fiskars&#160; 175800-1002</td>
			<td>For cutting TLC plates.&#160; A paper cutter with a sharp blade can be used as well.&#160; Do not inhale silica dust.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying oven at 100 &#176;C (mechanical convection)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR305225M</td>
			<td>Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC chamber</td>
			<td>Kimble Chase&#160;</td>
			<td>416180-0000</td>
			<td>Alternative sources:&#160; Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 &#215; 10 cm).&#160; Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-&#181;L syringe with flat needle tip</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80965</td>
			<td>For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 &#181;L.&#160; Alternative sources are equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipets</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>2-000-001</td>
			<td>For loading small amounts of standards or samples.&#160; Alternative sources:&#160; VWR.&#160; Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (#1 grade)</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001 917</td>
			<td>Serves as a chamber wick.&#160; Other grades of filter paper are OK.&#160; This size can be trimmed for the chambers holding 20 &#215; 20 cm plates.&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker tongs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-186</td>
			<td>For putting plates in and out of a large TLC chamber.&#160; Alternate sources: VWR&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-edge forceps&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-275</td>
			<td>For putting plates in and out of a small chamber.&#160;&#160; Alternate sources: VWR&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small portable UV lamp with 4-Watt or 6-Watt bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively)</td>
			<td>Ultraviolet Products&#160;</td>
			<td>95-0271-01</td>
			<td>Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp</td>
			<td>Ultraviolet Products&#160;</td>
			<td>Chromato-Vue C-10E</td>
			<td>UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here.&#160; Alternate sources: Spectronics Corporation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp</td>
			<td>Kodak&#160;</td>
			<td>Gel Logic 200</td>
			<td>&#160;Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com).&#160; See protocol for homemade alternative.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl</td>
			<td>Coy&#160;</td>
			<td>7150000</td>
			<td>This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. &#160;However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay.&#160; A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ingredients for HAB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxamine &#183; 2 HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9380</td>
			<td>For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium D-Pantothenate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipoic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Aminobenzoic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalamine&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron sulfate &#183; 7 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate &#183; 7 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride &#183; 4 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt chloride &#183; 6 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper chloride &#183; 2 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride &#183; 6 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate &#183; 2 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>331058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Trypticase (Pancreatic digest of casein)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>B11921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium carbonate &#183; H2O&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50841063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate &#183; 6 H2O</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride &#183; 2 H2O</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine HCl</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>19464780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thin-layer chromatographic (tlc) separations and bioassays of plant extracts to identify antimicrobial compounds

מסך משותף לתרכובות מיקרוביאלית צמח מורכב של הפרדת תמציות צמחים על ידי נייר או כרומטוגרפיה בשכבה דקה (PC או TLC), חושפת את chromatograms להשעיות של חיידקים (למשל פטריות או חיידקים במרק או אגר), ומאפשרים זמן לחיידקים לגדול ב סביבה לחה, באופן חזותי אזורים ללא התפתחותם של חיידקים. היעילות של שיטת הקרנה זו, הידועה בשם bioautography, תלויה הן באיכות של הפרדת chromatographic והטיפול נלקח בתנאי תרבות של חיידקים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים סטנדרטיים עבור TLC וbioautography מגע עם יישום חדשני לאמין חיידקי תסיסת חומצה. התמצית מופרדת על צלחות TLC סיליקה (מגובות אלומיניום) גמישות, ולהקות הם דמיינו תחת אור אולטרה סגול (UV). אזורים הם לגזור וטופחו על פנים על אגר מחוסן עם מיקרואורגניזם הבדיקה. להקות מעכבות הם דמיינו ידי מכתימים את הצלחת אגרים עם tetrazolium אדום. השיטה מיושמת להפרדה של תלתן אדום (Trifolium pratense קורות חיים. Kenland) תרכובות פנוליות וההקרנה שלהם לפעילות נגד sticklandii Clostridium, חיידק היפר לייצור אמוניה (HAB) כי הוא יליד המסס השור. שיטות TLC תחולנה על סוגים רבים של תמציות צמחים ומיני חיידקים אחרים (אירוביים או אנאירובי), כמו גם פטריות, ניתן להשתמש בם כיצורי מבחן אם תנאי התרבות שונו כדי שיתאימו לדרישות הצמיחה של המינים.

הפרדות TLC סיליקה נציג של תלתן אדום תמציות (CV pratense Trifolium. Kenland), המכילים תרכובות פנוליות, מוצגות באיור 2. הפרדה של תמצית תלתן אדומה ביצטטו-הקסאן אתיל (9:01, v / v), מעל 8.5 סנטימטר, הביא חמש להקות, (איור 2 א) אחד חלקי נפתר מהמקור. עם זאת, איור 2 מראה כי להקות על כפליים נחשפו כאשר מדגם של תמצית תלתן אדומה (מאותו הזן, אבל גדלו בחלקה נפרדת באותו המשק) שונה הופרד על פני מרחק גדול יותר (15 סנטימטר במקום 8.5 סנטימטר) ועם שתי התפתחויות רצופות במערכות ממסים שונות. הכרומתוגרמה של תרשים 2B פותחה לראשונה ביצטט-הקסאן אתיל (09:01, V / V), ולאחר מכן להתייבש והפרידו ביצטטו אתיל מתנול (78:22, V / V). תוצאות אלו מראות כי גם בגודל צלחת ובחירה של מערכת ממס (או סדרה של ממסystems) יכול להשפיע על מספר התרכובות המופרדים בהכרומתוגרמה. במקרה הספציפי הזה, elution וכרומטוגרפיה ביצועים גבוהים נוזלית (HPLC) של להקות מהפרדות TLC אחרות מאותו תמציות אישרו כי התרכובות שנותרו בבית או ליד המקור כללו בעיקר של תרכובות פנוליות (חומצות פנוליות או איזופלבונים) מצומדת לmoieties קוטב כגון נגזרות חומצת אמינו, סוכרים, או חומצת מאלית. לעומת זאת, איזופלבונים לא מצומדת לmoieties הקוטבי נדדו במעלה צלחות TLC 10. תוצאות מבדק של צלחת TLC שמוצגת באיור 2 א עם sticklandii Clostridium, חיידק כרס היפר לייצור אמוניה (HAB), מוצגות באיור 3. הוספת 1% (w / v) תמיסה מימית של אדום tetrazolium לצלחות אגר לאחר דגירה 24 שעות הביאה צבע אדום בהיר כאשר תאי חיים היו מוכתמים. דגירה של להקת 1 (biochanin) וחלק מהתואר ראשוןnd 2 (formononetin) על אגר חיידקים נזרעו הביא לאזור מוגדר היטב של עיכוב (איור 3 א). עם זאת, דגירה של שאר להקה 2, יחד עם להקות 3 ו -4, לא לעכב את צמיחת חיידקים (איור 3 ב). תוצאות אלו הראו כי biochanin הייתה מעכב לג צמיחת sticklandii, אבל formononetin לא היה. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51411/51411fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51411/51411fig2.jpg" /> הפרדות איור 2. chromatographic דק השכבה סיליקה (TLC) של תמצית של קורות חיים pratense Trifolium. Kenland, שפותח ב (א) יצטט hexanes אתיל (09:01, V / V), או (ב) באותו ממס ואחריו פיתוח ביצטט אתיל מתנול (78:22, V / V). היגר המרחק על ידי הממס בין המקור (OR) ומול ממס (SF) מצויינים לידסוגריים בין שני גבולות אלה. באיור 2 ב, &quot;מול הטומאה&quot; (IF, מיקום של הזיהומים עבר את הצלחת על ידי prewashing בממסים קוטביים) נתפסת כלהקה כהה בחלק העליון של הצלחת. תמציות, שהוכנו 180-250 עלים תלתן אדום המיובש בהקפאה מ&quot;ג וגבעולים, היו מומסים במתנול, ו10% מתמצית () או 32% (B) הועמסו על גבי צלחות סיליקה. תקנים הטעונים היו formononetin (ו, 7.1 nmol), biochanin (ba, 7.4 nmol), גניסטאין (ז, 9.8 nmol), וclovamide (Cl, 2B איור בלבד, 8.7 nmol). להקות הקיפו בעוד שנצפו תחת מנורת UV כף יד ב254 ננומטר (UV בגלים קצרים) ו365 ננומטר (UV גל ארוך). מצלמה דיגיטלית הייתה בשימוש כדי לצלם את הצלחת תחת UV בגלים קצרים. המספרים בצד הימין של להקות תמצית התלתן באיור 2 א מתייחסים לאזורים בנויים למבדקים. גורמי שימור (ו R, travele מרחקד על ידי להקה / מרחק שעובר SF) הם בסוגריים אחרי מספרי להקה באיור 2 א. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51411/51411fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51411/51411fig3.jpg" /> איור 3. תוצאות של מבדקי צלחת TLC של () להקה 1 ואת החלק העליון באופן חלקי נפתר של להקה 2 מצלחת TLC של איור 2 א, ולהקות (ב &#39;) 2-4 מאותה הצלחת TLC. להקות הונחו עם פנים כלפי מטה על מדיום HAB מחוסן עם sticklandii Clostridium וטופחו אנאירובי 24 שעות ב39 ° C. בסוף תקופת דגירה זה, הלהקות הוסרו, והצלחות אגר היו מוכתמות בתמיסה מימית של 1% (w / v) tetrazolium אדום וצילם באור הנראה.

Watch this Scientific Journal Video about Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds at JoVE.com

Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

שיטות מתוארות להפרדת chromatographic בשכבה דקה (TLC) של תמציות צמחים וbioautography קשר לזהות מטבוליטים אנטי בקטריאליים. השיטות מיושמות להקרנה של תרכובות פנוליות תלתן אדומים עיכוב חיידקים מייצרי אמוניה היפר (HAB) יליד המסס השור.

בשכבה דקה כרומטוגרפי (TLC) הפרדות וbioassays של תמציות צמחים כדי לזהות תרכובות Antimicrobial

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

thin-layer-chromatographic-tlc-separations-bioassays-plant-extracts

Google

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Principles of Chromatography

SCIENTISTS IN ACTION

67.3K Views.  United States Department of Agriculture.  שיטות מתוארות להפרדת chromatographic בשכבה דקה (TLC) של תמציות צמחים וbioautography קשר לזהות מטבוליטים אנטי בקטריאליים. השיטות מיושמות להקרנה של תרכובות פנוליות תלתן אדומים עיכוב חיידקים מייצרי אמוניה היפר (HAB) יליד המסס השור. 

Video: Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune system that is protective against pathogenic microbes. Abnormal sebum production and chemical composition are also a clinical symptom of specific skin diseases. Sebum contains a complex mixture of lipids, including triacylglycerides, which is species-specific. The broad chemical properties exhibited by diverse lipid classes hinder the specific determination of sebum composition. Analytical techniques for lipids typically require chemical derivatizations that are labor-intensive and increase sample preparation costs. This paper describes how to extract lipids from mammalian integument, separate broad lipid classes by thin-layer chromatography, and profile the triacylglyceride contents using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. This robust method enables a direct determination of the triacylglyceride profiles among species and individuals, and it can be readily applied to any taxonomic group of mammals.

Mammalian integument contains solvent-extractable lipids that can provide chemical compositions characteristic of individual species. This paper presents a routine method for separating broad lipid classes isolated from integumentary tissues using thin layer chromatography and determining the triacylglyceride profile by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.

פרופיל תוכן Triacylglyceride בשומני הכסות בת על ידי כרומטוגרפיה Preparative שכבה דקה וMALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic isotopes are typically incorporated metabolically to improve the sensitivity and allow for sequential resonance assignment. Reductive 13C-methylation is an alternative labeling method for proteins that are not amenable to bacterial host over-expression, the most common method of isotope incorporation. Reductive 13C-methylation is a chemical reaction performed under mild conditions that modifies a protein&#39;s primary amino groups (lysine &#949;-amino groups and the N-terminal &#945;-amino group) to 13C-dimethylamino groups. The structure and function of most proteins are not altered by the modification, making it a viable alternative to metabolic labeling. Because reductive 13C-methylation adds sparse, isotopic labels, traditional methods of assigning the NMR signals are not applicable. An alternative assignment method using mass spectrometry (MS) to aid in the assignment of protein 13C-dimethylamine NMR signals has been developed. The method relies on partial and different amounts of 13C-labeling at each primary amino group. One limitation of the method arises when the protein&#39;s N-terminal residue is a lysine because the &#945;- and &#949;-dimethylamino groups of Lys1 cannot be individually measured with MS. To circumvent this limitation, two methods are described to identify the NMR resonance of the 13C-dimethylamines associated with both the N-terminal &#945;-amine and the side chain &#949;-amine. The NMR signals of the N-terminal &#945;-dimethylamine and the side chain &#949;-dimethylamine of hen egg white lysozyme, Lys1, are identified in 1H-13C heteronuclear single-quantum coherence spectra.

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Two methods for assigning the &#945;- and &#949;-dimethylamine nuclear magnetic resonance signals of a reductively 13C-methylated N-terminal lysine are described. One method utilizes the pH-induced selectivity of the reductive methylation reaction, and the other uses aminopeptidase to selectively remove the N-terminal lysine.

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

Analysis of Volatile and Oxidation Sensitive Compounds Using a Cold Inlet System and Electron Impact Mass Spectrometry

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The analysis of volatile and oxidation sensitive compounds by mass spectrometry is not easily achieved, as all state-of-the-art mass spectrometric methods require at least one sample preparation step, e.g., dissolution and dilution of the analyte (electrospray ionization), co-crystallization of the analyte with a matrix compound (matrix-assisted laser desorption/ionization), or transfer of the prepared samples into the ionization source of the mass spectrometer, to be conducted under atmospheric conditions. Here, the use of a sample inlet system is described which enables the analysis of volatile metal organyls, silanes, and phosphanes using a sector field mass spectrometer equipped with an electron impact ionization source. All sample preparation steps and the sample introduction into the ion source of the mass spectrometer take place either under air-free conditions or under vacuum, enabling the analysis of compounds highly susceptible to oxidation. The presented technique is especially of interest for inorganic chemists, working with metal organyls, silanes, or phosphanes, which have to be handled using inert conditions, such as the Schlenk technique. The principle of operation is presented in this video.

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The presented technique is especially of interest for inorganic chemists, working with metal organyls, silanes, or phosphanes which have to be handled using inert conditions, such as the Schlenk technique.

ניתוח של תרכובות נדיפות רגישות וחמצון באמצעות מערכת קרה מפרצון ואלקטרוני השפעה המוני ספקטרומטריית

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

רצף של הצמח קיר Heteroxylans שימוש enzymic, כימית (מתילציה) הפיזיקליים (ספקטרומטריית מסה, תהודה מגנטית גרעינית) טכניקות

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

On-line Analysis of Nitrogen Containing Compounds in Complex Hydrocarbon Matrixes

The shift to heavy crude oils and the use of alternative fossil resources such as shale oil are a challenge for the petrochemical industry. The composition of heavy crude oils and shale oils varies substantially depending on the origin of the mixture. In particular they contain an increased amount of nitrogen containing compounds compared to the conventionally used sweet crude oils. As nitrogen compounds have an influence on the operation of thermal processes occurring in coker units and steam crackers, and as some species are considered as environmentally hazardous, a detailed analysis of the reactions involving nitrogen containing compounds under pyrolysis conditions provides valuable information. Therefore a novel method has been developed and validated with a feedstock containing a high nitrogen content, i.e., a shale oil. First, the feed was characterized offline by comprehensive two-dimensional gas chromatography (GC &#215; GC) coupled with a nitrogen chemiluminescence detector (NCD). In a second step the on-line analysis method was developed and tested on a steam cracking pilot plant by feeding pyridine dissolved in heptane. The former being a representative compound for one of the most abundant classes of compounds present in shale oil. The composition of the reactor effluent was determined via an in-house developed automated sampling system followed by immediate injection of the sample on a GC &#215; GC coupled with a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS), flame ionization detector (FID) and NCD. A novel method for quantitative analysis of nitrogen containing compounds using NCD and 2-chloropyridine as an internal standard has been developed and demonstrated.

A method combining comprehensive two-dimensional gas chromatography with nitrogen chemiluminescence detection has been developed and applied to on-line analysis of nitrogen containing compounds in a complex hydrocarbon matrix.

ניתוח אונליין של חנקן המכיל תרכובות ב מטריצות פחמימן Complex

The shift to heavy crude oils and the use of alternative fossil resources such as shale oil are a challenge for the petrochemical industry. The ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

באמצעות אלקטרופורזה נימים לכמת חומצות אורגניות מרקמות צמח: מקרה מבחן בחינה<em&gt; קפה ערביקה</em&gt; זרעים

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Raman and IR Spectroelectrochemical Methods as Tools to Analyze Conjugated Organic Compounds

In the presented work, two spectroelectrochemical techniques are discussed as tools for the analysis of the structural changes occurring in the molecule on the vibrational level of energy. Raman and IR spectroelectrochemistry can be used for advanced characterization of the structural changes in the organic electroactive compounds. Here, the step-by-step analysis by means of Raman and IR spectroelectrochemistry is shown. Raman and IR spectroelectrochemical techniques provide complementary information about structural changes occurring during an electrochemical process, i.e. allows for the investigation of redox processes and their products. The examples of IR and Raman spectroelectrochemical analysis are presented, in which the products of the redox reactions, both in solution and solid state, are identified.

A protocol of step-by-step Raman and IR spectroelectrochemical analysis is presented.

ראמאן ושיטות IR Spectroelectrochemical ככלים לניתוח מצומדת תרכובות אורגניות

In the presented work, two spectroelectrochemical techniques are discussed as tools for the analysis of the structural changes occurring in the molecule ...

Using Cyclic Voltammetry, UV-Vis-NIR, and EPR Spectroelectrochemistry to Analyze Organic Compounds

Cyclic voltammetry (CV) is a technique used in the analysis of organic compounds. When this technique is combined with electron paramagnetic resonance (EPR) or ultraviolet-visible and near-infrared (UV-Vis-NIR) spectroscopies, we obtain useful information such as electron affinity, ionization potential, band-gap energies, the type of charge carriers, and degradation information that can be used to synthesize stable organic electronic devices. In this study, we present electrochemical and spectroelectrochemical methods to analyze the processes occurring in active layers of an organic device as well as the generated charge carriers.

In this article, we describe electrochemical, electron paramagnetic resonance, and ultraviolet-visible and near-infrared spectroelectrochemical methods to analyze organic compounds for application in organic electronics.

באמצעות וולטמטריה ציקלית, UV-Vis-ניר EPR Spectroelectrochemistry לנתח תרכובות אורגניות

Cyclic voltammetry (CV) is a technique used in the analysis of organic compounds. When this technique is combined with electron paramagnetic resonance ...

Electrophoretic Crystallization of Ultrathin High-performance Metal-organic Framework Membranes

We report the synthesis of thin, highly intergrown, polycrystalline metal-organic framework (MOF) membranes on a wide range of unmodified porous and non-porous supports (polymer, ceramic, metal, carbon, and graphene). We developed a novel crystallization technique, which is termed the ENACT approach: the electrophoretic nuclei assembly for the crystallization of highly intergrown thin films (ENACT). This approach allows for a high density of heterogeneous nucleation of MOFs on a chosen substrate via the electrophoretic deposition (EPD) directly from the precursor sol. The growth of well-packed MOF nuclei leads to a highly intergrown polycrystalline MOF film. We show that this simple approach can be used for the synthesis of thin, intergrown zeolite imidazole framework (ZIF)-7 and ZIF-8 films. The resulting 500 nm-thick ZIF-8 membranes show a considerably high H2 permeance (8.3 x 10-6 mol m-2 s-1 Pa-1) and ideal gas selectivities (7.3 for H2/CO2, 15.5 for H2/N2, 16.2 for H2/CH4, and 2655 for H2/C3H8). An attractive performance for C3H6/C3H8 separation is also achieved (a C3H6 permeance of 9.9 x 10-8 mol m-2 s-1 Pa-1 and a C3H6/C3H8 ideal selectivity of 31.6 at 25 &#176;C). Overall, the ENACT process, owing to its simplicity, can be extended to synthesize intergrown thin films of a wide range of nanoporous crystalline materials.

A simple, reproducible, and versatile approach for the synthesis of intergrown, polycrystalline metal-organic framework membranes on a wide range of unmodified porous and non-porous supports is presented.

התגבשות electrophoretic של ממברנות זגוגית ביצועים גבוהים מסגרת מתכת-אורגני

We report the synthesis of thin, highly intergrown, polycrystalline metal-organic framework (MOF) membranes on a wide range of unmodified porous and ...

Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds

Caged compounds enable the photo-mediated manipulation of the cell physiology with high spatiotemporal resolution. However, the limited structural diversity of currently available caging groups and the difficulties in synthetic modification without sacrificing their photolysis efficiencies are obstacles to expanding the repertoire of caged compounds for live cell applications. As the chemical modification of coumarin-type photo-caging groups is a promising approach for the preparation of caged compounds with diverse physical and chemical properties, we report a method for the synthesis of clickable caged compounds that can be modified easily with various functional units via the copper(I)-catalyzed Huisgen cyclization. The modular platform molecule contains a (6-bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl)methyl (Bhc) group as a photo-caging group, which exhibits a high photolysis efficiency compared to those of the conventional 2-nitrobenzyls. General procedures for the preparation of clickable caged compounds containing amines, alcohols, and carboxylates are presented. Additional properties such as the water solubility and cell targeting ability can be readily incorporated into clickable caged compounds. Furthermore, the physical and photochemical properties, including the photolysis quantum yield, were measured and were found to be superior to those of the corresponding Bhc caged compounds. The described protocol could therefore be considered a potential solution for the lack of structural diversity in the available caged compounds.

A protocol for the synthesis and measurement of the photochemical properties of modular caged compounds with clickable moieties is presented.