Nous remercions le regretté Dr Norm Taylor, Département des plantes et de la science du sol à l&#39;Université du Kentucky, pour nous permettre d&#39;utiliser des échantillons de ses parcelles de trèfle rouge pour cette étude. Ce projet a été financé par le ministère de l&#39;Agriculture des États-Unis.

Une. Préparation de l&#39;extrait de la plante <ol><li> Voir Kagan et Flythe 10 pour l&#39;extraction des composés phénoliques de Trifolium pratense cv. Kenland. </li><li> Pour extraire d&#39;autres composés dans d&#39;autres usines, consultez la documentation de l&#39;analyse phytochimique des méthodes d&#39;extraction de plantes ou spécifique-métabolites (beaucoup sont décrits), ou chercher des protocoles tels que ceux de Khurram et al. 7,8 qui isolent de nombreux composés d&#39;un grand gamme de polarités. </li></ol> 2. Préparation de couche mince Plaques <ol><li> Nettoyer les plaques de CCM par le développement dans un ou plusieurs solvants polaires neutres, afin de déplacer les contaminants adsorbés hors de la zone de développement. <ol><li> Dans une hotte de laboratoire, préparer suffisamment de solvant de nettoyage (par exemple 15 à 100 ml d&#39;acétate d&#39;éthyle-méthanol 2:1, v / v) pour couvrir le fond de la chambre de développement TLC, ainsi que le bord inférieur d&#39;une plaque de CCM lors de consigne à l&#39;intérieur de la chambre. </li><li> Utilisez comverre ment disponible TLC développer chambres (différentes tailles disponibles, avec des couvercles) ou béchers en pyrex recouvert de papier aluminium ou bocaux. </li><li> Utilisez des ciseaux pour couper (flexibles) des plaques de gel de silice en plastique à des créances, qui viennent dans différentes tailles (20 cm x 20 cm et plus petits), pour s&#39;adapter à la chambre de développement disponible en aluminium ou. (Attention: la silice peut provoquer une atteinte des poumons en cas d&#39;inhalation Travailler dans une hotte, et manipuler des plaques de CCM avec des gants pour éviter d&#39;avoir des huiles de la peau sur la silice..) </li><li> Insérez les plaques dans la chambre, avec les sommets appuyé contre les parois de la chambre. Elles ne doivent pas se toucher. Couvrir la chambre et laissez le solvant déplacer la plaque par capillarité. </li><li> Lorsque le solvant a atteint le sommet des plaques, enlever les plaques de la chambre et les disposer dans une position debout dans la hotte jusqu&#39;à évaporation du solvant. </li><li> Vérifiez si des impuretés ont migré vers le haut de la plaque de CCM par la recherche d&#39;une bande jaune sous visiblelumière, ou une bande fluorescente sous rayonnement ultraviolet (UV) (voir le «front d&#39;impureté&quot; ou SI sur la figure 2B). Si la majorité de la plaque a encore une teinte jaunâtre, répétez le processus de nettoyage. </li><li> Après avoir enlevé les plaques CCM de la chambre, jeter le solvant. Laisser le solvant résiduel s&#39;évaporer complètement avant d&#39;utiliser la chambre pour le protocole 2. </li><li> Pour éliminer l&#39;humidité résiduelle qui peut affecter la migration des composés de silice 16, prop les plaques en position verticale dans un four de séchage à 100 ° C (10-15 min pour un 20 cm x 20 cm plaque, et 5 min pour 7 cm x 10 cm plaques ). </li><li> Si un séchage à l&#39;étuve à 100 ° C n&#39;est pas disponible, les plaques de chaleur pour une période de temps plus longue à des températures plus basses (par exemple 40 min à 60 ° C). </li><li> Après que les plaques sont sèches, les laisser refroidir à température ambiante avant de le charger. </li></ol></li></ol> 3. Préparation de développement Chambers pour Extrait séparation <ol&gt; <li> Utilisez des ciseaux pour couper un morceau de papier filtre légèrement en dessous de la hauteur de la chambre, et environ la moitié du périmètre de la chambre de largeur. Ce papier agit comme une mèche pour tirer solvant jusqu&#39;à la paroi de la chambre et de saturer la chambre avec les vapeurs de solvant et d&#39;améliorer ainsi la reproductibilité des séparations 1. </li><li> Dans une hotte, mélanger de solvants (acétate d&#39;éthyle-méthanol 4:1, v / v, pour cette étude). Verser le mélange de solvant dans la chambre et couvrir. Attendez jusqu&#39;à ce que toute la mèche est mouillée avec un solvant, ce qui indique la saturation de la chambre, de mettre des plaques dans la chambre. </li></ol> 4. Chargement en cours et le développement de Plaques CCM <ol><li> Légèrement marquer l&#39;origine avec un crayon. Si la plaque adsorbant TLC est tendre et fragile, des notes sur les bords. Les composés doivent être au-dessus de la surface du solvant de développement lorsque les plaques sont insérées dans la chambre de TLC. </li><li> Dissoudre les extraits dans suffisamment de solvant organique (en l&#39;occurrence, le methanol) à une solution concentrée à la place d&#39;un troublesuspension. </li><li> Charger les échantillons et les normes que des bandes étroites avec une seringue microlitre ou micropipettes capillaires, laissant un 1 cm frontière sur les côtés de la plaque. Laissez les bandes sécher (attisant la plaque ou le charger dans une hotte aide). </li><li> Si une plus grande concentration de l&#39;échantillon est nécessaire sur une plaque, &quot;overspot» en chargeant des échantillons de nouveau sur les bandes séchées. </li><li> Avec des pinces ou des pinces, la plaque de fixation (s) à l&#39;intérieur de la chambre TLC saturé. Elles ne doivent pas toucher la mèche, car il peut fournir solvant pour les plaques aux points de contact, modifiant ainsi le chemin de la migration de composé. Couvrez et laissez chambre plaques se développent. </li></ol> 5. Préparation des plaques pour les essais biologiques <ol><li> Retirer la plaque (s) de réservoir CCM avant le front de solvant atteigne le haut de la plaque, et marquer la hauteur du front de solvant avec un crayon. Laissez plaque sèche dans une hotte. <ol><li> Développer des plaques de CCM restant dans la même chambre TLC, qui est geralement utilisable pour une journée entière si gardé fermé. Refaire un mélange de solvants pour chromatographie sur couche mince chambre si la quantité de solvant dans la chambre diminue notablement. </li></ol></li><li> Après plaques sont sèches, visualiser les bandes à la lumière visible ou UV, et de délimiter les bandes avec un crayon. Une chambre d&#39;observation avec une lampe UV portable est pratique, surtout si la lampe peut détecter des composés à la fois 254 nm (ondes courtes UV) et 365 nm (longueur d&#39;onde UV). Remarque: À ce stade ou après la prochaine étape, les plaques peuvent être enveloppés dans une pellicule de plastique, recouverts d&#39;une feuille, et conservés à -20 ° C. Durée maximale de conservation dépend de la stabilité de composé. Parce que la silice n&#39;est pas neutre, certains composés peuvent se dégradent tandis que sur la plaque de CCM. </li><li> Photographier ou dessiner plaques. <ol><li> Utilisez un système de gel photodocumentation si une équipée d&#39;UV-dessus et / ou les lumières visibles est disponible. </li><li> Si aucun système d&#39;photodocumentation commerciale est disponible, plaques de photographie à l&#39;intérieur d&#39;une boîte doublés de papier noir ou tissu, wie Un jeu de caméra sur un trépied et une lumière UV portable bloqué à un support annulaire 17. Lorsque vous photographiez des plaques qui n&#39;ont pas un indicateur fluorescent, utiliser un filtre de la lumière bleue sur la lentille de la caméra pour améliorer l&#39;apparence de la bande 17. </li></ol></li><li> Pour aider à la caractérisation des bandes, calculer le facteur de rétention (Rf) en mesurant les valeurs de distances parcourues par le composé et le front de solvant, et en divisant la première par la seconde (Figure 2A). </li></ol> 6. Culture bactérienne et dosage <ol><li> Préparer et inoculer médias dans des conditions anaérobies. La culture utilisée dans ce cas était Clostridium sticklandii souche SR, qui a été obtenu à partir de la collection de cultures de James B. Russell, Cornell University, Ithaca, NY. <ol><li> Voir Flythe et Kagan 13 et la liste des matériaux pour une description des HAB médias. </li></ol></li><li> Cultiver la culture à la phase exponentielle ou stationnaire. Utilisez anaérobie techniqu stérilees lorsqu&#39;on travaille avec des micro-organismes anaérobies. </li><li> Inoculer la culture (1% v / v) dans de la gélose en fusion après que la température de la gélose (0,75% p / v) a diminué à moins de 60 ° C. Mélanger délicatement et mettre immédiatement dans une chambre anaérobie (95% de CO 2 -5% H 2 atmosphère HAB médias) à verser. </li><li> Verser dans 15 mm x 100 mm en plastique des boîtes de Petri, et laisser se solidifier. </li><li> Avec des ciseaux, couper la plaque de CCM dans les zones contenant groupe (s) d&#39;intérêt. Lay bandes face vers le bas sur des plaques d&#39;agar-agar, le marquage des bandes sur le support de plaque pour garder une trace de l&#39;orientation originale sur plaque de CCM. Posez une bande TLC utilisé sur une plaque de gélose en tant que témoin. </li><li> Incuber les boîtes de gélose, côté agar en bas, dans la chambre anaérobie (24 h, 39 ° C). </li></ol> 7. Visualisation de testées biologiquement plaques de gélose <ol><li> Avec une pince, enlever les bandes à partir de plaques de gélose pendant qu&#39;ils sont dans la chambre anaérobie. </li><li> Ajouter 1% (p / v) tetrazolium rouge, préparée dans de l&#39;eau, goutte à goutte sur les surfaces des plaques de gélose. Laisser la coloration se développer pendant au moins 20 minutes, ou jusqu&#39;à ce que la plaque de commande tourne complètement rouge, avant de retirer de la chambre anaérobie. Les bactéries anaérobies commencent à perdre leur viabilité immédiatement après le retrait de la chambre anaérobie, mais la couleur est stable pendant plus de 24 heures. </li><li> Photographier à la lumière visible. </li></ol>

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La mention de noms commerciaux ou de produits commerciaux dans l&#39;article est uniquement dans le but de fournir des informations spécifiques et n&#39;implique pas une recommandation ou une approbation par l&#39;USDA. Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Ce protocole décrit un procédé simple pour la séparation d&#39;un extrait en sous-ensembles de composés et de dosage de ces sous-ensembles contact par bioautographie. Le procédé est tout à fait similaire à celui utilisé par Chomnawang et al. 15 pour cribler des inhibiteurs de métabolites de plantes à des bactéries responsables de la gonorrhée. Le type de bioautographie employé à l&#39;écran pour les composés de plantes antimicrobiens dépend de nombreux facteurs, y compris la micro-...

Le dosage de composés antimicrobiens dans des plantes nécessite la séparation des constituants d&#39;un extrait de plante, l&#39;exposition d&#39;un micro-organisme d&#39;essai à ces composants, et pour déterminer si la croissance du micro-organisme est inhibée par l&#39;un quelconque des composés. Séparations par papier ou chromatographie sur couche mince (CCM ou PC) sont pratiques car de nombreux composés peuvent être séparés sur une surface plane. La séparation est basée sur la polarité, avec des composés de liaison étanche à l&#39;adsorbant (cellulose dans le cas de PC, et une variété d&#39;adsorbants dans le cas de la Chromatographie sur couche mince) et la migration de moins que les autres une. Figure 1 donne un exemple de la position relative des des composés phénoliques polaires et non polaires après la séparation sur une plaque de TLC de silice. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51411/51411fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51411/51411fig1.jpg" /> Figure 1. Diagramme illustrant la répartition des composés de polarités différentes après la séparation sur une couche mince de silice chromatographique (CCM) plaque. Composés phénoliques de trèfle rouge (Trifolium pratense L.) sont utilisés comme un exemple. Des composés polaires tels que le clovamide, ont une forte affinité pour un adsorbant polaire comme le silice et restent près de l&#39;origine (OR), alors que moins de composés polaires, tels que les trois isoflavones près du front de solvant (SF), partition plus facilement dans les solvants (qui sont moins polaires que la silice à moins que l&#39;eau, des acides ou des bases sont incluses) et de migrer plus haut sur la plaque. Après séparation de l&#39;extrait sur ​​une plaque de CCM, les micro-organismes d&#39;essai peuvent être exposés à tous les composés de la plaque, en accélérant ainsi l&#39;identification des composants actifs de l&#39;extrait 2. Si une culture fongique ou bactérienne est exposé au chromatogramme, la croissance microbienne se produit partout sauf sur les zones où la croissance inhibiteurcomposés y. Zones d&#39;inhibition peuvent ensuite être visualisées en observant le contraste entre la croissance du mycélium et les zones de libre-croissance si les champignons ont été appliquées 3 ou par pulvérisation avec des composés qui changent de couleur lorsqu&#39;ils sont réduits ou hydrolysé par des cellules vivantes 4. Bien que l&#39;utilisation de papier ou couche mince chromatogrammes pour les tests antimicrobiens a été d&#39;abord appliquée aux antibiotiques et fongicides 5 3,6, extraits de plantes sont maintenant souvent masqués pour les composés antimicrobiens avec cette méthode, souvent appelés bioautographie. Les protocoles décrits ici s&#39;appliquent à bioautographie de chromatogrammes en couche mince. TLC est largement utilisé parce qu&#39;il est relativement rapide et peut être effectué sur les différents adsorbants (par exemple, la silice, l&#39;amidon, l&#39;alumine), ainsi que de fournir une bonne résolution et une sensibilité. Les extraits de plantes peuvent être préparés pour TLC dans de nombreuses façons. Les méthodes courantes comprennent le matériel végétal extraction dans alcdes mélanges tels que l&#39;éthanol à 80% 7,8, éventuellement avec l&#39;addition d&#39;acide ou de base 9 ohol à l&#39;eau. Suite à une extraction dans de tels solvants, qui contiennent un peu d&#39;eau et sont peut-être acide ou basique, les extraits doivent être concentrées de sorte qu&#39;ils peuvent être appliqués à des plaques de CCM dans un volume minimal. La concentration des extraits d&#39;alcool dans l&#39;eau peut être obtenue en divisant l&#39;aide de solvants organiques non miscibles à l&#39;eau 8 ou avec un mélange de tels solvants, tels que l&#39;éther éthylique-acétate d&#39;éthyle (1:1, v / v) 10,11. Métabolites de plantes différentes sont extraits dans différents solvants organiques, en fonction de leur polarité. Pour s&#39;assurer que les acides ou les bases organiques végétaux sont extraits dans des solvants organiques, à ce stade, le pH d&#39;un extrait d&#39;alcool dans l&#39;eau peut être élevé ou abaissé avec un acide ou une base soluble dans l&#39;eau pour convertir les analytes dissociées en leurs formes non dissociée, qui sont ensuite soluble dans les solvants organiques neutres 9. La phase organique peut alors être evaporated sous pression réduite ou sous atmosphère d&#39;azote et on ajuste le volume souhaité pour la CCM. Le pH de l&#39;extrait est peu susceptible d&#39;être létale pour les micro-organismes dans les essais biologiques en raison de la séparation des analytes dans des solvants neutres, petit volume final, et l&#39;évaporation de l&#39;extrait sur la plaque de CCM avant la séparation. Les champignons et les bactéries sont utilisées comme des micro-organismes d&#39;essai dans bioautographie d&#39;extraits de plantes 2. Les spores de certains champignons tels que Cladosporium cucumerinum, germent sur ​​des plaques de CCM (en dehors des zones avec des composés inhibiteurs) si pulvérisée sur les plaques dans une solution nutritive et on les incube dans un environnement humide pendant plusieurs jours 3. Le mycélium foncé de C. cucumerinum sur les zones non inhibitrice offre un contraste frappant avec les zones franches de la croissance du mycélium. Bien que les bactéries ont été appliquées à une Chromatographie sur couche mince (CCM) des plaques de la même manière 4,12, les bactéries sont également versé sur TLCsurfaces de la plaque de gélose superpositions 13,14. Levure, telle que Candida albicans, peut être appliquée dans les superpositions de gélose ainsi 14. Alternativement, des plaques de CCM peuvent être placés face vers le bas sur une gélose inoculée avec des bactéries ou des levures 10,15 8, un procédé connu sous le nom de contact bioautographie 2. Nous décrivons une méthode pour le contact bioautographie pour cribler des composés phénoliques antimicrobiens du trèfle rouge (Trifolium pratense cv. Kenland). Le micro-organisme test est Clostridium sticklandii, une bactérie du rumen hyper ammoniac-production (HAB) et obliger anaérobie. Bien que les séparations utilisées ne résolvent pas tous les composants de l&#39;extrait, elles facilitent l&#39;identification des zones d&#39;activité antimicrobienne, réduisant ainsi la piscine de composés antimicrobiens possibles. Le protocole utilise des procédures standard pour la CCM 1. Le protocole décrit également certaines des techniques requises pour la culture obligationsgrille anaérobies pour un tel essai, l&#39;utilisation d&#39;un bio-autographie de contacts 15 et un procédé de visualisation avec un sel de tétrazolium, qui colore les cellules vivantes 2,4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="739">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 &#215; 20 cm</td>
			<td>EMD Chemicals&#160;</td>
			<td>5554/7</td>
			<td>These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm.&#160; Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background.&#160; Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka.&#160; Adsorbents other than silica may be needed.&#160; Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp, heavy-duty scissors&#160;</td>
			<td>any sewing supply company</td>
			<td>similar to Fiskars&#160; 175800-1002</td>
			<td>For cutting TLC plates.&#160; A paper cutter with a sharp blade can be used as well.&#160; Do not inhale silica dust.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying oven at 100 &#176;C (mechanical convection)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR305225M</td>
			<td>Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC chamber</td>
			<td>Kimble Chase&#160;</td>
			<td>416180-0000</td>
			<td>Alternative sources:&#160; Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 &#215; 10 cm).&#160; Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-&#181;L syringe with flat needle tip</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80965</td>
			<td>For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 &#181;L.&#160; Alternative sources are equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipets</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>2-000-001</td>
			<td>For loading small amounts of standards or samples.&#160; Alternative sources:&#160; VWR.&#160; Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (#1 grade)</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001 917</td>
			<td>Serves as a chamber wick.&#160; Other grades of filter paper are OK.&#160; This size can be trimmed for the chambers holding 20 &#215; 20 cm plates.&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker tongs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-186</td>
			<td>For putting plates in and out of a large TLC chamber.&#160; Alternate sources: VWR&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-edge forceps&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-275</td>
			<td>For putting plates in and out of a small chamber.&#160;&#160; Alternate sources: VWR&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small portable UV lamp with 4-Watt or 6-Watt bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively)</td>
			<td>Ultraviolet Products&#160;</td>
			<td>95-0271-01</td>
			<td>Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp</td>
			<td>Ultraviolet Products&#160;</td>
			<td>Chromato-Vue C-10E</td>
			<td>UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here.&#160; Alternate sources: Spectronics Corporation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp</td>
			<td>Kodak&#160;</td>
			<td>Gel Logic 200</td>
			<td>&#160;Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com).&#160; See protocol for homemade alternative.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl</td>
			<td>Coy&#160;</td>
			<td>7150000</td>
			<td>This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. &#160;However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay.&#160; A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ingredients for HAB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxamine &#183; 2 HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9380</td>
			<td>For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium D-Pantothenate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipoic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Aminobenzoic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalamine&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron sulfate &#183; 7 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate &#183; 7 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride &#183; 4 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt chloride &#183; 6 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper chloride &#183; 2 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride &#183; 6 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate &#183; 2 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>331058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Trypticase (Pancreatic digest of casein)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>B11921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium carbonate &#183; H2O&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50841063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate &#183; 6 H2O</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride &#183; 2 H2O</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine HCl</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>19464780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thin-layer chromatographic (tlc) separations and bioassays of plant extracts to identify antimicrobial compounds

Un écran commun pour les composés antimicrobiens de plantes consiste en la séparation d&#39;extraits de plantes en papier ou en chromatographie sur couche mince (PC ou TLC), ce qui expose les chromatogrammes de suspensions microbiennes (par exemple, de champignons ou de bactéries dans un bouillon ou la gélose), laissant du temps pour les microbes de se développer en un environnement humide, et la visualisation des zones de pas de croissance microbienne. L&#39;efficacité de cette méthode de dépistage, connu sous le nom bioautographie, dépend à la fois de la qualité de la séparation chromatographique et le soin apporté aux conditions de cultures microbiennes. Ce document décrit les protocoles standards pour la CCM et le contact bioautographie avec une nouvelle application aux acides des bactéries d&#39;acide de fermentation. L&#39;extrait est séparé sur flexibles (support aluminium) des plaques de CCM de silice, et les bandes sont visualisées sous lumière ultraviolette (UV). Les zones sont découpées et incubées visage vers le bas sur de la gélose inoculé avec le micro-organisme d&#39;essai. Bandes inhibitrices sont visualisés par coloration de la plaque de géloses avec tétrazolium rouge. Le procédé est appliqué à la séparation de trèfle rouge (Trifolium pratense cv. Kenland) des composés phénoliques et leur criblage pour l&#39;activité contre Clostridium sticklandii, une bactérie produisant de l&#39;ammoniac hyper (HAB) qui est natif de la panse de bovin. Les procédés de CCM s&#39;appliquent à de nombreux types d&#39;extraits de plantes et d&#39;autres espèces bactériennes (aérobie ou anaérobie), ainsi que les champignons, peuvent être utilisés comme organismes d&#39;essai, si les conditions de culture sont modifiées pour être compatibles avec les exigences de l&#39;espèce de croissance.

Représentant séparations TLC de silice de trèfle rouge (Trifolium pratense cv. Kenland) d&#39;extraits, contenant des composés phénoliques, sont présentés dans la figure 2. Séparation de l&#39;extrait de trèfle rouge dans l&#39;acétate d&#39;éthyle-hexane (9:1, v / v), plus de 8,5 cm, a donné cinq bandes, une incomplètement résolu à partir de l&#39;origine (figure 2A). Cependant, la figure 2B montre que près de deux fois plus de bandes ont été...

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Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Des méthodes sont décrites pour chromatographie sur couche mince (CCM) la séparation d&#39;extraits de plantes et le contact bioautographie pour identifier les métabolites antibactériens. Les méthodes sont appliquées à la sélection de composés phénoliques de trèfle rouge inhibant les bactéries hyper-production d&#39;ammoniac (HAB) originaires de la panse de bovin.

Mince couche chromatographique (CCM) Séparations et essais biologiques d&#39;extraits végétaux pour identifier des composés antimicrobiens

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

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Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

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67.3K vues.  United States Department of Agriculture.  Des méthodes sont décrites pour chromatographie sur couche mince (CCM) la séparation d'extraits de plantes et le contact bioautographie pour identifier les métabolites antibactériens. Les méthodes sont appliquées à la sélection de composés phénoliques de trèfle rouge inhibant les bactéries hyper-production d'ammoniac (HAB) originaires de la panse de bovin. 

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Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune system that is protective against pathogenic microbes. Abnormal sebum production and chemical composition are also a clinical symptom of specific skin diseases. Sebum contains a complex mixture of lipids, including triacylglycerides, which is species-specific. The broad chemical properties exhibited by diverse lipid classes hinder the specific determination of sebum composition. Analytical techniques for lipids typically require chemical derivatizations that are labor-intensive and increase sample preparation costs. This paper describes how to extract lipids from mammalian integument, separate broad lipid classes by thin-layer chromatography, and profile the triacylglyceride contents using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. This robust method enables a direct determination of the triacylglyceride profiles among species and individuals, and it can be readily applied to any taxonomic group of mammals.

Mammalian integument contains solvent-extractable lipids that can provide chemical compositions characteristic of individual species. This paper presents a routine method for separating broad lipid classes isolated from integumentary tissues using thin layer chromatography and determining the triacylglyceride profile by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.

Profilage des matières triacylglycéride à Bat tégumentaire lipides par chromatographie sur couche mince préparative et MALDI-TOF spectrométrie de masse

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

Recherche

Chimie

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic isotopes are typically incorporated metabolically to improve the sensitivity and allow for sequential resonance assignment. Reductive 13C-methylation is an alternative labeling method for proteins that are not amenable to bacterial host over-expression, the most common method of isotope incorporation. Reductive 13C-methylation is a chemical reaction performed under mild conditions that modifies a protein&#39;s primary amino groups (lysine &#949;-amino groups and the N-terminal &#945;-amino group) to 13C-dimethylamino groups. The structure and function of most proteins are not altered by the modification, making it a viable alternative to metabolic labeling. Because reductive 13C-methylation adds sparse, isotopic labels, traditional methods of assigning the NMR signals are not applicable. An alternative assignment method using mass spectrometry (MS) to aid in the assignment of protein 13C-dimethylamine NMR signals has been developed. The method relies on partial and different amounts of 13C-labeling at each primary amino group. One limitation of the method arises when the protein&#39;s N-terminal residue is a lysine because the &#945;- and &#949;-dimethylamino groups of Lys1 cannot be individually measured with MS. To circumvent this limitation, two methods are described to identify the NMR resonance of the 13C-dimethylamines associated with both the N-terminal &#945;-amine and the side chain &#949;-amine. The NMR signals of the N-terminal &#945;-dimethylamine and the side chain &#949;-dimethylamine of hen egg white lysozyme, Lys1, are identified in 1H-13C heteronuclear single-quantum coherence spectra.

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Two methods for assigning the &#945;- and &#949;-dimethylamine nuclear magnetic resonance signals of a reductively 13C-methylated N-terminal lysine are described. One method utilizes the pH-induced selectivity of the reductive methylation reaction, and the other uses aminopeptidase to selectively remove the N-terminal lysine.

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

Analysis of Volatile and Oxidation Sensitive Compounds Using a Cold Inlet System and Electron Impact Mass Spectrometry

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The analysis of volatile and oxidation sensitive compounds by mass spectrometry is not easily achieved, as all state-of-the-art mass spectrometric methods require at least one sample preparation step, e.g., dissolution and dilution of the analyte (electrospray ionization), co-crystallization of the analyte with a matrix compound (matrix-assisted laser desorption/ionization), or transfer of the prepared samples into the ionization source of the mass spectrometer, to be conducted under atmospheric conditions. Here, the use of a sample inlet system is described which enables the analysis of volatile metal organyls, silanes, and phosphanes using a sector field mass spectrometer equipped with an electron impact ionization source. All sample preparation steps and the sample introduction into the ion source of the mass spectrometer take place either under air-free conditions or under vacuum, enabling the analysis of compounds highly susceptible to oxidation. The presented technique is especially of interest for inorganic chemists, working with metal organyls, silanes, or phosphanes, which have to be handled using inert conditions, such as the Schlenk technique. The principle of operation is presented in this video.

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The presented technique is especially of interest for inorganic chemists, working with metal organyls, silanes, or phosphanes which have to be handled using inert conditions, such as the Schlenk technique.

L&#39;analyse des composés volatils et sensibles oxydation en utilisant un système à froid d&#39;entrée et impact électronique spectrométrie de masse

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Le séquençage de l&#39;usine mur hétéroxylanes Utilisation enzymatique, chimique (méthylation) et physiques (spectrométrie de masse, résonance magnétique nucléaire) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

On-line Analysis of Nitrogen Containing Compounds in Complex Hydrocarbon Matrixes

The shift to heavy crude oils and the use of alternative fossil resources such as shale oil are a challenge for the petrochemical industry. The composition of heavy crude oils and shale oils varies substantially depending on the origin of the mixture. In particular they contain an increased amount of nitrogen containing compounds compared to the conventionally used sweet crude oils. As nitrogen compounds have an influence on the operation of thermal processes occurring in coker units and steam crackers, and as some species are considered as environmentally hazardous, a detailed analysis of the reactions involving nitrogen containing compounds under pyrolysis conditions provides valuable information. Therefore a novel method has been developed and validated with a feedstock containing a high nitrogen content, i.e., a shale oil. First, the feed was characterized offline by comprehensive two-dimensional gas chromatography (GC &#215; GC) coupled with a nitrogen chemiluminescence detector (NCD). In a second step the on-line analysis method was developed and tested on a steam cracking pilot plant by feeding pyridine dissolved in heptane. The former being a representative compound for one of the most abundant classes of compounds present in shale oil. The composition of the reactor effluent was determined via an in-house developed automated sampling system followed by immediate injection of the sample on a GC &#215; GC coupled with a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS), flame ionization detector (FID) and NCD. A novel method for quantitative analysis of nitrogen containing compounds using NCD and 2-chloropyridine as an internal standard has been developed and demonstrated.

A method combining comprehensive two-dimensional gas chromatography with nitrogen chemiluminescence detection has been developed and applied to on-line analysis of nitrogen containing compounds in a complex hydrocarbon matrix.

Analyse en ligne de composés azotés dans les Matrices d&#39;hydrocarbures complexes

The shift to heavy crude oils and the use of alternative fossil resources such as shale oil are a challenge for the petrochemical industry. The ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Utilisation de l&#39;électrophorèse capillaire à Quantifier acides organiques à partir de tissus végétaux: Un cas de test d&#39;examen<em&gt; Coffea Arabica</em&gt; Graines

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Raman and IR Spectroelectrochemical Methods as Tools to Analyze Conjugated Organic Compounds

In the presented work, two spectroelectrochemical techniques are discussed as tools for the analysis of the structural changes occurring in the molecule on the vibrational level of energy. Raman and IR spectroelectrochemistry can be used for advanced characterization of the structural changes in the organic electroactive compounds. Here, the step-by-step analysis by means of Raman and IR spectroelectrochemistry is shown. Raman and IR spectroelectrochemical techniques provide complementary information about structural changes occurring during an electrochemical process, i.e. allows for the investigation of redox processes and their products. The examples of IR and Raman spectroelectrochemical analysis are presented, in which the products of the redox reactions, both in solution and solid state, are identified.

A protocol of step-by-step Raman and IR spectroelectrochemical analysis is presented.

Raman et IR spectroélectrochimiques méthodes comme outils pour analyser les composés organiques conjugués

In the presented work, two spectroelectrochemical techniques are discussed as tools for the analysis of the structural changes occurring in the molecule ...

Using Cyclic Voltammetry, UV-Vis-NIR, and EPR Spectroelectrochemistry to Analyze Organic Compounds

Cyclic voltammetry (CV) is a technique used in the analysis of organic compounds. When this technique is combined with electron paramagnetic resonance (EPR) or ultraviolet-visible and near-infrared (UV-Vis-NIR) spectroscopies, we obtain useful information such as electron affinity, ionization potential, band-gap energies, the type of charge carriers, and degradation information that can be used to synthesize stable organic electronic devices. In this study, we present electrochemical and spectroelectrochemical methods to analyze the processes occurring in active layers of an organic device as well as the generated charge carriers.

In this article, we describe electrochemical, electron paramagnetic resonance, and ultraviolet-visible and near-infrared spectroelectrochemical methods to analyze organic compounds for application in organic electronics.

À l’aide de voltampérométrie cyclique, UV-Vis-NIR et EPR spectroélectrochimie pour analyser les composés organiques

Cyclic voltammetry (CV) is a technique used in the analysis of organic compounds. When this technique is combined with electron paramagnetic resonance ...

Electrophoretic Crystallization of Ultrathin High-performance Metal-organic Framework Membranes

We report the synthesis of thin, highly intergrown, polycrystalline metal-organic framework (MOF) membranes on a wide range of unmodified porous and non-porous supports (polymer, ceramic, metal, carbon, and graphene). We developed a novel crystallization technique, which is termed the ENACT approach: the electrophoretic nuclei assembly for the crystallization of highly intergrown thin films (ENACT). This approach allows for a high density of heterogeneous nucleation of MOFs on a chosen substrate via the electrophoretic deposition (EPD) directly from the precursor sol. The growth of well-packed MOF nuclei leads to a highly intergrown polycrystalline MOF film. We show that this simple approach can be used for the synthesis of thin, intergrown zeolite imidazole framework (ZIF)-7 and ZIF-8 films. The resulting 500 nm-thick ZIF-8 membranes show a considerably high H2 permeance (8.3 x 10-6 mol m-2 s-1 Pa-1) and ideal gas selectivities (7.3 for H2/CO2, 15.5 for H2/N2, 16.2 for H2/CH4, and 2655 for H2/C3H8). An attractive performance for C3H6/C3H8 separation is also achieved (a C3H6 permeance of 9.9 x 10-8 mol m-2 s-1 Pa-1 and a C3H6/C3H8 ideal selectivity of 31.6 at 25 &#176;C). Overall, the ENACT process, owing to its simplicity, can be extended to synthesize intergrown thin films of a wide range of nanoporous crystalline materials.

A simple, reproducible, and versatile approach for the synthesis of intergrown, polycrystalline metal-organic framework membranes on a wide range of unmodified porous and non-porous supports is presented.

Cristallisation électrophorétique des Membranes ultraminces cadre métallo-organiques de haute performance

We report the synthesis of thin, highly intergrown, polycrystalline metal-organic framework (MOF) membranes on a wide range of unmodified porous and ...

Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds

Caged compounds enable the photo-mediated manipulation of the cell physiology with high spatiotemporal resolution. However, the limited structural diversity of currently available caging groups and the difficulties in synthetic modification without sacrificing their photolysis efficiencies are obstacles to expanding the repertoire of caged compounds for live cell applications. As the chemical modification of coumarin-type photo-caging groups is a promising approach for the preparation of caged compounds with diverse physical and chemical properties, we report a method for the synthesis of clickable caged compounds that can be modified easily with various functional units via the copper(I)-catalyzed Huisgen cyclization. The modular platform molecule contains a (6-bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl)methyl (Bhc) group as a photo-caging group, which exhibits a high photolysis efficiency compared to those of the conventional 2-nitrobenzyls. General procedures for the preparation of clickable caged compounds containing amines, alcohols, and carboxylates are presented. Additional properties such as the water solubility and cell targeting ability can be readily incorporated into clickable caged compounds. Furthermore, the physical and photochemical properties, including the photolysis quantum yield, were measured and were found to be superior to those of the corresponding Bhc caged compounds. The described protocol could therefore be considered a potential solution for the lack of structural diversity in the available caged compounds.

A protocol for the synthesis and measurement of the photochemical properties of modular caged compounds with clickable moieties is presented.