We gratefully acknowledge Dr. Deborah L. Gumucio as our advisor and for her invaluable support in defining the culture and imaging methods. We also thank Dr. Jim Brodie, Dr. Hong-Xiang Lu, Dr. Charlotte Mistretta, and Dr. Ann Grosse for their contributions to the development of the whole intestine organ culture system. Helpful discussions on imaging provided excellent advice from Dr. Chip Montrose, Michael Czerwinski and Sasha Meshinchi. All imaging was performed in the Microscopy and Image Analysis Laboratory at the University of Michigan. Funding support was provided by NIH R01 DK065850.

הערה: כל העכברים טופלו באנושיות תוך שימוש בפרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת מישיגן בית הספר לרפואת היחידה לבעלי חיים במעבדה לרפואה ובהתאם להנחיות ועדת האוניברסיטה על שימוש וטיפול של בעלי חיים. מערכת האיברים תרבות .1 שלמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של תקשורת ותרבות צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשכונת תרביות רקמה, להסיר 5 מ&quot;ל של תקשורת BGJb ממניות הבקבוק ולהוסיף 5 מ&quot;ל של העט / סטרפטוקוקוס. הכן מלאי עבודה של תקשורת בצינור חרוטי 50 מ&quot;ל, על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​חומצה אסקורבית ל49 מ&quot;ל של תקשורת BGJb (עם פן / סטרפטוקוקוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת תרבות 6 היטב על ידי הוספת 1 מ&quot;ל מתחת לכל של transwells. הערה: אם לא השתמש בכל 6 transwells, להעביר transwells נוסף לצלחת 6 היטב סטרילי טרי לשימוש מאוחר יותר. הוסף 3 מ&quot;ל של עבודה תקשורת BGJb לכל אחת משלוש צלחות פטרי 10 סנטימטר סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים כלים לנתח בetha 70%נול ולהיות בטוחים כדי לשמור על הכלים נקיים תוך כדי העבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את האזור לנתח עם דלי קרח גדול ולמקם את צלחת תרבות 6 היטב ו10 פטרי מנות סנטימטר עם תקשורת BGJb על קרח. לעבוד על קרח ככל האפשר, תוך ביתור והכנת המעיים לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי נקבת עכברים בוגרים בתא עם isofluorane (100 μl) לפני euthanization נקע בצוואר הרחם לאסיף מעיים של העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קצירת העוברים מאמם, לביים כל עובר על פי זהירות לTheiler בימוי תרשים 13. אין לסמוך על ימים שלאחר משגל-כדי לקבוע את הגיל של כל עובר כוריאציות של עד 24 שעות בשלב התפתחותי הם נצפו באופן שיגרתי בהמלטה אחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissection של מעיים של העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עוברים על ידי עריפת ראש לפני הסרת מעיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח כל מעי בשל 1x Dulbecco פוספט שנאגר מלוח (DPBS) ולאחר מכן PLACe אותו לתוך צלחת פטרי 10 סנטימטר עם העבודה תקשורת BGJb. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הטחול מהבטן והלבלב מהבטן והעליון תריסריון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפריד את omentum דואג להשאיר את omentum המצורף ככל האפשר ומפריד את הקשרים רק מספיק כדי לאפשר למעי להיות יישר. הערה: למעיים מבוגרים מן E14.5 או אלה שתרבית יותר מ24 שעות, בעדינות להפריד את המעי ל3 חלקים שווים, כדי לאפשר לתוכן luminal לזרום דרך המעי ולהיות מגורש מקצות החתך. עם זאת, לתרבויות התחילו לפני E13.5, לחכות עד אחרי 24 שעות של culturing לפני פרידת 3 המגזרים של המעי כדי לאפשר serosa לגדול כראוי על פני האורך של המעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipet פה כדי להעביר את חתיכות מעיים על transwells של צלחת התרבות (1.1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות למקם מחדש את המעיים לפי צורך, כך שהם ישר transwell. הערה: ברגע שהמעיים מתחילים לנוע תוכן luminal דרך הצינור, סטיות כל במעי יגרמו גיבוי ונזק למעי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות וטיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מתחת transwell, להוסיף 700 μl של תקשורת טיפול (עבודה תקשורת עם חלבונים הוסיפו רקומביננטי או מעכבים תרופתיים) תחת transwell. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 μl של תקשורת טיפול ירידה מבחינת על גבי המעיים ולאפשר לו לספוג דרך transwell. למקם מחדש את המעיים על פי צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי בתקשורת טיפול לפחות פעם ביום או לעתים קרובות יותר בהתאם לזמן מחצית החיים של מגיב הטיפול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חרוזים agarose חלבון ספוגה למקור מקומי של מגיב טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend חרוזים agarose במכל האחסון שלהם ולהעביר את חרוזים agarose 100 μl לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הנפח הנותר של הצינור עם סטרילי 1x Phosphate שנאגר מלוח (PBS) ומערבבים את החרוזים כדי לשטוף אותם. מניחים את צינור microfuge במעמד לכמה דקות כדי לאפשר חרוזים להתיישב לתחתית ואז pipet את PBS מעל גבי חרוזים. למלא את צינור microfuge עם סטרילי 1x PBS ולחזור על תהליך השטיפה פעמיים נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החלבון של עניין בשתי פעמים הריכוז רצוי לטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 5 μl של חרוזים agarose נשטפו עם 5 μl של מניית חלבון 2x ועדינות להתסיס את חרוזים בחלבון. מניחים את הצינור על קרח במשך שעה 1, ערבוב בעדינות כל דקות 10-15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את חרוזים קצר בסטרילי 1x PBS לפני הצבת חרוזים במעיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום של חרוזים agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות את חרוזים agarose על גבי המעיים באמצעות pipet פה עם מחטי נימים משכו. מניחים את חרוזים בזהירות רבה כטיפול אגרסיבי יפגע המעי ולמנוע התפתחות סיסי באזור הפגוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח חרוזי פעמיים רבים ככל נדרשים לניתוח מאז המעיים יעברו תנועות peristaltic וכמחצית מהחרוזים להציב יגלגל את המעיים על פני זמן culturing. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע של מעיים בתרבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את תקשורת הטיפול מלמטה transwell ולאפשר את המעיים לייבוש באוויר במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של מקבע תחת transwell למשך 2 דקות, לאחר מכן לכסות את החלק העליון של המעי עם 2 מ&quot;ל של מקבע למשך שארית זמן הקיבעון. לתקן עם 4% O paraformaldehyde / N ב 4 מעלות צלזיוס או לשעה 2 ב RT. </li></ol></li></ol> .2 הדמיה של מעיים קבועים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה Wholemount <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המעיים שלמים (עם הקרינה אנדוגני) בשקופית עם של 1x DPBS 100 μl. שימוש במלקחיים כדי לסדר בעדינות את המעיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במטלית מעבדה כדי להסיר בזהירות את DPBS ומייד להוסיף של גליצרול 70% 100 μl כדי להפוך את מו הרקמהמחדש שקוף ולהגדיל את העומק האפשרי של הדמיה. הערה: אם חדירה נוספת של המעי היא רצויה, במקום הרכבה המעי ב70 גליצרול%, להשרות את המעי בכמה טיפות של תמיסת המוקד ברורה ל10-30 דקות. Pipet את פתרון המוקד ברור והר המעי עם הר ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים כל אחת מארבע הפינות של coverslip לפלסטלינה ולהרים כמות קטנה של חומר שישמש כמפרידים בין השקופיות וcoverslip כדי לשמור על coverslip ממשטח את המעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את coverslip לשקופית עם VALAP מומס מיושם עם מקלון צמר גפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת המעיים משני מיקרוסקופ confocal זקוף או הפוך. נא עיין בדיון לפרטים נוספים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתך Vibratome של מעיים קבועים (עבור תצוגת חתך רוחב של מבני מעיים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיים להטביע בagarose 7% בתבניות פלסטיק קטנים (10 x 10 x 15 מ&quot;מ) ולאפשר ללוקי agarose ללצנן ולחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בלוקים agarose מתבניות הפלסטיק ואובניים agarose הדבק לשלב איסוף vibratome עם דבק מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את שלב האיסוף עם קרח הקר 1x DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חלקים בעובי בין 100-150 מיקרומטר. עבור חלקים עבים יותר להשתמש בפתרוני סליקה (שתוארו בסעיף 2.1.2) כדי לחזות עמוק יותר לתוך החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים vibratome חלקים מהשלב האיסוף לתוך באר של צלחת 6 היטב לאחסון ב 4 ° C.. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים immunofluorescence של רקמות קבועות, מחולק vibratome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 5-12 חלקים vibratome לכל גם לתוך צלחת 24 גם עם 1x DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 1x DPBS ולהוסיף 500 μl של פתרון permeabilization בכל טוב. נער בעדינות את הדגימות ל25 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר permeabilization, לשטוף את הדגימות 3 פעמים עם 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הדגימות לפחות 30 דקות ב500 μl של חסימת פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חסימה, דוארXchange פתרון החסימה עם 500 μl של הנוגדנים עיקריים בדילול מלא בחסימת פתרון ולשמור את הדגימות על 4 מעלות CO / N. הערה: דילולים הנוגדן הראשוניים שפועלים היטב על חלקים קפואים ופרפין בדרך כלל עובדים גם על vibratome סעיפים מדי, לעומת זאת נוגדנים הדורשים אחזור אנטיגן גרעיני בדרך כלל לא עובד טוב עם פרוטוקול זה (למשל, BrdU). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשטוף את הדגימות 3 פעמים במשך 15 דקות בכל פעם עם פתרון חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, להחיל 500 μl של הנוגדנים משני בדילול מלא בחסימת פתרון. לעטוף את צלחת 24 גם בנייר אלומיניום כדי להגן fluorophores מן האור ולטלטל את הדגימות ל45 דקות לשעה 2 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הדגימות 3 פעמים עם 1x PBS ל15 דקות כל אחד והר חלקי vibratome בשקופיות כפי שתואר בסעיף 2.4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבה חלקי vibratome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופיות עבור vibratome הרכבה על ידי חיתוך פרוסות דקות של כפול STIקלטת ck ומציב אותם בצדי המגלשות הארוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להניח 5-10 חלקי vibratome בין הקלטת דו המקל בשקופיות בירידה של של 1x PBS 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח את כל החלקים ולהפיץ אותם לשכבה אחת על פני השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל agarose עודף או חתיכות לא אחידות שימנע coverslip מיושב שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בזהירות רקמת מעבדה כדי לספוג את עודף 1x PBS מכל רחבי חלקי vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה של מדיום גובר מימיים על גבי חלקי vibratome ולאחר מכן coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את coverslips על השקופיות עם נמס VALAP מיושם עם מקלון צמר גפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת חלקי vibratome משני מיקרוסקופ confocal זקוף או הפוך. נא עיין בדיון לפרטים נוספים על בחירה של מערכת הדמיה. </li></ol></li></ol> .3 הדמיה חיה של מעיים שלמים מעיים שנקטפו מן fetuseים לאחר E12.5, עם omentum המחובר נותר בשלמותו, לפתח בהצלחה villi בתרבות שימוש במערכת לעיל. לכן, מערכת זו vivo לשעבר מאפשרת הלכידה של תמונות z-סעיף חיים של המעיים פיתוח שניתן לשחזר לתצוגה תלת ממדית של המורפוגנזה לאורך זמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הדמיה חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדבק מיידי לדבוק קרום פוליקרבונט פרט למסך רשת בסדר. זה מספק פיגום תמיכה כדי להחזיק את המעי במקום מתחת לעדשת הטבילה של המיקרוסקופ confocal הזקוף. נא עיין בסעיף הדיון לפרטים נוספים על בחירה של מיקרוסקופי הדמיה לחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מסך הרשת במרכז גם צלחת תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המעי גזור על הממברנה פוליקרבונט ולהוסיף טיפה של דבק מיידי בכל צד. השתמש אך ורק מספיק דבק להדביק המעי, אבל זה לא מעיל! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף חופשי תקשורת ותרבות של פנול אדום מתחת לפוליקרבונטקרום במרכז גם מצלחת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף מים עד לשפה החיצונית של צלחת התרבות כדי לספק לחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז המעי העוברי עובר גלים כמו נפיחה של התכווצות בתרבות, להוסיף של 1 100 μl: פתרון 5 של xylazine ב1x PBS עד 3 מ&quot;ל של תקשורת כדי לשלוט בתנועה של המעי תוך הדמיה. מינון זה לשלוט בתנועות מעיים במשך כ8-10 שעה מבלי להתפשר על פיתוח סיסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתצוגה רוחבית של המעי, להטביע את המעיים חיים בפתרון agarose 3-4% ולחתוך חלקים עבים (150-500 מיקרומטר) על vibratome. התאם את הנוקשות של agarose עם הקשיחות של המעי נחתך ואמפיריים נקבע השלב ההתפתחותי. באופן כללי, פתרון agarose 3% עובד היטב עבור מעיים צעירים מן E14.5 ופתרון 4% עובד היטב עבור המעיים E15-E16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדביק את חלקי vibratome לקרום פוליקרבונט מודבקים מסך רשת (כמו בסעיף 3.1.1) והתרבות כפי שתוארה בסעיף 3.1.2-3.1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל את ההדמיה בשידור החי באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים confocal הקרינה (לייזר עירור בין 690-1,040 ננומטר) על עמדה זקופה עם שולחן מתכונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייזר שני פוטונים מכוון ל900 ננומטר מספק חדירה עמוקה עם הרזולוציה הטובה ביותר עבור אותות GFP. זה מפחית את נזק לרקמות בזמן ההדמיה. בנוסף, הגדרת כוחו של הלייזר לפליטה הנמוכה ביותר האפשרית מפחיתה נזק לרקמות. בדרך כלל כדי להשיג עירור טוב של GFP, להשתמש 12% כוח בליזר שני פוטונים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Grosse, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+dynamics+in+fetal+intestinal+epithelium:+implications+for+intestinal+growth+and+morphogenesis.">Cell dynamics in fetal intestinal epithelium: implications for intestinal growth and morphogenesis.</a> Development. 138, 4423-4432 (2011).</li><li>Walton, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog-responsive+mesenchymal+clusters+direct+patterning+and+emergence+of+intestinal+villi.">Hedgehog-responsive mesenchymal clusters direct patterning and emergence of intestinal villi.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15817-15822 (2012).</li><li>Wells, J. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+endoderm+development.">Vertebrate endoderm development.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 393-410 (1999).</li><li>Hashimoto, H., Ishikawa, H., Kusakabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+vascular+networks+during+the+morphogenesis+of+intestinal+villi+in+the+fetal+mouse.">Development of vascular networks during the morphogenesis of intestinal villi in the fetal mouse.</a> Kaibogaku zasshi Journal of anatomy. 74, 567-576 (1999).</li><li>Mathan, M., Moxey, P. C., Trier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+fetal+rat+duodenal+villi.">Morphogenesis of fetal rat duodenal villi.</a> Am J Anat. 146, 73-92 (1976).</li><li>Burns, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+fibroblast+growth+factor+10+or+fibroblast+growth+factor+receptor+2-IIIb+signaling+for+cecal+development+in+mouse.">Requirement for fibroblast growth factor 10 or fibroblast growth factor receptor 2-IIIb signaling for cecal development in mouse.</a> Dev Biol. 265, 61-74 (2004).</li><li>Pabst, O., Schneider, A., Brand, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+Nkx2-3+homeodomain+gene+is+expressed+in+gut+mesenchyme+during+pre-+and+postnatal+mouse+development.">The mouse Nkx2-3 homeodomain gene is expressed in gut mesenchyme during pre- and postnatal mouse development.</a> Dev Dyn. 209, 29-35 (1997).</li><li>Pabst, O., Zweigerdt, R., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+homeobox+transcription+factor+Nkx2-3+in+mice+results+in+postnatal+lethality+and+abnormal+development+of+small+intestine.">Targeted disruption of the homeobox transcription factor Nkx2-3 in mice results in postnatal lethality and abnormal development of small intestine.</a> Development. 126, 2215-2225 (1999).</li><li>Kaestner, K. H., Silberg, D. G., Traber, P. G., Sch&#252;tz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mesenchymal+winged+helix+transcription+factor+Fkh6+is+required+for+the+control+of+gastrointestinal+proliferation+and+differentiation.">The mesenchymal winged helix transcription factor Fkh6 is required for the control of gastrointestinal proliferation and differentiation.</a> Genes &amp; Development. 11, 1583-1595 (1997).</li><li>Madison, B. B., McKenna, L. B., Dolson, D., Epstein, D. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxF1+and+FoxL1+link+hedgehog+signaling+and+the+control+of+epithelial+proliferation+in+the+developing+stomach+and+intestine.">FoxF1 and FoxL1 link hedgehog signaling and the control of epithelial proliferation in the developing stomach and intestine.</a> J Biol Chem. 284, 5936-5944 (2009).</li><li>Karlsson, L., Lindahl, P., Heath, J. K., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+gastrointestinal+development+in+PDGF-A+and+PDGFR-(alpha)+deficient+mice+implicates+a+novel+mesenchymal+structure+with+putative+instructive+properties+in+villus+morphogenesis.">Abnormal gastrointestinal development in PDGF-A and PDGFR-(alpha) deficient mice implicates a novel mesenchymal structure with putative instructive properties in villus morphogenesis.</a> Development. 127, 3457-3466 (2000).</li><li>Mao, J., Kim, B., Rajurkar, M., Shivdasani, R., Mcmahon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+controls+mesenchymal+growth+in+the+developing+mammalian+digestive+tract.">Hedgehog signaling controls mesenchymal growth in the developing mammalian digestive tract.</a> Development. 137, 1721-1729 (2010).</li><li>Theiler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The house mouse. Development and normal stages from fertilization to 4 weeks of age. , (1989).</li><li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms.">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Mol Cell Biol. 23, 4013-4025 (2003).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+neural+cell+fates+and+medulloblastoma+in+mouse+patched+mutants.">Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants.</a> Science. 277, 1109-1113 (1997).</li><li>Fu, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtome-free+3-dimensional+confocal+imaging+method+for+visualization+of+mouse+intestine+with+subcellular-level+resolution.">Microtome-free 3-dimensional confocal imaging method for visualization of mouse intestine with subcellular-level resolution.</a> Gastroenterology. 137, 453-465 (2009).</li></ol>

The authors have no financial conflicts to disclose.

האופי הדינמי ואינטראקציות רקמה מורכבות של המעי המתפתח דורשים 3D להדמיה יש הערכה מלאה של אירועי המוךפו&quot;גנטי אלה. עם התפתחות טכנולוגיית הדמיה, היכולת לבחון המורפוגנזה סיסי בפירוט מפתחת / שיפור ועם זה, ההבנה של התקשורת ואינטראקציה מרחבית במהלך organogenesis היא מאוד משופרת....

Each intestinal villus is composed of two main tissue compartments: an epithelial surface layer and a mesenchymal core. The mouse small intestine is formed at embryonic day 10 when a sheet of endoderm closes and seals to form a tube of epithelium surrounded by mesenchymal cells3. This flat tube of epithelium undergoes rapid proliferation, growing both in length and girth and undergoes dramatic rearrangements involving dynamic cell shape changes1. At the same time, the surrounding mesenchyme also undergoes many developmental processes including the formation of the vascular plexus, differentiation of smooth muscle and recruitment of enteric neurons4. In the proximal small intestine at embryonic day 14.5, condensations (clusters) of Hedgehog- and PDGF-responsive cells begin to form adjacent to the epithelium2,5. Formation of mesenchymal clusters continues to spread along the length of the intestine so that they cover the entirety of the small intestine by embryonic day 16.52. As mesenchymal clusters form, the epithelial cells closest to the clusters begin to withdraw from the cell cycle, while the other epithelial cells continue to proliferate. Those cells directly above the mesenchymal cluster that have withdrawn from the cell cycle begin to change shape as the emerging villus buckles into the lumen. Further growth of the villus is driven in part by the continued proliferation of the epithelium between the emerging villi. The mesenchymal clusters remain tightly adhered to the epithelium of the growing villus and continue to express a variety of signaling molecules. The wave of villus emergence propagates along the length of the small intestine following the formation of mesenchymal clusters. As the intestine continues to grow and the intervillus region extends between emerging villi, new mesenchymal clusters form adjacent to the intervillus epithelium and further rounds of villus emergence and growth ensue6.
Synchronized development of the epithelium and mesenchyme is essential for villus morphogenesis. Signaling molecules are secreted from one layer to the other where receptors receive and transduce the signal message in order to coordinate development between the epithelium and mesenchyme. Mesenchymal clusters act as signaling centers and express a variety of developmental morphogens7-10. Disruption of cluster formation or pattern results in loss of villus emergence and pattern. Inhibition of PDGF signaling results in fewer clusters and fewer villi and those villi that do form are misshapen following the abnormal clusters11. Loss of Hedgehog signaling results in complete loss of cluster formation and failure of villus emergence2,12. Together, these data demonstrate that clusters coordinate development of the villus epithelium with its mesenchymal core.
Using this whole organ culture system, we are able to alter signaling involved in epithelial-mesenchymal cluster cross-talk to determine the role of those signals in villus morphogenesis. Two-photon confocal optical sectioning and reconstruction afford the ability to visualize cluster formation and villus emergence in three-dimensions and better understand the spatial relationships between the mesenchymal clusters and their overlying epithelium. Extending the culture system to four dimensions, we can capture z-stacks of developing clusters and villi over time and observe these interactions. Ultimately, the ability to follow villus development in this manner and observe changes that occur with altered signaling will revolutionize the understanding of epithelial mesenchymal interactions in villus morphogenesis.

<table><tbody><tr><td>Fine dissecting forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>&amp;nbsp;11254-20</td><td>2 pairs</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x sterile Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>14040-133</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>6 well plates</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>24 well plates</td><td>Costar&amp;nbsp;</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm petri dishes</td><td>Falcon</td><td>&amp;nbsp;451007</td><td></td></tr><tr><td>Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes</td><td>Corning Costar&amp;nbsp;</td><td>3428</td><td>6 inserts per plate</td></tr><tr><td>BGJb media</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>12591-038</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin)</td><td>Gibco</td><td>&amp;nbsp;15140</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic Acid</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A0278</td><td>make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly)</td><td>Fisher</td><td>&amp;nbsp;21-180-10</td><td>remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 &amp;micro;l pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet.</td></tr><tr><td>6 inch glass pasteur pipets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillary Tubes</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>pull to needles</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td></td><td></td><td>made in 1 x PBS, pH to 7.3</td></tr><tr><td>Culture plates</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>Fine mesh stainless steel screen</td><td>purchase at hardware store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate membranes</td><td>Thomas scientific&amp;nbsp;</td><td>4663H25</td><td>alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports</td></tr><tr><td>Instant glue</td><td>purchase at hardware store</td><td>gel based preferrably</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm plates</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>7% agarose</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;A9414</td><td>prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath</td></tr><tr><td>minutien pins</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red free media (DMEM)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (100 mg/ml)</td><td>AnaSed&amp;nbsp;</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>356231</td><td>basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free</td></tr><tr><td>3-4% agarose</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A9414</td><td>prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath</td></tr><tr><td>Imaging of fixed intestines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name of Material/Equipment</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>vaseline</td><td>purchase at pharmacy</td><td></td><td>used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin</td></tr><tr><td>lanolin</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>L7387</td><td>used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin</td></tr><tr><td>paraffin</td><td>Surgipath</td><td>39601006</td><td>used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin</td></tr><tr><td>70% glycerol in 1 x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Focus clear and Mount Clear</td><td>CelExplorer Labs Co.</td><td>&amp;nbsp;F101-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td>purchase at art supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>double stick tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cotton applicator swabs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm)</td><td>Tissue Tek&amp;nbsp;</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>slides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>coverslips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lab wipe</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td>lint free delicate task wipe</td></tr><tr><td>Theiler staging chart&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/%20downloads/theiler2.pdf&quot;&gt;http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Leica SP5X confocal microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>Used to conduct the live imaging&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica DMI 6000 stand&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>Used to conduct the live imaging&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Aqueous mounting medium (Prolong Gold)</td><td>Molecular Probes&amp;nbsp;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Name of Material/Equipment</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Costar</td><td>&amp;nbsp;3524</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T-8787</td><td>used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td></td><td></td><td>used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Tween20&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development

רוב התהליכים המוךפו&quot;גנטי במעי של העובר כבר משתמעים מסעיפים דקים של רקמות קבועות, מתן תמונות של שינויים לאורך שלבי התפתחות. מידע תלת ממדים מסעיפים סידוריים דקים יכול להיות מאתגר לפרש בגלל הקושי של שחזור קטעי סדרתי בצורה מושלמת ושמירה על הכיוון נכון של הרקמות על סעיפי סדרתי. הממצאים אחרונים על ידי Grosse et al., 2011 מדגישים את החשיבות של שלושה מידע ממדי בהבנת המורפוגנזה של villi הפיתוח של המעי 1. שחזור תלת ממדי של תאים במעי שכותרתו בנפרד, הוכיח כי רוב תאי אפיתל במעי פנו שני משטחי הפסגה ובסיסיים. יתר על כן, השחזור תלת ממדי של שלד התא אקטין במשטח הפסגה של האפיתל הראה שחלל המעי הוא רציף ושלומן המשני הוא חפץ של יםectioning. אלה שתי נקודות, יחד עם ההפגנה של הגירה גרעינית interkinetic באפיתל במעי, שהוגדרו אפיתל במעי מתפתח כהאפיתל pseudostratified ולא רובדו כפי שחשבו בעבר 1. היכולת להתבונן האפיתל בתלת הממד הייתה זרע להוכחת נקודה זו ומגדירה מחדש המורפוגנזה אפיתל במעי של העובר. עם התפתחות טכנולוגית הדמיה רב פוטון ותוכנת שחזור תלת ממדים, היכולת לדמיין ללא פגע, פיתוח איברים משתפר במהירות. שני פוטונים עירור מאפשר חדיר פחות מזיק עמוק יותר לתוך רקמות עם רזולוציה גבוהה. שני פוטונים הדמיה ושחזור 3D של המעיים עכבר העובריים השלם בולטון et al., 2012 עזרו להגדיר את הדפוס של סיסי תולדה 2. כאן אנו מתארים מערכת תרבות איבר שלמה המאפשרת פיתוח vivo לשעבר של villi והרחבות של מערכת שהתרבות כדי לאפשרהמעיים להיות בתלת ממד הדמיה במהלך הפיתוח שלהם.

תרבות של explants של מעיים של העובר כולו מאפשרת לניתוחים של המיקום, הפצה, ומשך הזמן של מולקולות האיתות שלתאם פיתוח מעיים, כמערכת זו מאפשרת המניפולציה של האיתות עם ריאגנטים תרופתיים או חלבונים רקומביננטי. מערכת תרבות transwell (איור 1 א, לשכפל ומולטון et al., 2012) 2</...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development at JoVE.com

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל<em&gt; Ex Vivo</em&gt; מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

mouse-fetal-whole-intestine-culture-system-for-ex-vivo-manipulation

Research

JoVE Journal

Biology

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

14.8K Views.  University of Michigan. Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine. 

Video: Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

שימוש<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות הזקופה טיפה של איברים העובר שלמים לחקר תהליכים התפתחותיים בעכבר organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Developmental Biology

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

פרוטוקולים לניתוח תפקידם של תאי פנט התחדשות Murine המעי באמצעות מותנה<em&gt; Cre-לקס</em&gt; מודלי עכבר

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

הנדסת רקמות של המעי בדגם Murine

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Bioengineering

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Cancer Research

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

באמצעות אורגנואידים של המעי העוברי

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גירוי קולטן הכרת תרבות תבנית של עכבר המעיים Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Immunology and Infection

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is compartmentalized into crypts and villi: the stem and proliferating cells are confined to the crypts, whereas the villi epithelium contains only differentiated cells. Hence, the normal intestinal crypts, but not the villi, can give rise to organoids in 3D cultures. The procedure described here is applicable only to villus epithelium undergoing dedifferentiation leading to stemness. The method described uses the Smad4-loss-of-function:&#946;-catenin gain-of-function (Smad4KO:&#946;-cateninGOF) conditional mutant mouse. The mutation causes the intestinal villi to dedifferentiate and generate stem cells in the villi. Intestinal villi undergoing dedifferentiation are scraped off the intestine using glass slides, placed in a 70 &#181;m strainer and washed several times to filter out any loose cells or crypts prior to plating in BME-R1 matrix to determine their organoid-forming potential. Two main criteria were used to ensure that the resulting organoids were developed from the dedifferentiating villus compartment and not from the crypts: 1) microscopically evaluating&#160;the isolated villi to ensure absence of any tethered crypts, both before and after plating in the 3D matrix, and 2) monitoring the time course of organoid development from the villi. Organoid initiation from the villi occurs only two to five days after plating and appears irregularly shaped, whereas the crypt-derived organoids from the same intestinal epithelium are apparent within sixteen hours of plating and appear spherical. The limitation of the method, however, is that the number of organoids formed, and the time required for organoid initiation from the villi vary depending on the degree of dedifferentiation. Hence, depending upon the specificity of the mutation or the insult causing the dedifferentiation, the optimal stage at which villi can be harvested to assay their organoid forming potential, must be determined empirically.

The procedure describes isolation of the villi from the mouse intestinal epithelium undergoing dedifferentiation to determine their organoid forming potential.

פולחן תלת מימדי של אורגנוידים מאפיתל וילי במעיים העוברים דיפרנציה

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

בידוד ויצירת אורגנואידים במעיים של חולדות

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. Accordingly, patient-derived organoids are used for disease modeling, drug discovery, and personalized treatment screening. Mouse intestinal organoids are commonly utilized to understand aspects of both intestinal function/physiology and stem cell dynamics/fate decisions. However, in many disease contexts, rats are often preferred over mice as a model due to their greater physiological similarity to humans in terms of disease pathophysiology. The rat model has been limited by a lack of genetic tools available in vivo, and rat intestinal organoids have proven fragile and difficult to culture long-term. Here, we build upon previously published protocols to robustly generate rat intestinal organoids from the duodenum and jejunum. We provide an overview of several downstream applications utilizing rat intestinal organoids, including functional swelling assays, whole mount staining, the generation of 2D enteroid monolayers, and lentiviral transduction. The rat organoid model provides a practical solution to the need of the field for an in vitro model which retains physiological relevance to humans, can be quickly genetically manipulated, and is easily obtained without the barriers involved in procuring human intestinal organoids.

מחבר זרקור: יצירה ומניפולציה של אורגנואידים במעיים של חולדות  

Here, we present a protocol to generate rat intestinal organoids and use them in several downstream applications. Rats are often a preferred preclinical model, and the robust intestinal organoid system fills the need for an in vitro system to accompany in vivo studies.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שימוש

פרוטוקולים לניתוח תפקידם של תאי פנט התחדשות Murine המעי באמצעות מותנה

הנדסת רקמות של המעי בדגם Murine

תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo

עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic

באמצעות אורגנואידים של המעי העוברי

ה

מערכת ל

פולחן תלת מימדי של אורגנוידים מאפיתל וילי במעיים העוברים דיפרנציה

יצירה ומניפולציה של אורגנואידים במעיים של חולדות