ההדרכה שהוצגה בוצעה ופותחה בתוך מתקן Core ספקטרומטריית המסה בבית הלאומי יהודית הבריאות. מתקן NJH MS נתמך בחלקו על ידי CCSTI UL1 TR000154. מימון ממענקי NIH P20 HL-113445 וR01 HL-095,432 נתמכים גם על עבודה זו.

<ol>
	<li>Beckonert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling,+metabolomic+and+metabonomic+procedures+for+NMR+spectroscopy+of+urine,+plasma,+serum+and+tissue+extracts.">Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts.</a> Nature Protocols. 2, 2692-2703 (2007).</li><li>Clarke, C. J., Haselden, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Profiling+as+a+Tool+for+Understanding+Mechanisms+of+Toxicity.">Metabolic Profiling as a Tool for Understanding Mechanisms of Toxicity.</a> Toxicologic Pathology. 36, 140-147 (2008).</li><li>Wang, X., Zhang, A., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+of+Metabolomics+in+Diagnosis+and+Biomarker+Discovery+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Power of Metabolomics in Diagnosis and Biomarker Discovery of Hepatocellular Carcinoma.</a> Hepatology. 57, 2072-2077 (2013).</li><li>Collino, S., Martin, F. -. P. J., Kochhar, S., Rezzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Healthy+Metabolic+Trajectories+with+Nutritional+Metabonomics.">Monitoring Healthy Metabolic Trajectories with Nutritional Metabonomics.</a> Nutrients. 1, 101-110 (2009).</li><li>Cevallos-Cevallos, J. M., Reyes-De-Corcuera, J. I., Etxeberria, E., Danyluk, M. D., Rodrick, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+analysis+in+food+science:+a+review.">Metabolomic analysis in food science: a review.</a> Trends in Food Scienc., &amp; Technology. 20, 557-566 (2009).</li><li>Nicholson, J. K., Connelly, J., Lindon, J. C., Holmes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabonomics:+a+platform+for+studying+drug+toxicity+and+gene+function.">Metabonomics: a platform for studying drug toxicity and gene function.</a> Nature reviews. Drug Discovery. 1, 153-161 (2002).</li><li>Wishart, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metabolome Analysis: An Introduction. , 253-288 (2006).</li><li>Vuckovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+trends+and+challenges+in+sample+preparation+for+global+metabolomics+using+liquid+chromatography&#8211;mass+spectrometry.">Current trends and challenges in sample preparation for global metabolomics using liquid chromatography&#8211;mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403, 1523-1548 (2012).</li><li>Bollard, M. E., Stanley, E. G., Lindon, J. C., Nicholson, J. K., Holmes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-based+metabonomic+approaches+for+evaluating+physiological+influences+on+biofluid+composition.">NMR-based metabonomic approaches for evaluating physiological influences on biofluid composition.</a> NMR in Biomedicine. 18, 143-162 (2005).</li><li>Dong, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern HPLC for Practicing Scientists. , (2006).</li><li>Want, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent-dependent+metabolite+distribution,+clustering,+and+protein+extraction+for+serum+profiling+with+mass+spectrometry.">Solvent-dependent metabolite distribution, clustering, and protein extraction for serum profiling with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 78, 743-752 (2006).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+sample+preparation+approach+for+mass+spectrometry-based+profiling+of+plasma+results+in+improved+coverage+of+metabolome.">New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome.</a> Journal of Chromatography A. 1300, 217-226 (2013).</li><li>Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).</li><li>Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+extraction+by+methyl-tert-butyl+ether+for+high-throughput+lipidomics.">Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics.</a> Journal of Lipid Research. 49, 1137-1146 (2008).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37, 911-917 (1957).</li><li>Ferreiro-Vera, C., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+sample+preparation+approaches+for+phospholipids+profiling+in+human+serum+by+liquid+chromatography&#8211;tandem+mass+spectrometry.">Comparison of sample preparation approaches for phospholipids profiling in human serum by liquid chromatography&#8211;tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1240, 21-28 (2012).</li><li>Michopoulos, F., Lai, L., Gika, H., Theodoridis, G., Wilson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPLC-MS-Based+Analysis+of+Human+Plasma+for+Metabonomics+Using+Solvent+Precipitation+or+Solid+Phase+Extraction.">UPLC-MS-Based Analysis of Human Plasma for Metabonomics Using Solvent Precipitation or Solid Phase Extraction.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2114-2121 (2009).</li><li>Kerns, E. H., Di, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods: from ADME to toxicity optimization. First edn. , (2008).</li><li>Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., R&#233;m&#233;sy, C., Jim&#233;nez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenols:+food+sources+and+bioavailability.">Polyphenols: food sources and bioavailability.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 79, 727-747 (2004).</li><li>Weimer, J. M., Kriscenski-Perry, E., Elshatory, Y., Pearce, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+ceroid+lipofuscinoses.+Mutations+in+different+proteins+result+in+similar+disease.">The neuronal ceroid lipofuscinoses. Mutations in different proteins result in similar disease.</a> NeuroMolecular Medicine. 1, 111-124 (2002).</li><li>Schulze, H., Sandhoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+lipid+storage+diseases.">Lysosomal lipid storage diseases.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).</li><li>Kuhn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+evaluation+of+automated,+multiplexed+peptide+immunoaffinity+enrichment+coupled+to+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry+for+quantifying+proteins+in+plasma.">Interlaboratory evaluation of automated, multiplexed peptide immunoaffinity enrichment coupled to multiple reaction monitoring mass spectrometry for quantifying proteins in plasma.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11, (2012).</li><li>Rist, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Freezing+and+Storage+Procedure+on+Human+Urine+Samples+in+NMR-Based+Metabolomics.">Influence of Freezing and Storage Procedure on Human Urine Samples in NMR-Based Metabolomics.</a> Metabolites. 3, 243-258 (2013).</li><li>Boomsma, F., Alberts, G., van Eijk, L., Manin&#8216;t Veld, A. J., Schalekamp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+Collection+and+Storage+Conditions+for+Catecholamine+Measurements+in+Human+Plasma+and+Urine.">Optimal Collection and Storage Conditions for Catecholamine Measurements in Human Plasma and Urine.</a> Clinical Chemistry. 39, 2503-2508 (1993).</li><li>Wood, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+the+human+circulating+endocannabinoid+metabolome:+clinical+sampling+and+sample+storage+parameters.">Comprehensive profiling of the human circulating endocannabinoid metabolome: clinical sampling and sample storage parameters.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 46, 1289-1295 (2008).</li><li>Bahr, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+mononuclear+cell+gene+expression+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Peripheral blood mononuclear cell gene expression in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49, 316-323 (2013).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אחת ממטרות מחקרי metabolomic הקליניים היא לזהות שינויים בmetabolome הקשורים למחלה או טיפולים. לכן טכניקות הכנת מדגם צריכים להיות חזק, עקבי וניתנים להעברה מטכנאי לטכנאי וממעבדה למעבדה 22. את הנתונים המתקבלים צריך להיות נציג של המדגם, ושינויים שזוהו צריכים לשקף את המדגם שנקבע ולא שגיאות הכנת מדגם. לכן pipetting מדויק, טמפרטורה נכונה, decanting יעיל של שכבות immiscible, ייבוש תחת חנקן, ושימוש באותו המותגים וגדלים של כלי זכוכית וטיפים נחוצים. במהלך שלב המשקעים חלבון, זה קריטי, כי את אותה הכמות של פתרון יצקה מכל גלולה. הפעולה זו מפחיתה את השונות בעוצמת קול ובתור שכזו מפחיתה את השונות בנתונים לדוגמה. צעד משקעים חלבון זה הוא הכרחי ללימודי metabolomic ולא ניתן לדלג שכן הוא מסיר את החלבון מןהדגימות לפני המולקולה קטנה פרופיל ניתוח על ספקטרומטר המסה. זה מבטל פתוגנים ומקרומולקולות גדולות, ומשחרר מחויבים מטבוליטים מחלבונים 7. חוסר הצטברות חלבון בדגימות מרחיב את החיים עמודת HPLC ומגביר את הדיוק ואת איכות תוצאות. איור 5 הוא תיאור של גלולה החלבון שנוצרה בעת ביצוע טכניקה זו על דגימות פלזמה. זה מאפשר זיהוי של המולקולות קטנות, משפר שפע יון, ומפחית את השפעות מטריצה ​​מחלבונים במדגם. בנוסף, מאחר שהנחה הוא שכל החלבונים מוסרים בשלב זה, חומצות אמינו, המתגלים במהלך ניתוח LC-MS יהיו מקורן שינויים מטבוליים ולא מפירוק חלבון. שלב חילוץ נוזל הנוזל הוא קריטי שכן הוא מפריד בין מטבוליטים הידרופילי ו הידרופובי לשתי שכבות immiscible. איור 6 מציג את הליך האיל ונציגresentation של שכבת האיל. הפרדה לא תקינה של שתי שכבות התוצאה מטבוליטים או ללכת לאיבוד או להיות eluted בשני השברים. יישום זהיר של צעד זה מפחית את מספר התרכובות הידרופיליות המופיעות בחלק הידרופובי. התוצאות עבור התרכובות אלה הופכים בלתי אמינות שכן הוא לא ניתן לקבוע שחלק מכיל את תוצאות הנציג. כאשר נעשה בצורה נכונה, חפיפה המטבוליט מצטמצמת. כדי למנוע השפלה חמצוני, במיוחד בשומנים, אלא גם במולקולות קטנות שיכול להכיל קבוצות תיאול לדוגמא, חשיפה לחמצן צריכה להישמר עד למינימום. לפיכך, הליך זה תמיד מבוצע תחת חנקן להפחתה / מניעת חמצון של שומנים בדם או תרכובות המכילה תיאול. בנוסף, העברת המדגם ו / או הפתרון היא מהירה (בדקה הראשונה) כדי להפחית את החשיפה לחמצן, ולאחר מכן דגימות מונחות תחת זרם יציב של חנקן במהירות להתייבש למטה. יבש פעם אחת, הם היא מידresuspended ately במתנול 100% מהסיבות שפורטו לעיל. מעבדות יכולות להפיק תועלת משיטה מקיפה זו במספר הדרכים; חוקרים מחפשים לבודד סוג אחד של תרכובות יכולים לבחור חלק מהשיטה שמתאימה ביותר לצרכיהם. אלה המבקשים לבצע משקעים חלבון רק כדי להשיג בריכה של מטבוליטים יכולים לעשות כן. אם מטבוליטים הידרופילי הם רצויים, כגון תרופות רבות תרופות, חומצות אמינו, וסוכרים, או אם רק מטבוליטים הידרופובי הם רצויים, כגון טריגליצרידים, אפוקסים, ויטמינים מסיסים בשומן, פוספוליפידים ולמשל, אז חוקרים יכולים לבצע שאיבת נוזל הנוזל הצעד הבא משקעים חלבון וזורקים את החלק רצוי. חוקרים שדורשים סיווג משנה נוסף של התרכובות הידרופוביות (שומנים ניטראליים, חומצות שומן, פוספוליפידים ו) יכולים להמשיך לשלב חלוקה. שיקולי חפצים חשובים בmaintaining את הכדאיות של דגימות לצורך הניתוח מאוחר יותר. אם דגימות מאוחסנות בצורה לא נכונה, השפלה או פירוק יכולה להתרחש. באופן אידיאלי, יש לאחסן דגימות בבקבוקוני ענבר כובע בורג במרחק של אור כדי למנוע השפלה של מינים רגישים לאור. צריכים גם להישמר דגימות קפואות ב -80 מעלות צלזיוס כדי למנוע השפלה המטבוליט 23-25. למרות שלא נידונו בפירוט כאן, דגימות נשמרות תמיד על 4 מעלות צלזיוס במגש autosampler במהלך ניתוח LC-MS. הדבר מבטיח כי כל הדגימות נשמרות בטמפרטורה קבועה, וכי שינויים בטמפרטורת הסביבה אינו משפיעים על הצמיגות, מסיסות, או היציבות של הדגימות. מומלץ כי ההיבטים ידניים של הליך זה, כגון איל וSPE, להיות מתורגל כדי לרכוש את אמונו ונוחות עם הצעדים מעורבים. כמה מגבלות קיימות לטכניקה זו. הפרדה דיסקרטית של מטבוליטים הידרופובי והידרופילי אינה מובטחת כמו תרכובות מסוימות inher תהיהently לחלק לשני השברים בשל מצב ההרכב כימי ותשלום שלהם. בנוסף, כפי שמוצג באיור 4, טכניקה פסולה בשלב חילוץ גלולה חלבון יכול לגרום לשחזור המטבוליט עניים בשתי הדגימות ובקרת איכות. זה משפיע על הסטטיסטיקה, במיוחד במערכי נתונים קטנים בגלל הכוח הסטטיסטי אינו זמין. לכן זה קריטי, כי צעד זה יבוצע בדיוק באותו הזמן בכל עבור כל דגימה. מגבלה נוספת היא זמן. למרות שיש נקודות עצירה לאורך כל הפרוטוקול הזה שבו אפשר להקפיא דגימות וההכנה המשיכה ביום שלמחרת, יש לקבוע יום שלם הצידה כדי לבצע הליך זה. שלישית, לא כל מתחם בתוך מדגם ביולוגי ניתן להעריך לדיכוי יון. מאחר שלא ניתן לזהות כיצד המטריצה ​​משפיעה על כל המטבוליט בודד, האפשרות הנוכחית היא להעריך את הסטנדרטים הפנימיים אשר באופן תיאורטי לחקות כמה סוגים של endogenouמטבוליטים של. לבסוף, לא ניתן לבצע זיהוי מוחלט אך ורק בשיטה זו. טנדם MS בשיתוף עם חיפושים במאגר נתונים ותקנים הנדרשים לזיהוי המטבוליט מוחלט. חלק חשוב של metabolomics הוא זיהוי של תרכובות. למרות שלא נידון בפירוט כאן, דגימות בקרת האיכות נותחו באמצעות LC-MS. כדורי סרק מרובים מדגם הכנה ואת החסר מכשיר הוכנו לשימוש כרקע חיסור כדי להפחית את השיעור של תוצאות חיוביות שגויות ממזהמים, ובכך וכתוצאה מלהיטי המטבוליט אמינים יותר. בעקבות צעד זה, מספר &quot;תכונות מולקולריות&quot; קובצו יחד על בסיס מ &#39;/ z, זמן שמירה, יחס איזוטופ, וadducts לייצר רשימה של תרכובות בפועל. למרות שהרשימה של תרכובות הייתה פחותה בהרבה, התוצאות היו אמינות יותר כפי שהם אינם מבוססים על adducts מרובה מאותו המתחם. השיטה המלאה היא מקיפה ומאפשרת isolation של מטבוליטים הידרופובי כגון שומנים ניטראליים, פוספוליפידים, חומצות שומן, טריגליצרידים, וסטרואידים, אך גם בידוד כיתות הידרופילי בחלק המימית, מתוכם eicosanoids, סוכרים, פלבנואידים, וחומצות אמינו זוהו 12, 26.

תגובות ביולוגיות לייצר מטבוליטים כמוצרים סופיים של תהליכים תאיים. Metabolomics הוא אוסף של כל התרכובות קיימות באורגניזם כתוצאה מתהליכים אלה. הוא מספק תמונה של הפיסיולוגיה של תאים ומשקף תגובה של האורגניזם לגירויים חיצוניים או פנימיים 1, 2. גירויים כאלה יכולים להיות סביבתיים, טוקסיקולוגי, תרופתיים, תזונתיים, הורמונליים, או הקשורים למחלה. יש יישומי metabolomic רבים וכעת הם נחקרים על ידי חוקרים וכוללים סמנים ביולוגיים גילוי 3, לימודי תזונה 4, מדעי מזון 5, ובדיקות סמים 6. ללא תלות ביישום, שינויים בנתונים, זיהום, ונוכחות של תוצאות חיוביות שגויות צריכים להיות מופחתים או רצוי להסירו. בגילוי סמן ביולוגי או במקרה של קביעת הבדלים בין בקרה וקבוצת מחלה, או לחקור השפעות של תרופות על נושאים, ו ביולוגיluid נבחר מבוססת על השאלות שהוא שאל והסוגים של מטבוליטים נחקרים 7. לדוגמא, אם לומד את ההשפעות מיידיות של תרופה בשאיפה על הריאות של חולי אסתמה, ולאחר מכן לבחון מטבוליטים בנוזל שטיפה ברונכואלוואולרית (בלף) דגימות לפני ואחרי הנטילה יהיה מועדף. כדי להבטיח שנצפה הבדלים הם עקב וריאציה ביולוגית בפועל ולא מדגם טכניקת הכנה לא תקינה, פרוטוקול מעבדה סטנדרטי ועקבי הוא חיוני 8. מידע מדגם חייב להיות מתועד בקפידה כדי להבטיח שמשתנים כגון נוזל ביולוגי, זן בעלי חיים, זמן דגימה, גיל נושא, מין, עד כמה שם, כולם נחשבים ונלקח בחשבון במחקר 9. בנוסף, כדי לצמצם את האפשרות של זיהום או חיובי שגוי, מומלץ שחסר ממס ואת החסר מכשיר להיות מנותח 10. עבור פרוטוקול זה, METABO המונח &quot;לייט &quot;ישמש להתייחס לתרכובות בפועל מזוהות. באמצעות ספק תוכנה, אלגוריתם ממצא שיא ראשוני משמש כדי לזהות פסגות רפאים המוניות. פסגות אלה מיושרים המבוססים על יחס בין מסה למטען (m / z) ושמירת זמן. אלגוריתם שני לאחר מכן נעשה שימוש כדי לשלב תכונות מרובות לתוך מתחם אחד. זה כולל תכונות כגון נתרן, אשלגן, או adducts אמוניום במצב היינון החיובי, וכלוריד במצב היונים השלילי. אפשרויות נוספות בתוכנה כוללות תכונות כגון הדימרים וadducts אחרים. שימוש בגלוקוז כדוגמא, עם פסגות ב181.0707 מ &#39;/ z (M + H), 198.0972 מ&#39; / z (M + NH 4), ו203.05261 מ &#39;/ z (M + Na), יהיו שלוש פסגות המתאימות לאותו מתחם באמצעות האלגוריתם הראשון. עם זאת, כאשר האלגוריתם השני, המבוסס על נוסחה מולקולרית, מוחל שלושה adducts אלה הופך מקובצים יחד וכתוצאה ממתחם אחד. מטבוליטים יכולים לגרום להפרעות בsamples בשל המורכבות של תרכובות הווה. נוכחותם של אלפי מטבוליטים בגורמי דגימה אחת לאותת דיכוי במיוחד של מטבוליטים שפע נמוכים יותר. ניקוי מדגם להסיר מפריע חלבונים, וההפרדה הבאה לשברים מרובים מפחיתה את המורכבות של המדגם ובכך לשפר את הפרדת שיא, הגדלת רזולוציה, והפחתת Coelution המטבוליט. לכן, נדרשים ניקוי מדגם משופר והפרדה של תרכובות. הוכח כי משקעים חלבון לבד, אפילו עם השימוש בממסים קוטבי שונים, לא יכול לפתור בעיה זו 11, 12. עם זאת, על ידי שילוב של ממס אורגני חזק כגון MTBE בצעד חלוקה שלאחר מכן, כיסוי המטבוליט הוא גדל. יאנג et al. 12 דיווחו על עלייה במטבוליטים מ1,851 או 2,073 עם מתנול או ממטרים מתנול אתנול בלבד בהתאמה, ל3,806 מטבוליטים באמצעות מיצוי בממסים MTBE בשילובאחרי מיצוי מוצק שלב צעדים (SPE). חפיפה מופחתת המטבוליט, הפרדת שיא משופרת ושפע המטבוליט מוגבר נצפו עם שיטה זו. זיהום מהלא מטבוליטים, כגון פולימרים, יכול לנבוע מאיסוף דגימה, ממסים, או רעש של מכשיר, והוא יכול לגרום לדיכוי אות של מטבוליטים שעלולים להיות משמעותיים. מומלץ כי הטכנאי (ים) ומי לאסוף את הדגימות לפני לדגום הכנה באופן עקבי להשתמש באותו מותג, סוג וגודל בקבוקוני איסוף דגימה, הטיפים פיפטה וכל צינורות אחרים המשמשים במהלך האיסוף וההכנה של הדגימות. זה מאפשר לאנליסט נתונים יש ביטחון מלא שהשינויים שנצפו הם אמיתיים ולא בשל הבדלי רקע ממקורות אחרים. יעילות טיפול, הבדלים בין קבוצות מחלה ובקרה, או כל ניתוחים מטבוליים אחרים אז יכולים להיות שנחקרו בביטחון מוגבר. ספידOD דן כאן מתמקד בשיטות משולבות מדגם הכנת 13-15 אשר יכול להיות מיושמות על פלזמה, בלף, או נוזל המוח והשדרה (CSF) דגימות לפרופיל metabolomic הלא ממוקד לספקטרומטריית נוזל כרומטוגרפיה מסה (LCMS) ניתוח מבוסס. שתי כרומטוגרפיה נוזלית (LC) וכרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים (UPLC) יכולה להיות בשילוב טכניקות הפרדה לטרשת נפוצה לאחר הליך זה. חוקרים רבים מבצעים מחקרי metabolomic להשתמש גם בטכניקת משקעים חלבון ו / או טכניקת נוזל נוזל מיצוי 16, 17. במחקרים שלנו, כל זה הסתיים בפחות מטבוליטים שיראו. השיטה המתוארת כאן 12 מאפשרת איתור וזיהוי של מספר גדול יותר של מטבוליטים, המשתרע על מגוון רחב יותר של metabolome. גידול זה נובע מהטוהר גבוה יותר של הדגימות ואפקטי מטריצה ​​מופחתות שנגרמו על ידי הפרדה מראש של שיעורי המטבוליט. Prot ראשוניצעד ממטרים עין מתבצע באמצעות מתנול הקר (MeOH) כדי להסיר חלבון מן המדגם. מיצוי נוזל נוזל (איל) באמצעות אתר מתיל טרט בוטיל (MTBE) ומים משמש להפרדת התרכובות הידרופילי והידרופובי. ואז מיצוי מוצק שלב (SPE) מבוצע על השכבה הידרופובי להפריד את התרכובות הידרופובי לשלושה סוגים - חומצות שומן, שומנים ניטראליים, ופוספוליפידים. שברים הידרופובי מחדש במתנול 100%, ואילו חלק קטן הידרופילי הוא מחדש באצטוניטריל 5% במים. הצעד מוצק שלב חילוץ (SPE) מספק רמה נוספת של ביטחון בתוצאות על ידי צמצום מספר תרכובות coeluting אשר אחרת היה להיות נוכחים הייתה צעד הפרדה לא בוצע.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="628">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A955-4</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Methanol</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L-6815</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C606-1</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Hexane</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34859</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">49199-50ML-F</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Methyl tert-butyl ether</td>
			<td style="width:163px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">9042-03</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34965-2.5L</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Water</td>
			<td style="width:163px;">Honeywell Burdick &#38; Jackson</td>
			<td style="width:119px;">365-4</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:167px;">OA-SYS heating system</td>
			<td style="width:163px;">Organomation Associates, Inc</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:183px;">Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35oC</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">12-position vacuum manifold</td>
			<td style="width:163px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:167px;">Strata NH2 (55&#181;M, 70&#197;) 100mg/mL SPE cartridges</td>
			<td style="width:163px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:119px;">8B-S009-EAK</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Glass pipette tips</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-678-20C</td>
			<td style="width:183px;">Used to transfer sample to SPE column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:167px;">Plastic pipette tips</td>
			<td rowspan="2" style="width:163px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1182-1830</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;">Used when glass tips are not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:119px;">1182-8810</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-681-320</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:167px;">Graduated glass pipets</td>
			<td rowspan="2" style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-678-27B</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;">Used to transfer organic solvents during sample prep</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:119px;">13-678-27E</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:167px;">Pyrex glass culture tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">99499-16X</td>
			<td style="width:183px;">Used to store aqueous and lipid fractions until the next step</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Autosampler vials</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5182-0545</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Snap cap vials for autosampler vials</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5182-0541</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Glass inserts</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5183-2085</td>
			<td style="width:183px;">Used for small sample volumes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Mass Hunter Qualitative Analysis software</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">Version B.06.00</td>
			<td style="width:183px;">Used to monitor retention times and pressure curves</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Mass Hunter Quantitative Analysis software</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">Version B.05.02</td>
			<td style="width:183px;">Used to analyze quality control and sample data</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:167px;">Mass Profiler Professional software</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">Version B.12.50</td>
			<td style="width:183px;">Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-step preparation technique to recover multiple metabolite compound classes for in-depth and informative metabolomic analysis

Metabolomics הוא תחום מתפתח אשר מאפשר אפיון של דגימות מיצורי חיים על מנת לקבל תובנות לגבי תהליכים ביולוגיים. היבט חיוני של metabolomics הוא הכנת מדגם לפיו עולות בקנה אחד טכניקות להפיק תוצאות לא אמינות. טכניקה זו כוללת משקעים חלבון, מיצוי נוזל נוזל, ומיצוי מוצק שלב כאמצעי fractionating מטבוליטים לארבע כיתות נפרדות. העשרה משופרת של מולקולות שפע נמוכות עם גידול וכתוצאה מרגישות מתקבלת, וסופו של דבר גורמת לזיהוי בטוח יותר של מולקולות. טכניקה זו הוחל על פלזמה, נוזל שטיפת רונכואלוואולרית, ודגימות נוזל השדרה עם נפחים נמוכים כמו 50 μl. דוגמאות יכולות לשמש ליישומים במורד הזרם מרובים; לדוגמא, את הכדור כתוצאה ממשקעי חלבון יכול להיות מאוחסן לניתוח מאוחר יותר. Supernatant מצעד שעובר מיצוי נוזל נוזל באמצעותמים וממס אורגני חזק כדי להפריד את התרכובות הידרופילי והידרופובי. ברגע שמופרד, שכבת הידרופילי יכולה להיות מעובד לצורך הניתוח מאוחר יותר או שהושלכה אם אין צורך. החלק הידרופובי מטופל נוסף עם סדרה של ממסים בשלושה צעדי חילוץ מוצק שלב כדי להפריד אותו לחומצות שומן, שומנים ניטראליים, ופוספוליפידים. זה מאפשר לטכנאי את הגמישות לבחור איזה סוג של תרכובות עדיפים לניתוח. זה גם מסייע בזיהוי המטבוליט אמין יותר שכן חלק הידע של כיתה כימית קיימת.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis at JoVE.com

Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis

האמינות של תוצאות בניסויי metabolomics תלוי באפקטיביות והשחזור של הכנת המדגם. תאר היא שיטה קפדנית ומעמיקה שבמאפשרת מיצוי של מטבוליטים מנוזלים ביולוגיים עם האפשרות של המשך ניתוח עד אלפי תרכובות, או רק את שיעורי המתחם של עניין.

טכניקת הכנה רב שלבים לשחזר חוגים מתחם המטבוליט מרובים לעומק וניתוח Metabolomic אינפורמטיבי

Metabolomics is an emerging field which enables profiling of samples from living organisms in order to obtain insight into biological processes. A vital ...

multi-step-preparation-technique-to-recover-multiple-metabolite

Research

JoVE Journal

Bioengineering

32.2K Views.  National Jewish Health.  האמינות של תוצאות בניסויי metabolomics תלוי באפקטיביות והשחזור של הכנת המדגם. תאר היא שיטה קפדנית ומעמיקה שבמאפשרת מיצוי של מטבוליטים מנוזלים ביולוגיים עם האפשרות של המשך ניתוח עד אלפי תרכובות, או רק את שיעורי המתחם של עניין. 

Video: Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

הכנת הדגימה, הדמיה, ניתוח הפרוטוקולים מיקרוסקופית סכין קצה סריקה

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

מכשיר microfluidic ללימוד זני Distinct מרובים

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

ניתוח הכנת photoacoustic של כלי רכב ניידים המכילים Nanorods הזהב

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant adhesion strength than commercial tissue adhesives. Medical adhesives have attracted great attention as potential alternative tools to sutures and staples due to their convenience in usage with minimal invasiveness. Although there are several protocols for developing tissue adhesives including those commercially available such as fibrin glues and cyanoacrylate-based materials, mostly they require a series of chemical syntheses of organic molecules, or complicated protein-purification methods, in the case of bio-driven materials (i.e., fibrin glue). Also, the development of surgical glues exhibiting high adhesive properties while maintaining biodegradability is still a challenge due to difficulties in achieving good performance in the wet environment of the body. We illustrate a new method to prepare a medical glue, known as TAPE, by the weight-based separation of a water-immiscible supramolecular aggregate formed after a physical mixing of a plant-derived, wet-resistant adhesive molecule,&#160;Tannic Acid (TA), and a well-known biopolymer, Poly(Ethylene) glycol (PEG). With our approach, TAPE shows high adhesion strength, which is 2.5-fold more than commercial fibrin glue in the presence of water. Furthermore, TAPE is biodegradable in physiological conditions and can be used as a potent hemostatic glue against tissue bleeding. We expect the widespread use of TAPE in a variety of medical settings and drug delivery applications, such as polymers for muco-adhesion, drug depots, and others.

We describe the simplest protocol to prepare biodegradable medical glue that has an effective hemostatic ability. TAPE is a water-immiscible supramolecular aggregate prepared by mixing of tannic acid, a ubiquitous compound found in plants, and poly(ethylene) glycol, yielding a 2.5 times greater water-resistant adhesion compared with commercial fibrin glue.

TAPE: דבק עוצר דמום אורגני בהשראת תרכובת ניכרת בכל היבט של צמחים עבור יישום כירורגי

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular level in the chemical and biomedical sciences. Although commercial SIM systems are available, systems that are custom designed in the laboratory can outperform commercial systems, the latter typically designed for ease of use and general purpose applications, both in terms of imaging fidelity and speed. This article presents an in-depth guide to building a SIM system that uses total internal reflection (TIR) illumination and is capable of imaging at up to 10 Hz in three colors at a resolution reaching 100 nm. Due to the combination of SIM and TIRF, the system provides better image contrast than rival technologies. To achieve these specifications, several optical elements are used to enable automated control over the polarization state and spatial structure of the illumination light for all available excitation wavelengths. Full details on hardware implementation and control are given to achieve synchronization between excitation light pattern generation, wavelength, polarization state, and camera control with an emphasis on achieving maximum acquisition frame rate. A step-by-step protocol for system alignment and calibration is presented and the achievable resolution improvement is validated on ideal test samples. The capability for video-rate super-resolution imaging is demonstrated with living cells.

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

A Guide to מיקרוסקופית TIRF תאורה מובנית ב- High Speed ​​עם צבעים מרובים

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

פוטו-ליתוגרפיה גובה רב שלבי משתנה עבור Valved רב שכבתי מכשירים microfluidic

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

זיהוי ויזואלי של מספר חומצות גרעין ב מערך נימי

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...