שיטה זו מאפשרת הקלטה וכמות של פעילות עצבית על פני אזורים קליפת המוח הדו-צדדיים של העכבר לתקופה ממושכת ב- vivo. טכניקת שני פוטון יש את היתרון של גילוי פעילות בו זמנית באוכלוסייה עצבית גדולה או מפוזרת על פני תקופה ממושכת. ההשלכות של טכניקה זו התרחבו לחקירה של דפוסי פעילות באוכלוסיות עצביות מוגדרות באזורים שונים של המוח החי.
12 שעות לפני תחילת ההליך, לחמם את החלונות האופטיים ב 50 מעלות צלזיוס ב 70% אתנול. חלון אופטי מורכב מזכוכית כיסוי עליון בקוטר 5 מ"מ עגולה וחלק תחתון המכיל זכוכית כיסוי עגולה בקוטר שלושה מילימטר. בסוף הדגירה התחממות, לאשר חוסר תגובה קמצוץ בוהן על הרדמה 20 כדי 25 גרם 1 1/2 כדי 2 1/2 חודש Thy1 GCaMP6s עכבר, ולהחיל משחה על העיניים של החיה.
מניחים את העכבר על משטח חימום מכוסה וילון סטרילי ולהשתמש במתאם מחזיק ראש לעכברים כדי לייצב את הראש. לגלח את רוב הקרקפת עם סכין גילוח דו-קצה, ולנקות את העור החשוף עם רפידות הכנת אלכוהול סטרילי רציף קרצוף פתרון povidone-יוד. לאחר מכן השתמש בזוג מספריים כדי להפוך מלבני שניים על שלושה מילימטר לחתוך בקרקפת בצד ימין של הגולגולת.
בעזרת ספוגית כותנה, דוחפים את העור הצידה כדי ליצור אזור חשיפה בקוטר של יותר משלושה מילימטרים, ולהשתמש בלהב מיקרו-כירורגי קהה כדי להסיר בעדינות את רקמת החיבור המחוברת לגולגולת. בעזרת מקדחה דנטלית, סמנו בעדינות עיגול בקוטר 3 מ"מ סביב אזור ה-S1. לאחר ביצוע עיגול דומה בצד שמאל של הגולגולת, להחיל שכבה דקה של דבק סופר cyanoacrylate משני צידי העצם כדי לספק בסיס עבור יישום מלט שיניים.
תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במקדחה מיקרו במהירות גבוהה כדי לדלל את חריץ עגול בצד ימין של הגולגולת סביב אזור S1 כדי ליצור קצה חלק, שאפת פסולת העצם עם ואקום לפי הצורך. לאחר שהושג עומק עצם של כ-2/3, דק לאט ובזהירות את 1/3 העצם הנותרת עד שדש עצם עגול שוחרר לחלוטין מהגולגולת שמסביב. השתמש זוג מדפים 5/45 כדי להסיר לאט ובזהירות את פיסת העצם המעגלית כדי לחשוף את דורה, דואג כדי למנוע פגיעה בכלי pial.
לאחר הסרת דש עצם מהצד השמאלי של הגולגולת באותו אופן, לשטוף את החלון האופטי עבור הצד הימני של הגולגולת עם מלוחים סטריליים, ולבדוק פגמים תחת מיקרוסקופ סטריאו. התקן את החלון האופטי מעל אזור craniotomy עם החלק העליון של החלון מונח על הגולגולת ואת החלק התחתון בתוך פתח craniotomized, נח על דורה, בנוכחות נוזל השדרה המוחי. השתמש בדבק העל cyanoacrylate כדי לאטום את החלק העליון של קצה החלון האופטי לגולגולת.
כאשר הדבק התייבש, להחיל מלט שיניים שחור על קצה הזכוכית, שאר הצד הימני של הגולגולת החשופה, ואת שולי הפצע כדי לחסום את האור. לאחר מכן להתקין את החלון האופטי השמאלי ולאפשר את החיה להתאושש עם ניטור עד שאריות מלאות. שבעה עד עשרה ימים לאחר ההליך, מניחים את החיה הרדמה לתוך מתאם מחזיק הראש על כרית חימום תחת מיקרוסקופ שני פוטון, דואג כי החלון האופטי ואת הצד הימני של הגולגולת מכוונים בניצב לציר האופטי של המיקרוסקופ.
רכוש תמונת מפת ייחוס ראשונית של חלון הגולגולת באמצעות תאורת שדה בהיר בהגדלה של ארבע פעמים. לאחר רכישת תמונות מרובות של אותו אזור עניין, דימוי דינמיקת הסידן בתוך אזור S1 בחצי הכדור השמאלי וחישוב השינויים בנורסצנטיות מכל אזור עניין משני צידי הגולגולת. בתמונות מייצגות אלה, דנדריטים וכלי דם בתוך עכבר מבטא EGFP הודמיו בעומקים שונים בשכבה 2 של אזור S1 יום אחד לאחר התקנת החלון האופטי.
תמונות ההקרנה של Z צולמו בימים 1 ו-7 לאחר השתלת החלון האופטי, הממחישות מספר ומיקום יציבים להפליא של ענפים וקוצים דנדריטיים לאורך תקופת הניסוי. מדידה של סידן תאי חולף Thy1 GCaMP6s עכברים מהודקים מאפשר כימות של פעילות סידן ספונטנית ואוכלוסיות של נוירונים פירמידלי שכבה חמש ממוקם עמוק כמו יותר מ 500 מיקרומטר מתחת פיא, כמו גם חישוב של המספר הממוצע של תגובות ספונטניות לאורך זמן. חוקר מאומן הן הכנת חלון הגולגולת ו vivo שתי טכניקות הדמיה סידן פוטון צריך להיות מסוגל להשיג הקלטות של 100 עד 200 נוירונים משני צידי הגולגולת באחד עד שני בעלי חיים ליום.
עם חלון אופטי פתוח בכל צד של הגולגולת, השיטה מאפשרת הקלטה של הפעילות העצבית על פני אזורי מוח יונקים סימטריים להדמיית סידן ממושכת ויציבה ב- vivo. שיטה זו יכולה לשמש גם לחקר פעילות קליפת המוח ופלסטיות לאחר פגיעה חד צדדית בציוד ההיקפי או במערכת העצבים המרכזית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך להתקין חלונות גולגולתיים דו-צדדיים למדידת דינמיקת סידן באמצעות מיקרוסקופ שני פוטון בעכברים מהודקים Thy1 GCaMP6s.
