Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Ant&#243;n Barreiro-Iglesias was supported by the Fundaci&#243;n Barri&#233; (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).

ראה לוח 1 לכל חומרים המשמשים בפרוטוקול זה. ניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת טמפל. .1 בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג lampreys ים זחל wildtype (Petromyzon מרינוס ל &#39;), 10 - 14 סנטימטר באורך (4 - 7 שנים) מזרמי האכלת האגם מישיגן, מיובליו לנהר דלאוור (פנסילבניה) או הזרמים במיין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במעבדה, לשמור על זחלים בקבוצות של 50 - 100 בעלי חיים בטנקי מים מתוקים 50 ליטר ביום 16 במעלות צלזיוס. קו טנקים עם סנטימטר של חצץ לזחלים להתחפר ב, והמים מסונן בפחם וממוזג עם אבני אוויר לפחות 48 שעות כדי להסיר כלור וזיהומים אחרים לפני הצבת lampreys בהם. אין צורך להאכיל את בעלי החיים, שממחזרים שאריות שלהם, עד ליום של שימוש. </li></ol> .2 בעמוד השדרה מלאהחיתוך רוחב כבל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הניתוח בעמוד השדרה להכין פתרון רינגר צמד ים עם ההרכב הבא: 110 mM NaCl, 2.1 מ&quot;מ KCl, 2.6 מ&quot;מ CaCl 2, 1.8 מ&quot;מ MgCl 2 ו10 חיץ מ&quot;מ טריס; pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע חיתוך רוחב חוט השדרה, למקם את הזחלים במכל קטן שהרדים עם 1% methanesulfonate tricaine בפתרון רינגר הקר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמקום בהרדמה בעלי החיים בצלחת פטרי המלא למחצה בSylgard (סיליקון) ולהשתמש 4 סיכות חרקים (בקוטר מ&quot;מ 0.15) כדי להחזיק את בעלי החיים בעמדה לניתוח (אחד ממוקם בחוטם של החיה, אחד בזנב ושתיים ברמה של הזימים 5 th). מלא את צלחת פטרי כמעט עד לקצה עם פתרון Ringer. שים את הצלחת עם הזחל על קרח בעת ביצוע הניתוחים במסגרת סטראו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע חיתוך רוחב חוט השדרה הגבי, קו האמצע, לעשות חתך אורכי עם אזמל (# 11) ברמה של ה 5זימים לדמיין את חוט השדרה. בתחילה העור פתוח על ידי החדרת הקצה של להב סכין המנתחים פונה כלפי מעלה ולאחר מכן רקמת השריר היא לחתוך בעדינות רבה עד חוט השדרה ניתן לראות מלמעלה. אופנה שני ווים מסיכות חרקים ולהשתמש בם כדי להחזיק את גוף הקירות פתוחים בעת ביצוע חיתוך רוחב חוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגמרי תחצה את חוט השדרה ברמה של הזימים 5 th באמצעות זוג מספריים (# 8 Castroviejo), להכניס את המספריים בניצב לחוט השדרה. חוט השדרה יש transected לחלוטין עם חתך אחד נקי. דמיינו את הקצוות לחתוך חוט השדרה מתחת לסטראו כדי לאשר שבחוט השדרה נחתך לחלוטין. לאחר מכן, ליישר מחדש את קצות החתך של חוט השדרה לאחר חיתוך רוחב באמצעות זוג המלקחיים (מס &#39;5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ביצוע חיתוך רוחב חוט השדרה לסגור את הפצע בקיר גוף גב עם זוג מלקחיים בסדר ולשים את הזחלים על קרח עבור שעה 1 כדי לאפשר t הפצעo להתייבש. שים פיסת נייר סינון בין הקרח והזחלים ולספוג את זה עם פתרון Ringer צמד ים. הטמפרטורה הנמוכה שומרת על בעלי החיים בחיים באותו הזמן שהיא מאפשרת את הפצע לאוויר יבש ולכן עוזר למנוע זיהומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן להעביר את הזחלים לטנקים קטנים (זחל 1 לכל טנק) במים קרים כקרח ל24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את יום זחלי 1 הפצוע לאחר חיתוך רוחב השדרה כדי לאשר התנהגותית שאין זנב תנועה לאתר של פציעה. חיתוך רוחב חוט השדרה נחשב שלם אם הזחל יכול להזיז רק את ראשו מקורי לאתר של פציעה (ברמה של הזימים 5 th). אם זה המקרה הזחלים יכולים כעת יועברו לטנקים (זחל 1 לכל טנק) עם מים מתוקים בטמפרטורת חדר (23 מעלות צלזיוס) כדי לאפשר להם להתאושש במשך נקודות הזמן שנבחרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופת ההחלמה להחליף את המים כל 2 עד 3 ימים. </li></ol> .3 המוח Dissection והכנתהמוח לכלאה באתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודות הזמן הרצויות לאחר הפציעה מחדש להרדים lampreys ים הזחל והמקום ולהצמיד אותם בצלחת פטרי עם פתרון Ringer לבצע נתיחת המוח כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את המוח, להפוך ראשון חתך רוחבי עם האזמל בין הנחיר ואיבר האצטרובל. מכאן יתחיל לחתוך את הרקמה המקיפה את המוח על ידי שימוש בזוג מספריים Castroviejo בעוד מחזיק אותו עם זוג המלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמוח חשוף, להסיר את מקלעת דמית העין באמצעות זוג המלקחיים ולהשתמש בקרסים כדי להפיץ את ראשו של בעל החיים ולחשוף את עצבי הגולגולת. לאחר מכן, חותך את transversally חוט השדרה עם המספריים Castroviejo. החזק את חוט השדרה עם זוג המלקחיים תוך שימוש בזוג נוסף של מלקחיים לחתוך את עצבי הגולגולת לנתח את המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר נתיחה, לשים את המוח על חתיכה קטנה של סיליקון ולהחזיק אותו בעמדה על ידי הוספת 2 תוספותect סיכות בנורות חוש הריח ו1 בחוט השדרה. לאחר מכן, לחתוך האחורי וcommissures cerebrotectal של המוח לאורך קו האמצע הגב עם המספריים ולהסיט את צלחות עלאר רוחבית ולהצמיד אותם שטוח לסיליקון עם 4 סיכות חרקים (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את פיסת סיליקון עם המוח לצינור המכיל 4 paraformaldehyde% בנאגרו מלוח פוספט (pH 7.4) להיות קבועים בtemparature החדר למשך 3 שעות על הכתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע להשתמש במוח לwholemount הכלאה באתר כפי שתואר לעיל (סוויין et al., 1994). מוחות מבעלי החיים שליטה או אחיזת עיניים פעלו יש תמיד לרוץ במקביל למוח מבעלי חיים שנפגעו. מוח זחל wholemounted ניתן ללמוד על ידי הכלאה באתר בגלל הצורה שטוחה ודקה שלה וגם בשל היעדר המיאלין 10, מה שהופך את המוח די שקוף. </li></ol>

<ol>
	<li>Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampreys+as+an+animal+model+in+regeneration+studies+after+spinal+cord+injury.">Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury.</a> Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).</li><li>Davis, G. R., McClellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extent+and+time+course+of+restoration+of+descending+brainstem+projections+in+spinalcord-transected+lamprey.">Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey.</a> J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).</li><li>Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+neurofilament+expression+selectively+in+regenerating+reticulospinal+neurons.">Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons.</a> J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).</li><li>Shifman, M. I., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+netrin+receptor+UNC-5+in+lamprey+brain+modulation+by+spinal+cord+transection.">Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection.</a> Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).</li><li>Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+lamprey+UNC5+receptors+cDNA+cloning,+phylogenetic+analysis+and+expression+in+reticulospinal+neurons+at+larval+and+adult+stages+of+development.">The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development.</a> J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Yumu, l. R. E., Laramore, C., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+repulsive+guidance+molecule+RGM+and+its+receptor+neogenin+after+spinal+cord+injury+in+sea+lamprey.">Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey.</a> Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).</li><li>Busch, D. J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+accumulation+is+associated+with+cell-specific+neuronal+death+after+spinal+cord+injury.">Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury.</a> J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+death+of+identified+reticulospinal+neurons+after+spinal+cord+injury+in+lampreys.">Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys.</a> J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).</li><li>Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+hybridization+in+wholemounted+lamprey+brain+neurofilament+expression+in+larvae+and+adults.">A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults.</a> Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).</li><li>Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+myelin+sheaths:+both+lamprey+and+hagfish+lack+myelin.">Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin.</a> Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).</li><li>Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+can+alter+the+function+outcome+of+spinal+cord+regeneration+in+larval+lampreys.">Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys.</a> Neuroscience. 90, 957-965 (1999).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע חיתוך רוחב מלא בחוט השדרה ומוח אחורי לנתיחה בlampreys ים זחל. הליך זה מאפשר הבדלי ניתוח בביטוי גנים בין חוט השדרה לזיהוי תאי עצב מקרינים לאחר פגיעה בחוט השדרה באמצעות מוח כל ההר בכלאה באתר. השלב הקריטי בהליך הוא הביצוע הנכון של חיתוך ר...

ביונקי פגיעה בחוט השדרה (SCI) היא מצב הרסני שמוביל לאובדן קבוע של תפקוד מתחת לאתר של פציעה כי האקסונים נפצעו לא להתחדש דרך אזור הטראומה ולהתחבר מחדש למטרות המתאימות. בניגוד ליונקים, lampreys לשחזר תנועה לאחר פגיעה בחוט השדרה מלאה. 1 ​​מעניין, יש לי lampreys סט של 36 חוט השדרה מקרין נוירונים כי הם אישי מזהים בכל הר הכנות מוח בגללם גודל גדול 2,3 (איור 1) . כל הנוירונים מקרין שדרה אלה axotomized על ידי חיתוך רוחב חוט השדרה מלא ברמה גבוהה. המחקרים קודמים של הקבוצה ואחרים שלנו הראו כי אפילו בנוכחות של החלמה תפקודית לאחר SCI חלק מהנוירונים האלה להראות יכולת התחדשות נמוכה מאוד (הם נחשבים &quot;regenerators הרע&quot;), בעוד שאחרים בדרך כלל להתחדש האקסון שלהם דרך האתר של פציעה (הם נחשבים גרם &quot;regenerators ood &quot;). 2,3 מאפיין זה הופך את lampreys מודל חוליות מעניין ללמוד את ההבדלים בביטוי הגנים בין תאי עצב מקרין שדרת regenerator הטוב והרע, כי בתורו יובילו להבדלים ביכולת ההתחדשות הפנימית של תאי עצב המנסה להתחדש האקסונים שלהם באותה הסביבה חיצונית. 1 שימוש במודל זה יש לנו הראה בעבר כי תאי עצב עם ביטוי מופע יכולת משובי נמוך של קולטני מולקולת הדרכת axonal כמו UNC5 4,5 וneogenin, 6 אשר מתווכים את הפעולה המעכבת של netrin וRGM בהתאמה מקרינה שדרה. בנוסף, על ידי שימוש בשיטה זו הקבוצה שלנו הראתה גם כי רק regenerators הטוב להראות התאוששות של הביטוי של neurofilaments לאחר הפציעה ובמהלך תהליך ההתחדשות. לאחרונה, בוש ו7 מורגן הראו על ידי immunofluorescence שregenerators הרע להראות increasביטוי עורך של סינוקלאין לאחר פציעה, שספר על ידי המחברים לעובדה שתאי העצב מקרין השדרה &quot;regenerator הרע&quot; למות לאט לאחר 5,7,8 חיתוך רוחב חוט השדרה מלא. אז, מודל צמד ים של פגיעה בחוט השדרה שלמה התפתח כמודל שימושי מאוד להבין מה גורם נוירון כבל מקרין השדרה &quot;regenerator רע&quot; לאחר axotomy. לבצע המחקרים שלנו אנו מבצעים פרוטוקול מלא בעמוד השדרה חיתוך רוחב כבל ניתוח ונתיחת מוח אחורי בנקודות הזמן הרצויות לאחר פציעה לבצע wholemount הכלאה באתר. במאמר המתודולוגי הנוכחי אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע התקין של ניתוח פגיעה בחוט השדרה מלא בlampreys הזחל, התחזוקה הבאה של בעלי החיים ונתיחה הסופית המוח והכנת המוח לwholemount הכלאה באתר. פרוטוקול מפורט לperform wholemount הכלאה באתר במוח של lampreys זחל כבר דווח בעבר. 9 בנוסף, פרוטוקול זה לפגיעה בחוט השדרה ומוח לנתיחה יכול לשמש גם לאחר מכן לעבד את המוח לאימונוהיסטוכימיה או שיטות היסטולוגית אחרות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="280">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:64px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:71px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:64px;">Tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:83px;">Spectrum</td>
			<td style="width:64px;">TR108</td>
			<td style="width:71px;">Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Scalpel #3</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:64px;">10003-12</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Blades for scalpel: #11</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">10011-00</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Castroviejo scissors #8</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">15002-08</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:64px;">Forceps #4 &#38; #5</td>
			<td style="width:83px;">Dumont, Switzerland</td>
			<td style="width:64px;">Roboz RS4955</td>
			<td style="width:71px;">#4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:83px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">SZ51</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:63px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Dow Corning Co.</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">184</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="189" rowspan="2" style="height:189px;width:64px;">Insect pins 0.15, 0.20 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Austerlitz</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">No catalogue #</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:64px;">7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;">03-337-1</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:64px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Science (EMS)</td>
			<td style="width:64px;">19210</td>
			<td style="width:71px;">Dilute to 4% in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey

לאחר פגיעה בחוט השדרה שלמה, lampreys הים בראשון משותק מתחת לרמה של חיתוך רוחב. עם זאת, הם להתאושש תנועה לאחר מספר שבועות, וזה מלווה בהתחדשות מרחק קצר (כמה מ&quot;מ) של האקסונים propriospinal ואקסונים מקרינים שדרה מגזע המוח. בין 36 הנוירונים מקרין שדרת זיהוי גדול, חלקם regenerators טוב ואחרים הם regenerators רע. יכולים בקלות להיות מזוהים ביותר נוירונים אלה בהכנות למערכת עצבים המרכזיות wholemount. על מנת להבין את מנגנוני נוירון הפנימי שמעדיפים או לעכב התחדשות האקסון לאחר פציעה בחוליות במערכת העצבים המרכזית, אנו קובעים הבדלים בביטוי הגנים בין regenerators הטוב ורע, וכיצד ביטוי מושפע מחיתוך רוחב חוט השדרה. מאמר זה ממחיש את הטכניקות לזחל דיור וlampreys ים הבוגר הפך לאחרונה במיכלי מים טרי, הפקת transections חוט השדרה שלמה תחת חזון מיקרוסקופי, והכנת brעין וwholemounts חוט השדרה לכלאה באתר. בקצרה, מוחזקי בעלים חיים ביום 16 ב &#160; ° C ומורדם ב1% benzocaine ברינגר צמד ים. חוט השדרה הוא transected עם המספריים iridectomy באמצעות גישת גב ובעלי החיים מותר להתאושש במיכלי מים טרי ב23 ° C. לכלאה באתר, בעלי החיים reanesthetized והמוח וחוט שהוסרו באמצעות גישת גב.

כדוגמא לתוצאות שניתן להשיג בעת השימוש בשיטה זו, תמונות מייצגות של מוח wholemounted מראים את הביטוי של תעתיקי neogenin בתאי עצב הניתן לזיהוי בעמוד השדרה מקרין-כבל שליטה ו2 שבועות לפרסם lampreys ים זחל נגע מוצגים באיור 2. הקוראים מופנים למחקר קודם 6 דיווח הקשר בין הביטו...

Watch this Scientific Journal Video about Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey at JoVE.com

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys לשחזר תנועה לאחר פגיעה בחוט השדרה מלאה. עם זאת, חלק מתאי העצב מקרין שדרה הם regenerators טוב ואחרים לא. מאמר זה ממחיש את הטכניקות לזחלי צמד ים ים דיור (ומבוגרים הפכו לאחרונה), הפקת transections חוט השדרה מלאה והכנת מוח wholemount וחוט שדרה לכלאה באתר.

חוט השדרה מלא פגיעה ומוח Dissection פרוטוקול Wholemount לאחר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בזחל ים צמד ים

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

complete-spinal-cord-injury-brain-dissection-protocol-for-subsequent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

9.8K Views.  University of Edinburgh.  Lampreys לשחזר תנועה לאחר פגיעה בחוט השדרה מלאה. עם זאת, חלק מתאי העצב מקרין שדרה הם regenerators טוב ואחרים לא. מאמר זה ממחיש את הטכניקות לזחלי צמד ים ים דיור (ומבוגרים הפכו לאחרונה), הפקת transections חוט השדרה מלאה והכנת מוח wholemount וחוט שדרה לכלאה באתר.

Video: Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

נוזל הקשה Lateral: דגם של פגיעה מוחית טראומטית של עכברים

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

פרוטוקול עוף עובר חוט שדרת Slice תרבות

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; חוט השדרה מושרה לייזר הפגיעה דגם להערכת מנגנוני axonal הניוון בזמן אמת

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Vivo דואו-צבע שיטת הדמיה Dynamics כלי הדם בעקבות פגיעה בחוט השדרה Contusive

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

ההדרכה מבוססי פעילות על הליכון עם חוט השדרה נפגע Wistar חולדות

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...