We would like to acknowledge and thank Tom Goddard at University of California San Francisco for his endless help with Chimera, Joel Mancuso and Chris Booth at Gatan, Inc. for their help with SBF-SEM data collection of bacteria dataset, Doug Wei at Zeiss, Inc. for his help with the FIB-SEM data collection of epithelial cell dataset, Kent McDonald at University of California Berkeley Electron Microscopy Lab for advice on sample preparation, TEM imaging and tomography, Roseann Csencsits at Lawrence Berkeley National Laboratory for her help taking the cryo-TEM image, Elena Bosneaga for cryo-sectioning of the plant dataset, Jocelyn Krey at Oregon Health and Science University for the dissection of utricle tissue, David Skinner at National Energy Research Scientific Computing Center (NERSC) and Jitendra Malik at University of California Berkeley for their advice in software infrastructure, and Pablo Arbelaez at&#160;University of California Berkeley&#160;for his codes contributions to the custom-tailored script presented in this article. 
Research was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Science under contract No. DE-AC02-05CH11231 [David Skinner], as well as U.S. National Institutes of Health (NIH) grant No. P01 GM051487 [M.A.] for the inner ear hair cell project and microscopy instrumentation use.

<ol>
	<li>Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+cryo-microscopy+as+a+powerful+structural+tool+in+molecular+medicine.">Three-dimensional electron cryo-microscopy as a powerful structural tool in molecular medicine.</a> J Mol Med (Berl). 78 (4), 191-202 (2000).</li><li>Johnson, M. C., Rudolph, F., Dreaden, T. M., Zhao, G., Barry, B. A., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+two-dimensional+crystallization+trials+of+small+membrane+proteins+for+structural+biology+studies+by+electron+crystallography.">Assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (44), e1846 (2010).</li><li>Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Gibson, G. A., Watkins, S. C., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+for+3D+structural+analysis+of+dynamic+interactions.">Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (76), e50386 (2013).</li><li>Meng, X., Zhao, G., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+HIV-1+capsid+assemblies+by+cryo-electron+microscopy+and+iterative+helical+real-space+reconstruction.">Structure of HIV-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (54), e3041 (2011).</li><li>Chen, S., McDowall, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Cryotomography+of+Bacterial+Cells.">Electron Cryotomography of Bacterial Cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (39), e1943 (2010).</li><li>Meyerson, J. R., White, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (58), e2770 (2011).</li><li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+by+electron+tomography:+from+cells+to+molecules.">Structural studies by electron tomography: from cells to molecules.</a> Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).</li><li>Bajaj, C., Yu, Z., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+feature+extraction+and+visualization+of+tomographic+molecular+imaging.">Volumetric feature extraction and visualization of tomographic molecular imaging.</a> J Struct Biol. 144 (1-2), 132-143 (2003).</li><li>Lin, G., Adiga, U., Olson, K., Guzowski, J. F., Barnes, C. A., Roysam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+3D+watershed+algorithm+incorporating+gradient+cues+and+object+models+for+automatic+segmentation+of+nuclei+in+confocal+image+stacks.">A hybrid 3D watershed algorithm incorporating gradient cues and object models for automatic segmentation of nuclei in confocal image stacks.</a> Cytometry A. 56 (1), 23-36 (2003).</li><li>Volkmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+variant+of+the+watershed+transform+for+segmentation+of+electron+density+maps.">A novel three-dimensional variant of the watershed transform for segmentation of electron density maps.</a> Journal of Structural Biology. 138 (1), 123-129 (2002).</li><li>Rigort, A., G&#252;nther, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+segmentation+of+electron+tomograms+for+a+quantitative+description+of+actin+filament+networks.">Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks.</a> Journal of structural biology. 177 (1), 135-144 (2012).</li><li>Cremers, D., Rousson, M., Deriche, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Statistical+Approaches+to+Level+Set+Segmentation.">A Review of Statistical Approaches to Level Set Segmentation.</a> Integrating Color, Texture, Motion and Shape. International Journal of Computer Vision. 72 (2), 195-215 (2007).</li><li>Lin, Z., Davis, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape-based+human+detection+and+segmentation+via+hierarchical+part-template+matching.">Shape-based human detection and segmentation via hierarchical part-template matching.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 32 (4), 604-618 (2010).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Zhang, Q., Bettadapura, R., Bajaj, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+structure+modeling+from+3D+EM+using+VolRover+2.0.">Macromolecular structure modeling from 3D EM using VolRover 2.0.</a> Biopolymers. 97 (9), 709-731 (2012).</li><li>Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+focused+ion+beam+milling+techniques+for+TEM+specimen+preparation.">A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation.</a> Micron. 30 (3), 197-204 (1999).</li><li>Heymann, J. A. W., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> Journal of structural biology. 155 (1), 63-73 (2006).</li><li>Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focussed+ion+beam+milling+and+scanning+electron+microscopy+of+brain+tissue.">Focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2588 (2011).</li><li>Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+Ion+Beam+(FIB)+combined+with+SEM+and+TEM:+Advanced+analytical+tools+for+studies+of+chemical+composition,+microstructure+and+crystal+structure+in+geomaterials+on+a+nanometre+scale.">Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale.</a> Chemical Geology. 261 (3-4), 217-229 (2009).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Frangakis, A. S., Hegerl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+reduction+in+electron+tomographic+reconstructions+using+nonlinear+anisotropic+diffusion.">Noise reduction in electron tomographic reconstructions using nonlinear anisotropic diffusion.</a> Journal of structural biology. 135 (3), 239-250 (2001).</li><li>Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+a+bilateral+denoising+filter+in+biological+electron+microscopy.">Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 144 (1), 114-122 (2003).</li><li>Van der Heide, P., Xu, X. P., Marsh, B. J., Hanein, D., Volkmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+automatic+noise+reduction+of+electron+tomographic+reconstructions+based+on+iterative+median+filtering.">Efficient automatic noise reduction of electron tomographic reconstructions based on iterative median filtering.</a> Journal of structural biology. 158 (2), 196-204 (2007).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>MathWorks. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MATLAB. , (2012).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> Systems, Man and Cybernetics, IEEE Transactions on. 9, 62-66 (1979).</li><li>Vedaldi, A., Fulkerson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> VLFeat: An Open and Portable Library of Computer Vision Algorithms. , (2008).</li><li>Zhu, S. C., Guo, C., Wang, Y., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+Textons?.">What are Textons?.</a> International Journal of Computer Vision. 62 (1-2), 121-143 (2005).</li><li>Gagnon, L. H., Longo-Guess, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloride+intracellular+channel+protein+CLIC5+is+expressed+at+high+levels+in+hair+cell+stereocilia+and+is+essential+for+normal+inner+ear+function.">The chloride intracellular channel protein CLIC5 is expressed at high levels in hair cell stereocilia and is essential for normal inner ear function.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10188-10198 (2006).</li><li>Briand, P., Petersen, O. W., Van Deurs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+diploid+nontumorigenic+human+breast+epithelial+cell+line+isolated+and+propagated+in+chemically+defined+medium.">A new diploid nontumorigenic human breast epithelial cell line isolated and propagated in chemically defined medium.</a> In vitro cellular &amp; developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 23 (3), 181-188 (1987).</li><li>Petersen, O. W., R&#248;nnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Shin, J. B., Krey, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+chick+vestibular+hair+bundle.">Molecular architecture of the chick vestibular hair bundle.</a> Nature neuroscience. 16 (3), 365-374 (2013).</li><li>Yang, W., Zeng, Z., Max, N., Auer, M., Crivelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+Surface+Models+of+Tubular+Bacteria+and+Cytoskeleta.">Simplified Surface Models of Tubular Bacteria and Cytoskeleta.</a> Journal of Information &amp; Computational Science. 9 (6), 1589-1598 (2012).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

באופן מסורתי, במיקרוסקופ האלקטרונים שדה (EM) היה מחולק ל1) סניף הביולוגיה המבני באמצעות TEM ברזולוציה גבוה וסופר גבוה, בשילוב בדרך כלל עם מידע סמוי או מפורש בממוצע כדי לחקור את המבנה תלת ממדים (3D) של קומפלקסי macromolecular עם הרכב מוגדר ובדרך כלל גודל קטן יחסית 1-4, ו2) סניף ההדמיה הסלולרי שבנופים סלולריים כולו הם דמיינו 1,5,6. בעוד ענף הביולוגיה המבני עבר פיתוח מרהיב בארבעת העשורים האחרונים, ענף הביולוגיה של התא היה בעיקר מוגבל לשני ממדים, לעתים קרובות על דגימות פחות מ-אופטימלי נשמרו. רק עם כניסתו של טומוגרפיה של האלקטרון בעשור האחרון יש הדמיה ultrastructural תא ביולוגית הורחבה לתוך הממד השלישי 5,7, שבו בדרך כלל בממוצע לא יכול להתבצע כנופים סלולריים, ובכך התכונות של עניין, הם בדרך כלל ייחודיים. למרות סצנות סלולריות דמיינו לעתים קרובות מדהימות לעין, מיצוי יעיל של התכונות של עניין וניתוח כמותי שלאחר מכן כרכים סלולריים המורכבים ביותר כגון לפגר, בין שאר משום שהרכב החלבון המדויק הוא בדרך כלל לא ידוע, ולכן עושה את זה מאתגר לפרש סלולארי אלה כרכי 3D. למועד זה, מומחיות ביולוגית נרחבת יש צורך לעתים קרובות כדי לפרש tomograms המורכב, או אפילו לזהות את האזורים החשובים ומרכיבים חיוניים בנפח 3D. כסיבוך נוסף, ויזואליזציה של כרכי 3D להפליא לא טריוויאלית. ניתן לחשוב כרכי 3D של וכך דמיינו כערימות של תמונות 2D. בדיקת Slice-by-פרוסת תמונות 2D רציפות מפחיתה את המורכבות, אך הוא גם גבולות כוללים חילוץ וניתוח ובכך כמותי לשני ממדים. עם זאת, עבור רוב אובייקטי 3D, התיאור של כרכי 3D רק כערימה של מטוסים ברציפות מובילה לשלמהפרספקטיבה מעוותת ד אל טבע 3D של מערכת מסוימת. צורות אלטרנטיביות לבדיקה ויזואלית דורשות גם טיוח נפח או משטח טיוח, ש- בהתחשב באופי לעתים קרובות הצפוף של סלולארי נפח-יכול בקלות להוביל להשקפה חסומה של אובייקטים מקוננים או להציף משתמש לחלוטין, ובכך פילוח ידני אינטראקטיבי קשה. כדי לתקן את החסמים אלה, מגוון גדול של חילוץ תכונה אוטומטי גישות (פילוח) פותחו שהן בדרך כלל גם density- או 8-10 מבוסס שיפוע. עם זאת, שיטות אלה נוטים למגזר כולו הנפח ללא קשר לאילו תחומים או תכונות הן עניין למומחה, אם כי חלק מהשיטות האחרונות יכולות למקד תכונה ספציפית של עניין, כגון סיביים אקטין 11. בנוסף, תוכניות ביצוע פילוח אוטומטי יכולות לפעמים לגרום לייצור של מספר רב של כרכי משנה (לדוגמא, בעת החלת immersio קו פרשת מיםn פילוח) שלעתים קרובות צריך להיות ממוזגים ידני בחזרה הלמרכיב את כל התכונה של עניין או להיות חשוף לפילוח נוסף. זה נכון בעיקר עבור ערכות נתונים מורכבות וצפופות, וכך האלגוריתמים ביותר טיוח אינם מסוגלים לחלץ רק את התכונות של עניין בנאמנות, ומאמצי אוצרות משמעותיים על ידי מומחה לעתים קרובות יש צורך לייצר רצוי נפח מפולח. יתר על כן, פתרונות מותאמים אישית לבעיה מאוד ספציפית, לעתים קרובות שפורסמו כנייר מפגש מדעי, עם לא מעט דגש על הפיכתם רחבה וכלים מקיפים נגישים לחוקרים שאין להם ידע אינטימי של תחומי מתמטיקה, מדעי מחשב ו / או גרפיקה ממוחשבת. סביבת תוכנת תכנות להתאמה אישית, המכילה מגוון רחב של ספריות ניתוח תמונה, יכולה להיות קבוצת כלי רבת ​​עוצמה המאפשרת למשתמשים לכתוב מודולים שלהם בצורה יעילה לפילוח מדויק. עם זאת, גישה זו דורשת שלוחההכשרת ensive ורקע במדעי מחשב כדי לנצל את התכונות או היכולות לניתוח תמונה רבות שלה. אחד יכול לעבוד בתוך כגון סביבת תוכנה תכליתית עבור קבוצות מסוימות הנתונים שבו התכונות דלילות יותר, למשל, על ידי שימוש בגישות המבוססת על צורה רבות עוצמה הנשענות על הגיאומטריה הייחודית של &quot;תבניות&quot; כדי להפריד בין אובייקטים של עניין מסביבתם 12,13 . מגוון הוגן של הדמיה חבילות גרפיקה ממוחשבת קיימים לפילוח ידני אינטראקטיבי ובניית מודל. חלק מהחבילות זמינות מסחרי, ואילו אחרים הם ממוצא האקדמי ומופצים ללא תשלום, כגון: אוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו 14 כימרה, אוניברסיטת קולורדו 15 IMOD, ואוניברסיטת טקסס אוסטין VolumeRover 16. עם זאת, מגוון ומורכבות הרחב של תכונות ויכולות תוכניות אלה יש steepens העקומה למידה עבור each. תוכניות הדמיה מסוימות לספק מודלים גיאומטריים פשוטים, כגון כדורים ומקלות בגדלים שונים, אשר יכול להיות ממוקם בתוך מפות צפיפות על מנת ליצור מודל מופשט של המורכב 3D הנפח. מודלים אלה לאחר מכן לאפשר מדידות גיאומטריות ונפח פשוטים ולכן מעבר לרק &quot;תמונה היפה&quot;. מעקב ידני כזה של אובייקטים עובד היטב עבור כרכים שבו רק מספר קטן של אובייקטים צריך להיות נעוצה וחילוץ. עם זאת, הפיתוח האחרון של ההדמיה ultrastructural 3D נפח הגדול תוך שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק אלומת יונים ממוקד (FIB-SEM) 17-20 או במיקרוסקופ אלקטרונים פנים סריקת בלוק סדרתי (SBF-SEM) 21 מציג את הסיבוך נוסף שהגודל של נתוני 3D סטים יכולים לנוע בין ג&#39;יגה לעשרות ומאות ג&#39;יגה, ואפילו טרה. לכן, כרכי 3D גדולים כזה הם כמעט בלתי נגישים להבלטת תכונות ידניות, והישג אוטומטי למחצה מודרך משתמש יעיל ומכאןחילוץ יור יהיה אחד מצווארי הבקבוק לניתוח יעיל של כרכי 3D בעתיד הנראה לעין. מוצג כאן ארבע גישות פילוח שונות המשמשות באופן שיגרתי במגוון רחב של סוגים ביולוגיים תמונה. אז שיטות אלה בהשוואה ליעילותם לסוגים שונים של ערכות נתונים, המאפשרות הידור למדריך כדי לעזור לביולוגים להחליט מה עשוי להיות גישת הפילוח הטובה ביותר להפקת תכונה יעילה של הנתונים שלהם. כמדריכים למשתמש מפורטים זמינים עבור רוב התוכניות המתוארות, המטרה היא לא להפוך את המשתמשים פוטנציאליים מכירים כל אחד מהחבילות אלה בפרט. במקום זאת, המטרה היא להפגין את העוצמות ומגבלות בהתאמה של אסטרטגיות פילוח השונות אלה על ידי יישום אותם לערכות נתונים שש דוגמא עם מאפיינים שונים. באמצעות השוואה זו, סדרה של קריטריונים פותחו המבוססות גם על מאפייני תמונה האובייקטיביים שלערכות נתונים 3D, כגון ניגוד נתונים, פריכות, צפיפות, ומורכבות, או נובעים משיקולים סובייקטיביים, כגון מטרה הרצויה עבור פילוח, מורפולוגיות של התכונות כדי להיות מקוטעות, צפיפות אוכלוסייה של התכונות של עניין, כלומר את החלק היחסי של הנפח תפוס על ידי התכונה של עניין, ואיך הוא יתקדם בצורה אופטימלית עם משאבים מוגבלים, כגון זמן וזמינות של צוות. ערכות נתונים אלה שונים דוגמא ממחישות כיצד ניתן ליישם קריטריונים אובייקטיביים וסובייקטיביים אלה ברצף במגוון רחב של שילובים כדי להניב זיווג של גישות חילוץ תכונה מסוימות עם סוגים מסוימים של ערכות נתונים. ההמלצות ניתנו יהיה בתקווה לעזור טירונים מתמודדות עם מגוון גדול של אפשרויות פילוח לבחור את גישת הפילוח היעילה ביותר עבורו 3D הנפח שלהם. למרות ההתמקדות של מאמר זה הוא הבלטת תכונות, תשומת לב לאיסוף נתונים ועיבוד נתונים מראש הוא קריטי לים יעילegmentation. לעתים קרובות הכתמה של דגימות יכולה להיות לא אחידה, ולכן, יש לשקול חפצים מכתים פוטנציאליים בהליך הפילוח. עם זאת, כתם בדרך כלל נותן אות לרעש גבוהה יותר, ולכן דורש פחות סינון וטיפול מתמטי אחר של כרכים סלולריים, אשר עלול גם לגרום לחפצים. ערכות נתונים תמונת הגלם המתאימות צריכה להיות שנרכשו בהגדרות קונטרסט ופיקסל מצלמה הנכונות, מיושר, ושחזרו ל3D נפח. לtomograms, תמונות מיושרות משוחזרות בדרך כלל באמצעות משוקללת בחזרה הקרנה, ולאחר מכן ערכת הנתונים היא בדרך כלל נתון לאלגוריתמי denoising כגון דיפוזיה אינה ליניארי איזוטרופי 22, סינון דו צדדי 23, או חציון רקורסיבית סינון 24. נתוני הדמיה FIB-SEM וSBF-SEM מיושרים ידי פרוסות ברציפות מקשר צולבות בXY תוכניות ניצול כגון ImageJ 25. שיפור לעומת וסינון ניתן ליישם כדי לשפר את התכונות שלריבית ובכך לבטל את רעש ערימת התמונה. סינון יכול להתבצע גם על כל הנפח לפני subvolume בחירה או על subvolumes נבחר, כגישות סינון יכולות להיות המחשוב יקרה. Down-הדגימה של נתונים (binning), אשר לעתים משמש להפחתת רעש ו / או צמצום גודל קובץ, מומלץ רק אם הנתונים כבר oversampled באופן משמעותי בהשוואה להחלטה הצפויה. לאחר הפחתת רעשים, אז יכולות להיות מפולחות התמונות מעובדות על ידי שיטות שונות, ולהתמקד במחקר זה הוא על ארבעה אלה: (1) דור מופשט מדריך למודל באמצעות יצירת מודל כדור מקל ו, (2) מעקב ידני של תכונות של עניין, (3) צפיפות מבוססת סף אוטומטי, ו (4) פילוח אוטומטי בהתאמה אישית באמצעות תסריט לפילוח ספציפי פרויקט. פילוח גבול 8 ופילוח פרשת המים immersive 10 חלופות טובות יותר לקביעת ערכי סף פשוט, אבל לאהיי שייך לאותה קטגוריה, ולא נכלל באופן מפורש בדיון הזה. מעקב ידני של צפיפויות דורש מתאר את התכונות של עניין, לחתוך-by-פרוס, המאפשר השמירה של הצפיפות המקורית של אזורי משנה הסלולר בהתאמה. גישה זו מאפשרת שליטה מקסימלי בתהליך הפילוח, אבל היא תהליך מייגע ועתירת עבודה. אוטומטי גישות פילוח צפיפות (וקשור) המבוסס על סף הן חצי אוטומטיות, שבו אלגוריתם בוחר פיקסלים המבוססים על סט של פרמטרים המוגדר על ידי משתמש. כמה חבילות אקדמיות (חינם) להדמיה, כגון קליפורניה בסן פרנסיסקו כימרה, IMOD, פיג&#39;י 26, וVolumeRover זמינות, כמו גם מסחריות (הדורשות רישיונות בתשלום) חבילות, ושני הסוגים בדרך כלל כוללים אחד או יותר מהגישות פילוח אלה. חבילות התוכנה המשמשות בעבודה זו כדי להמחיש שיטות שונות אלה כוללות שני תוכניות מסחריות וים פתוח אקדמיתוכניות ource לידניות יצירת מודל מופשט, כמו גם פילוח צפיפות ידני ואוטומטי. עם זאת, תוכנת קוד פתוחה יכולה לפעמים להציע אפשרויות מתקדמות יותר באמצעות האפשרות של התאמה אישית. השוואה של טכניקות אלה באמצעות סוגים שונים של ערכות נתונים הובילה למצגת הבאה של כללים וההנחיות כיצד לפנות לפילוח של כרכי 3D נתונים ביולוגיים מגוונים, אשר למיטב ידיעתנו טרם פורסמו. לפיכך, זה הוא ההשוואה השיטתית הראשונה של הגישות השונות והתועלת שלהם על ערכות נתונים עם משתנה מאפיינים עבור משתמשים עם מטרות שונות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;">Material Name</td>
			<td style="width:151px;">Company</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;">Amira</td>
			<td style="width:151px;">FEI Visualization Sciences Group</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>http://www.vsg3d.com/amira/overview</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:99px;">Chimera</td>
			<td style="width:151px;">UCSF</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</a></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;"><a name="RANGE!A4">Fiji/ImageJ</a></td>
			<td style="width:151px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:99px;">IMOD</td>
			<td style="width:151px;">Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:99px;">Photoshop</td>
			<td style="width:151px;">Adobe</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.adobe.com/products/%20photoshopfamily.html">http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:99px;">MATLAB</td>
			<td style="width:151px;">MathWorks</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.mathworks.com/">http://www.mathworks.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">VLFeat</td>
			<td>VLFeat</td>
			<td></td>
			<td>http://www.vlfeat.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from voxels to knowledge: a practical guide to the segmentation of complex electron microscopy 3d-data

גישות במיקרוסקופ אלקטרונים 3D מודרניות לאחרונה אפשרו תובנה חסרת תקדים לתוך ארגון ultrastructural 3D של תאים ורקמות, המאפשרות ההדמיה של מכונות macromolecular גדולות, כגון מתחמי הידבקות, כמו גם מבנים מסדר גבוה, כגון שלד התא ואברונים תאיים בהם תא המתאים והקשר רקמה. לאור המורכבות האינהרנטית של כרכים סלולריים, זה חיוני כדי לחלץ תחילה את התכונות של עניין, על מנת לאפשר להדמיה, כימות, ולכן הבנה של הארגון שלהם 3D. כל קבוצת נתונים מוגדרת על ידי מאפיינים ברורים, לדוגמא, יחס, אות לרעש פריכות (חדות) של נתונים, ההטרוגניות של התכונות שלו, צפיפות של תכונות, נוכחות או עדר של צורות אופייניות המאפשרות זיהוי קל, ואחוז של כל הנפח שאזור ספציפי של עניין תופס. כל המאפיינים האלה צריכים להילקח בחשבוןכאשר מחליט על שמתקרב לקחת לפילוח. שש ערכות נתונים ultrastructural השונות 3D שהוצגו התקבלו על ידי שלוש הדמיה שונה גישות: טומוגרפיה של אלקטרון צבעוני משובצת שרף, התמקדה יון beam- ומיקרוסקופיה בלוק סדרתי סריקת פרצוף אלקטרון (FIB-SEM, SBF-SEM) של דגימות המעטה מוכתמות ומוכתמות בכבדות , בהתאמה. עבור ערכות נתונים אלה, ארבע גישות פילוח שונות יושמו: (1) בניית מודל מלא הוראות ואחרי אך ורק על ידי הדמיה של המודל, (2) פילוח מעקב הידני של נתונים ואחריו משטח טיוח, (3) גישות אוטומטיות למחצה ואחרי על ידי עיבוד פני השטח, או אלגוריתמי פילוח (4) אוטומטיים אישית מעוצבת ואחרי עיבוד פני השטח וניתוח כמותי. בהתאם לשילוב של מאפייני ערכת הנתונים, נמצא כי בדרך כלל אחד מארבע גישות קטגורי אלה בביצועיו לאחרים, אבל תלוי ברצף של קריטריונים המדויקים, מוגישה מחדש מאשר אחד עשויה להיות מוצלחת. על סמך נתונים אלה, אנו מציעים תכנית קביעת סדרי עדיפויות שמסווגת את שני מאפייני מערך נתונים אובייקטיביים וקריטריונים אישיים הסובייקטיבית לניתוח ערכות נתונים השונים.

Watch this Scientific Journal Video about From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data at JoVE.com

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

צוואר הבקבוק במיקרוסקופ האלקטרונים 3D סלולארי הוא הבלטת תכונות (פילוח) במפות צפיפות 3D המורכבות ביותר. פיתחנו סדרה של קריטריונים, אשר מספקת הנחיות באשר אשר גישת פילוח (ידנית, חצי אוטומטי, או אוטומטי) היא מתאים ביותר עבור סוגי נתונים שונים, ובכך לספק נקודה מוצא לפילוח יעיל.

מvoxels לידע: מדריך מעשי לפילוח אלקטרונים מורכבים מיקרוסקופית 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

from-voxels-to-knowledge-practical-guide-to-segmentation-complex

Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.3K Views.  Lawrence Berkeley National Laboratory.  צוואר הבקבוק במיקרוסקופ האלקטרונים 3D סלולארי הוא הבלטת תכונות (פילוח) במפות צפיפות 3D המורכבות ביותר. פיתחנו סדרה של קריטריונים, אשר מספקת הנחיות באשר אשר גישת פילוח (ידנית, חצי אוטומטי, או אוטומטי) היא מתאים ביותר עבור סוגי נתונים שונים, ובכ...

Video: From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

בעלות נמוכה cryo-Light Stage מיקרוסקופית ייצור עבור אור בקורלציה / מיקרוסקופית אלקטרונים

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em&gt; In vivo</em&gt; דימות אופטי

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular level in the chemical and biomedical sciences. Although commercial SIM systems are available, systems that are custom designed in the laboratory can outperform commercial systems, the latter typically designed for ease of use and general purpose applications, both in terms of imaging fidelity and speed. This article presents an in-depth guide to building a SIM system that uses total internal reflection (TIR) illumination and is capable of imaging at up to 10 Hz in three colors at a resolution reaching 100 nm. Due to the combination of SIM and TIRF, the system provides better image contrast than rival technologies. To achieve these specifications, several optical elements are used to enable automated control over the polarization state and spatial structure of the illumination light for all available excitation wavelengths. Full details on hardware implementation and control are given to achieve synchronization between excitation light pattern generation, wavelength, polarization state, and camera control with an emphasis on achieving maximum acquisition frame rate. A step-by-step protocol for system alignment and calibration is presented and the achievable resolution improvement is validated on ideal test samples. The capability for video-rate super-resolution imaging is demonstrated with living cells.

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

A Guide to מיקרוסקופית TIRF תאורה מובנית ב- High Speed ​​עם צבעים מרובים

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

מיקרוסקופי אלקטרונים בהירי-עור גומל באמצעות חלקיקי נקודה קוונטית

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Correlative אלקטרון מיקרוסקופ אור (קלם) עבור מעקב אחר והדמיה חלבון נגיפי הקשורים מבנים בתאים הקפאה. מרותק למיטה

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

ניתוח ביטוי גנטי של תאי אנדותל נחשף להטיית מתח באמצעות מרובות במקביל-plate זרימה צ'יימברס

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

מדריך לבניית מאוד נוטה נסחף מיקרוסקופ אריח עבור הדמיה מולקולה בודדת שדה-of-view מורחבת

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

יישום של מיקרוסקופ כוח אטומי כדי לזהות אוסטיאוארתריטיס מוקדם

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...