ברצוננו להודות בחביבות פרופ ' ד ר לותאר Willmitzer בשל מעורבותו בפרוייקט, בדיונים פרודוקטיביים ולאחר השגחה מעולה. אנחנו אסירי תודה ד ר דניאל Veyel שעזרת עם מדידות MS פרוטיאומיה מבנית. אנחנו מעריכים מיכאליס Änne גברת מי סיפק לנו עזרה טכנית שלא תסולא בפז מדידות LC-MS. יתר על כן, ברצוננו להודות ד ר מוניקה Kosmacz, ד ר Ewelina Sokołowska שלהם לעזרה ומעורבות בעבודה על כתב היד המקורי, ולא כדי Weronika Jasińska לקבלת תמיכה טכנית.

<ol>
	<li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolites+as+global+regulators:+A+new+view+of+protein+regulation.">Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation.</a> Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).</li><li>Schlattner, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Function+of+Mitochondrial+Nm23-H4+Protein+in+Phosphotransfer+and+Intermembrane+Transfer+a+cardiolipin-dependent+switch.">Dual Function of Mitochondrial Nm23-H4 Protein in Phosphotransfer and Intermembrane Transfer a cardiolipin-dependent switch.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 111-121 (2013).</li><li>Ram&#237;rez, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+binding+regulates+cellular+localization+of+Parkinson's+disease-associated+LRRK2.">GTP binding regulates cellular localization of Parkinson's disease-associated LRRK2.</a> Human Molecular Genetics. , ddx161 (2017).</li><li>Jung, H. J., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+deconvolution+of+bioactive+small+molecules:+the+heart+of+chemical+biology+and+drug+discovery.">Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery.</a> Archives of Pharmacal Research. 38 (9), 1627-1641 (2015).</li><li>Harding, M. W., Galat, A., Uehling, D. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor+for+the+immunosuppressant+FK506+is+a+cis-trans+peptidyl-prolyl+isomerase.">A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase.</a> Nature. 341 (6244), 758-760 (1989).</li><li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li><li>Manabe, Y., Mukai, M., Ito, S., Kato, N., Ueda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLAG+tagging+by+CuAAC+and+nanogram-scale+purification+of+the+target+protein+for+a+bioactive+metabolite+involved+in+circadian+rhythmic+leaf+movement+in+Leguminosae.">FLAG tagging by CuAAC and nanogram-scale purification of the target protein for a bioactive metabolite involved in circadian rhythmic leaf movement in Leguminosae.</a> Chemical Communications. 46 (3), 469-471 (2010).</li><li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery.">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> Journal of Biomolecular Screening. 6 (6), 429-440 (2001).</li><li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+In+vivo+Metabolite-Protein+Interactions+by+Large-Scale+Systematic+Analyses.">Analyzing In vivo Metabolite-Protein Interactions by Large-Scale Systematic Analyses.</a> Current Protocols in Chemical Biology. , 181-196 (2010).</li><li>Maeda, K., Poletto, M., Chiapparino, A., Gavin, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protocol+for+the+purification+and+characterization+of+water-soluble+complexes+of+affinity-tagged+proteins+and+lipids.">A generic protocol for the purification and characterization of water-soluble complexes of affinity-tagged proteins and lipids.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2256-2266 (2014).</li><li>Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+in+vivo+metabolite-protein+interactions+revealed+by+large-scale+systematic+analyses.">Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses.</a> Cell. 143 (4), 639-650 (2010).</li><li>Veyel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+detection+of+protein-small+molecule+complexes+suggests+extensive+metabolite+regulation+in+plants.">System-wide detection of protein-small molecule complexes suggests extensive metabolite regulation in plants.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li><li>Luzarowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+with+metabolomic+and+proteomic+analysis+unravels+diverse+roles+of+nucleoside+diphosphate+kinases.">Affinity purification with metabolomic and proteomic analysis unravels diverse roles of nucleoside diphosphate kinases.</a> Journal of Experimental Botany. , (2017).</li><li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+interactomics+reveals+a+complex+core+cell+cycle+machinery+in+Arabidopsis+thaliana.">Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular systems biology. 6 (1), 397 (2010).</li><li>Giavalisco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+formula+annotation+of+polar+and+lipophilic+metabolites+using+13C,+15N+and+34S+isotope+labelling,+in+combination+with+high-resolution+mass+spectrometry.">Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using 13C, 15N and 34S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry.</a> The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).</li><li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+transcription+factor+complexes+from+Arabidopsis+cell+suspension+cultures+by+tandem+affinity+purification.">Isolation of transcription factor complexes from Arabidopsis cell suspension cultures by tandem affinity purification.</a> Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 195-218 (2011).</li><li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tandem+affinity+purification-based+technology+platform+to+study+the+cell+cycle+interactome+in+Arabidopsis+thaliana.">A tandem affinity purification-based technology platform to study the cell cycle interactome in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 6 (7), 1226-1238 (2007).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. -. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301 (2016).</li><li>Hooper, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUBAcon:+a+consensus+algorithm+for+unifying+the+subcellular+localization+data+of+the+Arabidopsis+proteome.">SUBAcon: a consensus algorithm for unifying the subcellular localization data of the Arabidopsis proteome.</a> Bioinformatics. 30 (23), 3356-3364 (2014).</li><li>Katajamaa, M., Ore&#353;i&#269;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+processing+for+mass+spectrometry-based+metabolomics.">Data processing for mass spectrometry-based metabolomics.</a> Journal of Chromatography A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STITCH+5:+augmenting+protein-chemical+interaction+networks+with+tissue+and+affinity+data.">STITCH 5: augmenting protein-chemical interaction networks with tissue and affinity data.</a> Nucleic Acids Research. 1277, (2015).</li><li>Tanaka, K. -. i., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dipeptidyl+compounds+ameliorate+the+serum-deprivation-induced+reduction+in+cell+viability+via+the+neurotrophin-activating+effect+in+SH-SY5Y+cells.">Dipeptidyl compounds ameliorate the serum-deprivation-induced reduction in cell viability via the neurotrophin-activating effect in SH-SY5Y cells.</a> Neurological Research. 34 (6), 619-622 (2012).</li><li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=METLIN:+A+metabolite+mass+spectral+database.">METLIN: A metabolite mass spectral database.</a> Therapeutic Drug Monitoring. 27, 747-751 (2005).</li><li>Bhattacharyya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+protein-protein+interactions+perturb+E.+coli+metabolome+and+cause+gene+dosage+toxicity.">Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול הציג מאפשר זיהוי מקבילי של מתחמי PP ו- PM של חלבון המטרה. מ שיבוט על התוצאות הסופיות, ניתן להשלים את הניסוי קצת כמו 8-12 שבועות. AP מלאה אורכת כ 4-6 h עבור קבוצה של 12 עד 24 דגימות, עיבוד פרוטוקול שלנו מתאימים לניתוח תפוקה באמצע.
הפרוטוקול, למרות להיות בסך הכל פשוטה, יש מספר שלבים קריטיים. (i) כמות מספקת של חלבון קלט וחרוזים זיקה חיוני להגיע טווח דינמי של המטבוליט זיהוי. פירוק התא יעיל לכן צעד מכריע בהליך. התשואות המסכן חלבון יכול להיות תוצאה של pulverization לא מספקת של החומר או של שיוצרת יחס פירוק-מאגר/חומר. (ii) להקפיד כי ריאגנטים בשימוש הם ידידותיים MS. חומרי ניקוי חזקים, גליצרול או כמויות מוגזמות של מלח יש להימנע ככל מתערבות MS זיהוי. (iii) חרוזים Agarose לא צריך להיות יבשים יתר במהלך שטיפת שלבים, כאשר משתמש של יריעה ואקום זה חשוב להחיל קצב זרימה איטית כדי לא כדי להרוס את החרוזים או להשפיע על יציבות מורכבים.
ישנם כמה שינויים אפשריים חשובים בפרוטוקול הציג: (i) נשתמש האמרגן CaMV35S המכונן כדי למקסם את כמות החלבון פיתיון. ביטוי, בעוד מאוד שימושי, ניתן להיות השפעה רצינית על הומאוסטזיס תא28 , להוביל להיווצרות אינטראקציות לא רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. ביטוי של חלבונים מתויגים באמצעות היזמים מקורי שבו האפשר רקע אובדן-של-פונקציה נחשב נעלה לאחזור interactors הביולוגית האמיתית. חלבונים בדרך כלל לא באה לידי ביטוי בתרבויות תא צמח, צמח רקע יוכיח הדרושות כדי לזהות interactors רלוונטיים. (ii) בעת עבודה עם קרום חלבונים, המאגר פירוק צריך להיות בתוספת של דטרגנט התואמים ל- MS. (iii) הקדמה של שלב טיהור זיקה שני יכול לשפר שווא-תוצאות חיוביות ליחס חיובי true, לבטל את הצורך פקדים EV29. תג טנדם הרומן עם שני אתרים פרוטאז עצמאית-המחשוף מציג חלופה אטרקטיבית השלב גודל-הדרה כרומטוגרפיה שנוספו על-ידי. et al. 2014 מיאדה11, זה מפרך וגם זמן רב.
החיסרון החמורה ביותר של נקודת הגישה הוא שיעור גבוה של תוצאות חיוביות שגויות. הסיבות הן רבות. ביטוי מכוננת כבר הוזכר. מקור נוסף של אינטראקציות לא רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, אלא אם כן עובד עם organelles מבודד, הוא הכנת כל-תא lysates המכיל תערובת של חלבונים ושל מטבוליטים של תאים subcellular שונים. לוקליזציה subcellular אמור לשמש כדי לבצע סינון עבור interactors אמיתי. ובכל זאת, הרוב המכריע של תוצאות חיוביות שגויות כתוצאה איגוד לא ספציפי בין חלבונים שרפים agarose. הקדמה של שלב טיהור שני, כפי שתוארה לעיל, מציעה את הפתרון הטוב ביותר לבעיה, עם זאת מגיע על חשבון זמן ותפוקת. יתר על כן, אינטראקציה חלשה עלול ללכת לאיבוד כמו הפרוטוקול מתארך. אזהרה נוספת של AP הוא למרות מידע מקיף שמספק לגבי interactome של חלבון המטרה, המבדילים בין היעדים הישירים והעקיפים של החלבון פתיונים הוא בלתי אפשרי. גישות ריאקציה דו-מולקולרית יישוב נדרשים לאשר אינטראקציות.
AP בשילוב עם גליקומיקס מבוססי MS שימש ללמוד חלבון-מתחמי cerevisiae ס12. עבודה זו, יחד עם שלנו תצפית קודמות13 , באופן דומה כדי שומנים, תרכובת פולאר polar למחצה להישאר מאוגד ל קומפלקסי חלבון מבודד תאית lysates, סיפק והיערכות מושגית עבור פרוטוקול שהוצגו. פרוטוקול שלנו מאופיין על ידי שלוש נקודות ייחודיות: (i) לעומת זאת כדי השמרים לעבוד12, הוא מדגים כי AP מתאים מאחזר לא רק חלבון הידרופובי אבל גם הידרופילית ליגנדים. (ii) בהצגת נוהל חילוץ 3-in-one, AP יחיד ניתן ללמוד interactors חלבון ו מטבוליט של החלבון פיתיון. (iii). שינינו את פרוטוקול לשתול תאים.
המאמצים העתידיים יתמקד ביצירת תג טנדם הרומן עם שני אתרים פרוטאז עצמאית-המחשוף. אנחנו רוצים גם לחקור את התאמתו של הפרוטוקול כדי נמוך-שפע מולקולות קטנות כמו הורמונים צמחיים.

השיטה המתוארים כאן מטרות על הזיהוי של המטבוליט וחלבון השותפים של חלבון של בחירה בתנאים lysate הסלולר ליד -ב- vivo . זה כבר העריכו שיש רבים מטבוליטים יותר מאשר מאופיין היום של פונקציית רגולציה חשוב1. מטבוליטים יכול לשמש מתגים ביולוגי, לשנות את הפעילות, פונקציונליות, ו/או לוקליזציה של שלהם קולטן חלבונים2,3,4. בעשור האחרון מספר שיטות פריצת דרך, המאפשרת זיהוי של PMI ויוו או בתנאים ליד -ב- vivo , כבר מפותחת5. גישות זמין ניתן להפריד לשתי קבוצות. הקבוצה הראשונה כוללת טכניקות להתחיל עם פיתיון ידוע-מטבוליט על מנת ללכוד חלבון הרומן שותפים. שיטות כוללות זיקה כרומטוגרפיה6, סמים זיקה היעד מגיב-יציבות assay7, כימותרפיה-פרוטאומיקס8ו פרוטאום תרמית פרופיל9. הקבוצה השנייה מורכבת שיטה אחת שמתחילה חלבון ידוע על מנת לזהות מולקולה קטנה ליגנדים10,11.
AP בשילוב עם lipidomics מבוססי MS שימש כדי לנתח חלבון-השומנים מתחמי האפייה12. כנקודת התחלה, המחברים השתמשו זני שמרים לבטא 21 אנזימים המעורבים ביוסינטזה ergosterol, 103 kinases דבוקה הוא לטיהור טנדם-זיקה (ברז) תג. 70% של האנזימים ו-20% kinases נמצאו לאגד ליגנדים הידרופובי שונים, ושופך אור לתוך הרשת אינטראקציית חלבון מורכב-השומנים.
בעבר, יכולתי נדגים, באופן דומה כדי שומנים, תרכובת פולאר polar למחצה גם להישאר מאוגד ל קומפלקסי חלבון מבודד lysates הסלולרית13. על סמך ממצאים אלה, החלטנו למטב את AP שיטת שפורסם בעבר10,11 תאי צמחים, תרכובות הידרופילית14. למטרה זו, השתמשנו ברז וקטורים, מתוארת על ידי ואן Leene. ואח 2010, משתמשים בהצלחה במפעל PPI מחקרים15. כדי לקצר את משך הזמן הנדרש להשגת שורות מהונדס, החלטנו על תרביות תאים תודרנית. אנחנו מועסקים מתיל טרטצעד אחד-בוטיל אתר, (MTBE) / מתנול/מים החילוץ שיטה, המאפשר אפיון חלבונים (גלולה), ליפידים (שלב אורגני) ו הידרופילית מטבוליטים (פאזה מימית)16 יחיד זיקה-טיהור הניסוי. EV בקרת קווי הוכנסו כדי לא לכלול תוצאות חיוביות שגויות, כגון חלבונים מחייב את התג לבד. כמו הוכחת לנו מתויגות שלוש (מתוך חמש) nucleoside diphosphate kinases להציג הגנום תודרנית (NDPK1-NDPK3). בין השאר, אנחנו יכול להדגים כי NDPK1 אינטראקציה עם גלוטתיון S-טרנספראז גלוטטיון. כתוצאה מכך נוכל להוכיח כי NDPK1 הוא נתון glutathionylation14.
לסיכום, פרוטוקול הציג היא כלי חשוב עבור אפיון חלבון ורשתות אינטראקציית חלבון-מולקולה קטנה ומהווה התקדמות גדולה על פני שיטות קיימות.

<table><tbody><tr><td>Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6899</td><td></td></tr><tr><td>1-Naphthylacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1641</td><td></td></tr><tr><td>Kinetin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6776</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>E-64 protease inhibitor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV Protease</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>12575015</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese&amp;nbsp;Gel 30 (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.2</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>SBP Tag Antibody (SB19-C4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-101595</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>V5071</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>MTBE&amp;nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>138906</td><td></td></tr><tr><td>Methanol&amp;nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>136806</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Biosolve</td><td>232106</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Biosolve</td><td>12006</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid&amp;nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>202341</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid&amp;nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>69141</td><td></td></tr><tr><td>Unimax 2010 Platform Shaker</td><td>Heidolph</td><td>5421002000</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Mesh (Wire diameter 34 &amp;micro;M, thickness 55 &amp;micro;M, open area 14%)</td><td>Prosepa</td><td>Custom order</td><td></td></tr><tr><td>Glass Funnel, 47 mm, 300 ml</td><td>Restek</td><td>KT953751-0000</td><td></td></tr><tr><td>Filter Bottle Top 500 mL 0,2 &amp;micro;M Pes St</td><td>VWR International GmbH</td><td>514-0340</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Mill MM 400</td><td>Retsch GmbH</td><td>207450001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0969-02</td><td></td></tr><tr><td>Mobicol &quot;&quot;Classic&quot;&quot; with 2 different screw caps without filters</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>Filter (small) 35 &amp;micro;M pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 &amp;amp; M1053</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M513515</td><td></td></tr><tr><td>Variable Speed Tube Rotator SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y550.1</td><td></td></tr><tr><td>Rotary dishes for rotators SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y555.1</td><td></td></tr><tr><td>Resprep 24-Port SPE Manifolds</td><td>Restek&amp;nbsp;</td><td>26080</td><td></td></tr><tr><td>Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml</td><td>Teknokroma</td><td>TR-F034000</td><td></td></tr><tr><td>Autosampler&amp;nbsp;Vials</td><td>Klaus Trott Chromatographie-Zubeh&amp;ouml;r</td><td>40 11 01 740</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 LC Column</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>164534</td><td></td></tr><tr><td>EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>LC120</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC system&amp;nbsp;</td><td>Waters&amp;nbsp;</td><td>Custom order</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 &amp;micro;M, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg</td><td>Waters&amp;nbsp;</td><td>186003533</td><td></td></tr><tr><td>High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions</td><td>Bandelin</td><td>RK 31</td><td></td></tr><tr><td>Genedata Expressionist</td><td>Genedata</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur Software</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>NaN</td><td>NaN</td><td></td></tr></tbody></table>

2 in 1: one-step affinity purification for the parallel analysis of protein-protein and protein-metabolite complexes

תהליכים תאיים מוסדרים על ידי אינטראקציות בין מולקולות ביולוגיות כגון חלבונים, מטבוליטים ו חומצות גרעין. אמנם אין חידוש החקירה של אינטראקציות חלבון (PPI), גישות ניסיוניות מכוון לאפיון אינטראקציות חלבון-מטבוליט אנדוגני (PMI) מהווים התפתחות למדי. במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר אפיון סימולטני של PPI, PMI של חלבון של בחירה, המכונה פיתיון. פרוטוקול שלנו היה מותאם עבור תא תודרנית תרבויות, והוא משלב זיקה טיהור (AP) עם ספקטרומטר מסה (MS)-המבוסס על זיהוי חלבונים, מטבוליט. בקיצור, קווים תודרנית מהונדס, המבטאים חלבונים פיתיון דבוקה תג קירבה, הם קודם lysed להשיג תמצית הסלולר מקורית. נוגדנים אנטי-תג משמשים כדי להוריד את השותפים חלבון ו מטבוליט של החלבון פיתיון. מתחמי מטוהרים זיקה מופקים באמצעות מתיל טרטצעד אחד-בוטיל אתר (MTBE) / מתנול/מים בשיטה. בעוד מטבוליטים להפריד את קוטבי או השלב הידרופוביות, ניתן למצוא חלבונים בגדר. מטבוליטים והן חלבונים מכן נותחו על ידי אולטרה-ביצועים נוזלי כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (UPLC-MS או UPLC-MS/MS). ריק-וקטור (EV) בקרת קווי משמשים כדי לא לכלול תוצאות חיוביות שגויות. היתרון העיקרי של פרוטוקול שלנו הוא שהם מאפשרים זיהוי של שותפים חלבון ו מטבוליט של חלבון המטרה במקביל בתנאים ליד-פיזיולוגיים (סלולריים lysate). השיטה הציג היא פשוטה, מהירה, ניתן להתאים בקלות למערכות ביולוגיות חוץ תרביות תאים הצמח.

במחקר המקורי, בשלושה גנים לבנה א NDPK היו overexpressed בתרבויות PSB-L תא ההשעיה תחת השליטה של יזם 35S מכוננת14 (איור 1). תג קירבה טנדם שהיה מחובר מקצוות carboxy - או אמינו-מסוף חלבון פיתיון לגבו. מתחמי מטוהרים זיקה היו נענשים MTBE/מתנול/מים החילוץ16. משך-זיקה חלבונים ומולקולות קטנות אותרו באמצעות MS (טבלאות S2, S3).
לתיקון תוצאות חיוביות שגויות, דגימות ריק שימשו כדי לא לכלול מזהמים מולקולה קטנה מן כימיקלים מעבדה מתכלים. יתר על כן, מטבוליטים וחלבונים לאגד גם תג קירבה או שרף לבד היה אליבי באמצעות קווי הבקרה EV. כדי לאחזר תוצאות חיוביות נכון, דו-זנבית בלתי-זוגי של התלמיד במבחן t וקצב בנימיני & הוכברג גילוי שקר הוחל תיקון כדי לזהות מטבוליטים (טבלה S4), חלבונים (טבלה S5) באופן משמעותי מועשר בנקודת הגישה NDPKs ניסויים (N - ו C-סופני מתויג NDPKs) לעומת הקווים שליטה EV (פד ר < 0.1). שימו לב כי עבודה קודמות, נהגנו היעדרות/נוכחות קריטריונים ניסחו interactors חלבון ומולקולה קטנה.
נציג תוצאות ניתנות עבור NDPK1, בעוד מטבוליט נתונים להתמקד dipeptides, מחלקה הרומן של הרגולטורים מולקולה קטנה למד בקבוצה שלנו. ניתוח פרוטיאומיה מבנית גילה 26 שותפים חלבון בשם של NDPK1. על-ידי סינון נוסף חלבונים משותפת לשפות אחרות בתא subcellular אותו בתור NDPK1 (ציטוזול), הרשימה צמצמנו 13 חלבון בשם interactors. בין החלבונים שזוהו היו גלוטתיון S-טרנספראז, התארכות שני גורמים חניכה, טובולין, aconitate hydratase. ניתוח Metabolomic גילה ארבעה dipeptides ואל-Leu באיל-Glu, Leu-איל, איל-Phe זה במיוחד משותפת eluted עם NDPK1 (איור 2). שים לב כי כל dipeptides ארבע לשתף משקע הידרופובי ב שלהם אמיני, רומז משותפת מחייב ירידה לפרטים.
לחפש מתחמי חלבון, חלבון-מטבוליט ידוע לנו 13 המאוחזרים לזהות חלבונים ו dipeptides ארבעה נגד תפר מסד25 (איור 3). מספר תצפיות עשוי להיות: (i) אף אחד interactors דווח קודם לכן עבור NDPK1. (ii) APX1 ortholog דווח לקיים אינטראקציה עם אלדהיד דהידרוגנאז משפחה ALDH7B4, תוך תרגום חניכה פקטור FBR12 עם תרגום חניכה גורם נוסף מקודדת על ידי הגן AT2G40290. (iii) dipeptides מזוהה לא דיווחו על חלבון שותפים. Dipeptides eluted משותפת לא דווחו קודם הקשורות אל כל חלבון צמחי שאוחזרו. עם זאת, הם תפקיד חשוב אורגניזמים אחרים: Leu-איל, למשל, יש אפקט neurotrophin-מפעיל קו26תאים אנושיים. שימו לב כי הניסוי אינו מאפשר לזהות את הטופולוגיה המדויק של המערכת. לדוגמה, dipeptide ייתכן אינטראקציה ישירה עם NDPK1 אך עשויות להיות קשורות היטב לכל אחד החלבונים משותפת מטוהרים.
יחדיו, התוצאות שלנו להראות כי ההליך הוקמה, העסקת AP יחד עם ספקטרומטר מסה, מאפשר זיהוי של חלבון, חלבון-מולקולה קטנה interactors, מסייע ליצור מידע נרחב אודות interactome של החלבון היעד.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg"> איור 1. ערכה של זרימת עבודה AP-MS. (א) הכנה של השבר מסיסים מקורית של תרבית תאים. השלבים הבאים (ב') במסגרת ההליך AP. לאחר טעינת המדגם אל העמודה, נקשר החלבון עניין (פוי) התמזגו לתגית ברז הנוגדן IgG ותשמרו על החרוזים agarose. כביסה של העמודה מקלה על הסרת חלבונים לא מאוגד מטבוליטים. לאחר ביצוע AcTEV המחשוף, מתחמי חלבון-מטבוליט פוי הם eluted. (ג) ההפרדה של מתחמי לתוך שבר חלבון ו מטבוליט שלאחריה יבוא ניתוח MS הכמותיים למחצה. חלק איור זה מתרבה מ. ואח 2017 Luzarowski14. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg"> באיור 2. במיוחד eluting יחד עם NDPK1 dipeptides. עוצמות ממוצע של ארבעה dipeptides ואל-Leu (א), איל-Glu (B), Leu-איל (ג)ואיל-Phe (D) שנמדד בניסוי AP שורטטו. כל dipeptides ארבע להראות העשרה משמעותי בדגימות NDPK1 לעומת שליטה EV (כוכביות מייצגים רוזוולט < 0.1). קווי שגיאה מייצגים שגיאת התקן עבור מדידות 6 (3 ושכפול של N - ו 3 של C-סופני מתויג חלבונים). <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg"> איור 3. אינטראקציה עם רשת של כל המולקולות eluting בשיתוף עם NDPK1, שאילתה מול מסד הנתונים תפר שוקל רק הקודם ניסיוני, עדויות של מסד הנתונים (ביטחון > 0.2). בטחון גבוהה יותר מצביעה על סיכון גבוה יותר של אינטראקציה, מחושב בהתבסס על הנתונים הופקדו. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
שולחן S1. MaxQuant פלט טבלת "parameters.txt". העניינים כולל ערכי סף עבור זיהוי, כימות, כמו גם מידע אודות מסדי הנתונים המשמש. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
שולחן S2. מידע MaxQuant פלט טבלת "proteinGroups.txt". הטבלה מכילה רשימה של כל קבוצות שזוהה חלבון, עוצמות, פרטים נוספים כגון מספר ייחודי פפטידים והניקוד. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
שולחן S3. קובץ פלט ובו ניתוח של מטבוליטים קוטבי. הטבלה מכילה רשימה של כל התכונות המוני מזוהה המאופיין מ ספציפי/z, RT ועוצמה. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
שולחן S4. Dipeptides נמצאו בדגימות AP אשר NDPK1, NDPK2 או NDPK3 שימשו בתור פיתיון. Dipeptides נוכח בדגימות ריק לא נכללו ברשימה. שני עצמאית קווים (מתויג ב או או C-אמיני) עבור כל NDPK היו להפעיל בשלושה עותקים. הסטודנט t-מבחן ולמנף תיקון של p-ערך באמצעות בנימיני & שיטה הוכברג שימשו כדי לקבוע באופן משמעותי מועשר שותפים אינטראקטור של NDPKs (פד ר < 0.1). בהתחשב ΔRT מחושבת ביחס הפניה תרכובות של Δppm ביחס monoisotopic המוני נתון Metlin27. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
שולחן S5. חלבונים מטוהרים בשיתוף עם NDPK1. שני עצמאית קווים (מתויג ב או או C-אמיני) עבור כל NDPK נוהלו דולר. הסטודנט t-מבחן ולמנף תיקון של p-ערך באמצעות בנימיני & שיטה הוכברג שימשו כדי לקבוע באופן משמעותי מועשר שותפים אינטראקטור של NDPKs (פד ר < 0.1). <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes at JoVE.com

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-מטבוליט מכריעים עבור כל פונקציות הסלולר. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח מקביל של אינטראקציות אלה עם חלבון של בחירה. פרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הצמח תרביות תאים, והוא משלב טיהור זיקה עם חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה וזיהוי מטבוליט.

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

2-1-one-step-affinity-purification-for-parallel-analysis-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.2K Views.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-מטבוליט מכריעים עבור כל פונקציות הסלולר. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח מקביל של אינטראקציות אלה עם חלבון של בחירה. פרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הצמח תרביות תאים, והוא משלב טיהור זיקה עם חלבון מבוסס ספקטרומטר ?...

Video: 2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is also a key component in the development of new therapeutics. The evolving era of functional proteomics is fueling the demand for high-throughput protein purification and improved techniques to facilitate this. It was hypothesized that a multi column plate adaptor (MCPA) can interface multiple chromatography columns of different resins with multi-well plates for parallel purification. This method offers an economical and versatile method of protein purification that can be used under gravity or vacuum, rivaling the speed of an automated system. The MCPA can be used to recover milligram yields of protein by an affordable and time efficient method for subsequent characterization and analysis. The MCPA has been used for high-throughput affinity purification of SH3 domains. Ion exchange has also been demonstrated via the MCPA to purify protein post Ni-NTA affinity chromatography, indicating how this system can be adapted to other purification types. Due to its setup with multiple columns, individual customization of parameters can be made in the same purification, unachievable by the current plate-based methods.

A multi-column plate adapter allows chromatography columns to be interfaced with multi-well collection plates for parallel affinity or ion exchange purification providing an economical high throughput protein purification method. It can be used under gravity or vacuum yielding milligram quantities of protein via affordable instrumentation.

מערכת טיהור חלבונים חסכונית ורב-תכליתית בעלת תפוקה גבוהה באמצעות מתאם צלחת רב-עמודות

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

<meta charset="utf8"></head><body>מיטוב FPLC לטיהור יעיל של חלבון FEN1 המתויג שלו

Affinity Purification of a 6X-His-Tagged Protein using a Fast Protein Liquid Chromatography System

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. The Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system allows high-resolution separation of complex protein mixtures. By adjusting various parameters in FPLC, such as selecting the appropriate purification matrix, regulating the protein sample's temperature, and managing the sample's flow rate onto the matrix and the elution rate, it is possible to ensure the protein's stability and functionality. In this protocol, we will demonstrate the versatility of the FPLC system to purify 6X-His-tagged flap endonuclease 1 (FEN1) protein, produced in bacterial cultures. To improve protein purification efficiency, we will focus on multiple considerations, including proper column packing and preparation, sample injection using a sample loop, flow rate of sample application to the column, and sample elution parameters. Finally, the chromatogram will be analyzed to identify fractions containing high yields of protein and considerations for proper recombinant protein long-term storage. Optimizing protein purification methods is crucial for improving the precision and reliability of protein analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: אופטימיזציה של כרומטוגרפיית זיקה לחלבון FEN1 המתויג שלו

This article provides a procedure for the affinity purification of a human recombinant protein, flap endonuclease 1 (FEN1), which has been labeled with a 6X-histidine tag. The protocol involves the utilization of two distinct immobilized metal ion columns for the purification of the tagged protein.

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר 

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Biology

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

מערכת טיהור חלבונים חסכונית ורב-תכליתית בעלת תפוקה גבוהה באמצעות מתאם צלחת רב-עמודות

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL