GLP-1-מבחנים חיסוניים בוצעו על ידי מעבדת assay ביוכימיים Core בבית חולי Addenbrooke. עבודה זו, לאורך השנים, היה נתמך על ידי קרן Wellcome (כיום מענקים פעילים 106,262 / Z / 14 / Z ו- 106,263 / Z / 14 / Z) ואת המועצה למחקר רפואי (MRC) (מענקים MRC_MC_UU_12012 / 3 ו MRC_MC_UU_12012 / 5).

הנהלים כל חיה אושרו על ידי אוניברסיטת קיימברידג &#39;צער בעלי חיים וגוף סקירה אתיות תאמו את חיות (הליכים מדעיים) Act 1986 תקנות תיקון (SI 2012/3039). אופן ההכנה 1. ב Advance <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים aliquot של מטריקס קרום במרתף (BMM) (~ 200 μL) על הקרח להפשיר. הערה: BMM מבצרת בטמפרטורת החדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חמים 50 מ&quot;ל סטרילי גבוהה גלוקוז בינוני הנשר Modified של Dulbecco (DMEM) (ללא תוספות) ו ~ 40 בינוני מ&quot;ל סטרילי תרבות (DMEM גלוקוז גבוהה בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS), 100 U / mL פניצילין 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל סטרפטומיצין (P / S), ו 2 מ&quot;מ L- גלוטמין) ב 50 מבחנות צנטריפוגה מ&quot;ל באמבט מים 37 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סידן טרום צמרמורת ומגנזיום המכיל פוספט שנאגר מלוח (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשקול 15 מ&quot;ג collagenase (גולמי XI), להוסיף צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל ולשמור על קרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; זהירות: Collagenase מזיק. זה גורם לגירוי עור (H315) וגירוי בעיניים רציני (H319). זה עלול לגרום תסמיני אלרגיה או אסטמה או קשיי נשימה אם נשאף (H334). זה עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה (H335). יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים, למנוע היווצרות אבק ולהימנע נושמים אבק. להבטיח אוורור נאה. </li></ol></li></ol> אוסף רקמות 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ~ 20 מ&quot;ל L-15 בינוני עד צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל ומניחים אותו על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר נקע בצוואר הרחם, או שיטה 1 אחרים שאושרו הזמנים. הערה: רקמת מעי בדרך כלל מתקבלת מעכברים על רקע C57BL6. עם זאת, רקע גנטי אחר גם שמש למשל 129 / SvEv 15. ניסויי הדמיה דורשים שימוש עכברי כתב ניאון למשל Glu-ונוס 1. רקמות מתקבלות עכברים בוגרים (2-6 חודשים) של שני המינים. העכברים הם שוכנו individually-מאוורר כלובים עם כרצונך גישה למים צ&#39;או רגיל. עם זאת, ניסויים כדי לבחון את ההשפעה של תזונה עתירת שומן, למשל, על תפקוד התא enteroendocrine 16 יכול להתבצע אם נתמך על ידי רישיון הפרויקט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח בעדינות להסיר מעי עכבר (מ בשוער להתחיל של פי טבעת) באמצעות מלקחיים ומספריים דיסקציה. ולאחסן אותו בינוני L-15 על הקרח עד מוכן לשימוש. </li></ol> 3. רקמות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים רקמת המעי בצלחת פטרי 10 ס&quot;מ המכיל מספיק PBS כדי לכסות את הרקמה. קח 10 סנטימטרים של רקמה רצויה (מעי דק העליון למשל, 10 סנטימטרים עליונים, דיסטלי שוער). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרוקן את תכולת המעיים בעזרת פיפטה פלסטיק פסטר PBS מקורר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, בעדינות אחיזה בקצה אחד של קטע המעי ומקום קצה פיפטה פסטר לתוכו. לרוקן את תכולת עם PBS צונן. חזור משני קצותיו עד majoוביטחון של התוכן כבר סמוק החוצה. מעבירים לצלחת פטרי נקי המכיל PBS צונן ורענן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להסיר את רקמת השומן ואת לפדר, מקפיד לא לשלוף את שכבת השריר בעת ובעונה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקלפים את השריר שכבת off &quot;כמו גרב&quot; תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות שתי קבוצות של מלקחיים בסדר. הערה: שלב זה אינו חיוני, אבל מומלץ מאוד. ישנן דרכים חלופיות של הסרת שכבת השריר לזו המתוארת כאן. לדוגמה, במעי ניתן לחתוך פתוח אורכית הראשון, לפני הסרה של שכבת השריר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא נקודת התחלה בסוף הפרוקסימלי יותר של הרקמה שבה קיים דש גלוי של שריר. בעדינות להתרחק כמות קטנה של שכבת השריר לאורך כל הדרך סביב המעי. הערה: כדי למנוע קריעה של שכבת השריר או האפיתל במעי, לצמצם את כוח המתיחות ידי כיווץ שטח פנים גדול יותר מאשר באמצעות tIPS של מלקחיים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד במעי כמה שיותר דש שריר ככל האפשר, בעדינות לפרק ולהתחיל לקלף את שכבת השריר מרחבי המעי. כדי למנוע קריעה היא שכבת השריר אפיתל, לשמור readjusting עמדת המלקחיים כדי לשמור אותם קרובים זה לזה. בדרך זו, להסיר את שכבת השריר מן האורך של קטע המעי וזורק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את המעי פתוח אורכי או לשטוף ידי מתערבל בצלחת פטרי נקי עם PBS צונן ורענן. חזור במידת הצורך להסיר כל chyme או ריר הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת בשר טחון עם להב אזמל כירורגי כדי להשיג ריבועים של ~ 1-2 מ&quot;מ 2 ולהוסיף האלה ~ 20 מ&quot;ל מקורר PBS בצינור צנטריפוגה 50 מ&quot;ל בעזרת פיפטה פסטר. כדי להימנע חתיכות רקמה דבקות פיפטה, לנתק את הקצה להרטיב את פיפטה ידי triturating עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את הצינור כדי להמשיך לשטוף את חתיכות רקמה. לאפשר לרקמות להתיישב ושופכים או pipette את רוב PBS וחזרו עם PBS הטרי עד PBS נראה ברור. </li></ol> 4. הכנת פלייט / כלי BBM מצופה עיכול בינוני הערה: השלבים הבאים יש לבצע במנדף בתרבית רקמה (עם צעדי דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מים באמבטיה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון BMM 2% ב DMEM המקורר (ללא תוספות). תוך כדי עבודה, לשמור על פתרון קרח. אם אתם מחפשים פתרון 2%, להוסיף 140 μL מופשר BMM כדי 7 מ&quot;ל DMEM (מספיק כדי להכין צלחת 24-היטב יחיד). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 250 μL 2% פתרון BMM לכל טוב (24 גם צלחת) או לכל צלחת הדמיה זכוכית התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת צלחות / מנות מצופות למשך 30 דקות לפחות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר פילמור נאותה של BMM. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את מ&quot;ל 50 מחומם מראש DMEM (ללא תוספות) אל collagenase 15 מ&quot;ג (מהמדרגות 1.2 ו 1.4) כדי ליצור פתרון 0.3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ו להפוך להתמוסס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עַלCE נמס לגמרי, באמצעות מזרק 20 מ&quot;ל, לסנן את הפתרון collagenase דרך פילטר 0.2 מיקרומטר סטרילי לתוך צינור צנטריפוגות חדשות סטרילי 50 מ&quot;ל. תווית זו כאמצעי העיכול. </li></ol></li></ol> לעיכול רקמת 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את חתיכות רקמה מן PBS באמצעות 10 מ&quot;ל פיפטה סרולוגיות ולהוסיף צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל סטרילי המכיל DMEM סטרילי מצונן (ללא תוספות), מערבולת ולאחר מכן הסר DMEM. הערה: כדי למנוע רקמות דבקות פיפטה סרולוגיות, להרטיב אותו על ידי טחינה דקה עם DMEM לפני קשר עם הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;Digest&quot; 1 ו 2: סילוק פסולת תא תאים בודדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני עיכול מיליליטר 7 על פיסות הרקמה ולתת צינור מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 5 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות (לא מערבולת) הצינור עבור ~ 3 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לרקמות להתיישב וזורקי מדיום העיכול, הזמנהנפח קטן להסתכל במיקרוסקופ. הערה: במיוחד כאשר החלו לצאת, מומלץ מאוד לבדוק נפח קטן של כל &quot;לעכל&quot; (~ 30 μL) תחת מיקרוסקופ כדי לאמוד את התקדמות תהליך העיכול. אם מאורות רבים הם נצפו בשלב זה, את הרעד עשוי להיות יותר מדי נמרץ. לקבלת תמונות מייצגות של מה השלבים השונים &quot;Digest&quot; בדרך כלל נראים, לעיין ב איור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5.2.-5.2.4 חזור על השלבים (עם מדיום עיכול טרי). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;דייג&#39;סט&quot; 3 עד 5: אוסף של שברי הקריפטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 7 בינוני העיכול מ&quot;ל לרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, לנער כל 5 דקות במשך 10-12 s. הערה: הטלטול הוא יותר נמרץ מאשר רועד עבור &quot;מעכל&quot; 1 ו 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר רקמות מעוכלות להתיישב ולאסוף את מדיום עיכול צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. אםרקמת נאסף בטעות יחד עם המדיום, ולאפשר לו להתיישב, להסיר אותו בעזרת פיפטה 10 מ&quot;ל סרולוגיות ולהעביר אותו בחזרה אל צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל המכיל את רקמות מעוכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שנאספו בינוני / supernatant ב RT עבור 3 דקות ב 100 גרם x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant מחדש להשעות את התא גלולה מ&quot;ל 5 בינוני התרבות מחומם מראש על ידי טחינה דקה עדינה ומניחים בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק נפח קטן של השעית התא תחת מיקרוסקופ (ראה הערת משלב 5.2.4). הערה: באופן אידיאלי, שברי הקריפטה להתחיל להופיע &quot;לעכל&quot; 3 יחד עם פסולת תא תאים בודדים. &quot;דייג&#39;סט&quot; 4 ו 5 להכיל מספר גדול משמעותית של שברי הקריפטה עם פסולת התא מופחת (איור 1). התאם רועד בעוצמה לפי הצורך כלומר אם הרקמה לא מעכלים ושברי הקריפטה אינם מופיעים, לנער במרץ רב יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.3.1-5.3.6 עד 5 &quot;מעכל&quot; היוהושלם או עד שרוב הרקמות כבר מעוכל (א שיידרש 6 th בתקציר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל supernatants מ &quot;מעכל&quot; 3-5 (או 3-6) נאספו, צנטריפוגה לעכל supernatants ב RT עבור 3 דקות ב 100 גרם x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויי הפרשה, לשלב את supernatants מ &quot;מעכל&quot; 3-5 (או 3-6) לפני צנטריפוגה. הערה: רקמה פחות נחוצה עבור ניסויי הדמיה, ולכן לבחור את supernatant Digest כי הוא (פסולת בהעדר תא תאים בודדים) הנקי עם המספר הגדול יותר של שברי הקריפטה. זהו בדרך כלל &quot;לעכל&quot; 4 או 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant בעדינות מחדש להשעות את הגלולה ידי triturating עד גושים לא גלויים. Re- להשעות את גלולה במדיום תרבות מחומם מראש בתוספת 10 מיקרומטר Y-27,632 dihydrochloride (כדי למנוע anoikis 17). השתמש 5 מיליליטר עבור ניסויי הפרשה ו 2 בינוני תרבות מיליליטר עבור ניסויי הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְסַנֵןתא השעיה דרך מסנן 100 מיקרומטר (כדי להסיר את כל רקמה מעוכלת). הפעל מ&quot;ל 2 נוסף של המדיום התרבות מחומם מראש דרך המסנן כדי לשטוף (הנפח הכולל: 7 מ&quot;ל ו 4 מ&quot;ל עבור הפרשת ודימות, בהתאמה). הערה: סינון אינו חיוני, אולם, שברי רקמות גדולות יותר נוטים שלא לדבוק צלחת / מנות. </li></ol></li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig1.jpg" /> איור 1: נציג תמונות של &quot;מעכלת&quot; משיטת תרבות מעי דק עיקרית. (א) חומר אופייני מ &quot;מעכלים&quot; 1 ו 2 המכילים תאים ופסולת תא בודדים בעיקר. (ב) דוגמא של מוצרים מן &quot;לעכל&quot; 3. החיצים השחורים מצביעים שברי הקריפטה המופיעים החומר לעכל. (C) האופייני של &quot;לעכל&quot; 4 או 5. לוח (D) מייצגות ויקווה לעכל חומר&quot;מעכל&quot; 3-5 עבר דרך פילטר 100 מיקרומטר להסיר את שברי רקמות רצויים הגדולים לראות (C). כל התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי הפוך עם מטרת 20X. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 6. תרבויות מעי ציפוי (מועשר עבור תאי קריפטה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור פתרון BMM עודף מצלחת או מנות, ולהוסיף 250 μL בינוני התרבות מחוממת מראש ל הפרשה היטב. הערה: מנות ההדמיה הן נותרו ללא בינוני כך להמשיך לשלב הבא במהירות כדי למנוע את המנה מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 250 השעית תא μL לכל טוב (24 גם צלחת) או לכל צלחת זכוכית תחתונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפה חכם פלייט ב &quot;זיג זג&quot; בהילוך איטי על פני הבאר. אפשר שברי הקריפטה להסתפק ~ 5 דק &#39;לפני שעבר את הצלחת thחממת דואר. הערה: זה אמור לעודד חלוקה שווה של מאורות / תאים בתוך הבאר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת או מנות לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2. הערה: בשכבה &quot;טלאים&quot; צריכה יצרה. לקבלת תמונה מייצגת של התרבויות הבאות שלושה שוטף, ראו איור 2 א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנות ההדמיה &quot;מבול&quot; עם 2 מיליליטר מחומם מראש בינוני תרבות לכל צלחת. הערה: אלו מאכלים יהיו מתאימים הדמיה עד ~ 72 h הבאים ציפוי. תרבויות גסות בדרך כלל מעמד זמן רב יותר, עד 7 ימים. תאים אשר לא דבק ניתן להסיר על ידי צעד לשטוף. תרבויות ראשיות מוכנות כעת לשמש בניסויים. </li></ol>

<ol>
	<li>Reimann, F., Habib, A. M., Tolhurst, G., Parker, H. E., Rogers, G. J., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+A+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: A primary cell study.</a> Cell Metab. 8, 532-539 (2008).</li><li>Psichas, A., Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+chemosensing+mechanisms.">Gut chemosensing mechanisms.</a> J Clin Invest. 125 (3), 908-917 (2015).</li><li>Lovshin, J. A., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incretin-based+therapies+for+type+2+diabetes+mellitus.">Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus.</a> Nat Rev Endocrinol. 5 (5), 262-269 (2009).</li><li>Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gut+hormone+secretion.+Studies+using+isolated+perfused+intestines.">Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines.</a> Peptides. 77, 47-53 (2016).</li><li>Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+glucose-stimulated+GLP-1+secretion+from+perfused+rat+small+intestine.">Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine.</a> Diabetes. 64 (2), 370-382 (2015).</li><li>Brighton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+trigger+GLP-1+release+predominantly+by+accessing+basolaterally+located+G+protein-coupled+bile+acid+receptors.">Bile acids trigger GLP-1 release predominantly by accessing basolaterally located G protein-coupled bile acid receptors.</a> Endocrinology. 156 (11), 3961-3970 (2015).</li><li>Petersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+L+cells+in+mouse+and+human+small+intestine+organoids.">Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids.</a> Diabetes. 63 (2), 410-420 (2014).</li><li>Brubaker, P. L., Vranic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+rat+intestinal+cells+in+monolayer+culture:+a+new+in+vitro+system+to+study+the+glucagon-like+immunoreactive+peptides.">Fetal rat intestinal cells in monolayer culture: a new in vitro system to study the glucagon-like immunoreactive peptides.</a> Endocrinology. 120 (5), 1976-1985 (1987).</li><li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+production+and+secretion+in+GLUTag,+NCI-H716,+and+STC-1+cells:+a+comparison+to+native+L-cells.">Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716, and STC-1 cells: a comparison to native L-cells.</a> J Mol Endocrinol. 56 (3), 201-211 (2016).</li><li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ATOH1+and+Neurog3+requirements+define+tuft+cells+as+new+secretory+cell+type+in+the+intestinal+epithelium.">Distinct ATOH1 and Neurog3 requirements define tuft cells as new secretory cell type in the intestinal epithelium.</a> J Cell Biol. 192 (5), 767-780 (2011).</li><li>Pais, R., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+involved+in+the+detection+of+peptones+by+murine+small+intestinal+enteroendocrine+L-cells.">Signalling pathways involved in the detection of peptones by murine small intestinal enteroendocrine L-cells.</a> Peptides. 77, 9-15 (2016).</li><li>Rogers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activity-triggered+glucagon-like+peptide-1+secretion+from+primary+murine+L-cells.">Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells.</a> J Physiol. 589 (Pt 5), 1081-1093 (2011).</li><li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+GLP-1+secretion+downstream+of+the+ligand-gated+ion+channel+TRPA1.">Stimulation of GLP-1 secretion downstream of the ligand-gated ion channel TRPA1.</a> Diabetes. 64 (4), 1202-1210 (2015).</li><li>Psichas, A., Glass, L. L., Sharp, S. J., Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galanin+inhibits+GLP-1+and+GIP+secretion+via+the+GAL1+receptor+in+enteroendocrine+L+and+K+cells.">Galanin inhibits GLP-1 and GIP secretion via the GAL1 receptor in enteroendocrine L and K cells.</a> Br J Pharmacol. 173 (5), 888-898 (2016).</li><li>Tolhurst, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+fatty+acids+stimulate+glucagon-like+peptide-1+secretion+via+G-protein-coupled+receptor+FFAR2.">Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via G-protein-coupled receptor FFAR2.</a> Diabetes. 61 (2), 364-371 (2012).</li><li>Richards, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+diet+impairs+the+function+of+glucagon-like+peptide-1+producing+L-cells.">High fat diet impairs the function of glucagon-like peptide-1 producing L-cells.</a> Peptides. 77, 21-27 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Parker, H. E., Habib, A. M., Rogers, G. J., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient-dependent+secretion+of+glucose-dependent+insulinotropic+polypeptide+from+primary+murine+K+cells.">Nutrient-dependent secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from primary murine K cells.</a> Diabetologia. 52 (2), 289-298 (2009).</li><li>Pais, R., Rievaj, J., Larraufie, P., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+type+1+receptor-dependent+GLP-1+and+PYY+secretion+in+mice+and+humans.">Angiotensin II type 1 receptor-dependent GLP-1 and PYY secretion in mice and humans.</a> Endocrinology. 157 (10), 3821-3831 (2016).</li><li>Moss, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatostatin+receptor+5+and+cannabinoid+receptor+1+activation+inhibit+secretion+of+glucose-dependent+insulinotropic+polypeptide+from+intestinal+K+cells+in+rodents.">Somatostatin receptor 5 and cannabinoid receptor 1 activation inhibit secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from intestinal K cells in rodents.</a> Diabetologia. 55 (11), 3094-3103 (2012).</li><li>Habib, A. M., Richards, P., Rogers, G. J., Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-localisation+and+secretion+of+glucagon-like+peptide+1+and+peptide+YY+from+primary+cultured+human+L+cells.">Co-localisation and secretion of glucagon-like peptide 1 and peptide YY from primary cultured human L cells.</a> Diabetologia. 56 (6), 1413-1416 (2013).</li></ol>

החוקרים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והתרבות של תאי מעי דק בעכברים מעורבים כדי לאפשר לימוד הפרשת פפטיד במעי הדמית תא בודד של תאי enteroendocrine שכותרתו. כדי להגדיל את הסיכוי של תרבויות המעי דק להיות מוצלחות, חשוב כי הפרוטוקול מתבצע מהר ככל האפשר (רצוי, בתוך 3 שעות של קצירת הרקמות) וכי הרקמות נשמרות במדיום קר כקרח או חיץ לפני לתהליך העיכול, להגביל מוות של תאים. אמנם זה לא הכרחי, במיוחד עבור תרבויות גסות, הסרת שכבת השריר מן המעי הדק הוא מעודדים. פרוטוקול תרבות המעי הדק כבר טופל ככל האפשר. עם זאת, חשוב לציין כי אין תהליך העיכול הוא זהה. ישנם צעדים רבים במהלך הפרוטוקול הזה שבו השתנות ניתן הציגו על בסיס יום-יומי למשל מידת הסרת שריר, בגודל של t&quot;טחון&quot; הוא חתיכות רקמה, עוצמת רועדת, את העוצמה של קבוצה מסוימת של collagenase וכו. לכן, חשיבות עליונה לבחון aliquots של כל אחד שונה &quot;מעכל&quot; תחת מיקרוסקופ כדי להעריך את התקדמות תהליך העיכול חייט טלטול ומספר &quot;מעכל&quot; בהתאם. מומלץ ללחוץ יותר בעדינות מלכתחילה, ואם שברי הקריפטה אינם ברורות מן &quot;לעכל&quot; 3 ואילך, מתחיל לרעוד יותר בתקיפות. מניסיוננו, תאי enteroendocrine לא להתרבות בתרבות ובדרך כלל הולכים לאיבוד מתרבויות קטנות מעי תוך 4 ימים. אף על פי כן, זה מאפשר מספיק זמן כדי לבצע ניסויי הפרשת פפטיד בטן (בדרך כלל מתבצע מעל 2 h, 18-24 ציפוי פוסט h) כדי לבדוק גירויים פיסיולוגיים ו / או סוכנים תרופתיים. ניסויים הדורשים דגירה לילה לפני הניסוי הפרשה גם למשל ריאליבמקרה של טיפול מקדים עם רעלן השעלת 15. טכניקת התרבות העיקרית המוצגת כאן היא שיטה מבוססת היטב, כפי שמעיד היקף תפוקת מחקר זה פיק לאורך השנים. מודל התרבות העיקרי נעשה שימוש כדי ללמוד את הפרשת מגוון של פפטידים בטן, כולל GLP-1 1, GIP 18 ו PYY 19, בתגובה המזינה מגוון ולא מזין 14, 20 גירויים ומעכבים. יתר על כן, באותה הטכניקה יושמה בהצלחה לתרבות של תאים אנושיים מעיים 21. לעתים קרובות, שילוב של שיטת תרבית תאים ראשונית יחד עם למשל מודל ניסיוני נוסף. vivo לשעבר או in vivo יכול לספק את רוב תובנה 6. יש לציין, ובניגוד לשיטות אחרות, הטכניקה הזו יש imיישומים הנסב מעבר למדידה של שחרור פפטיד המעיים. הוכחנו כי תרבויות מעי דק עיקריות נגזרו עכברי כתב מהונדסים הם כלים רבים עצמה עבור החקירה של מסלולי איתות תאיים המצמידים בבטן הפרשת פפטיד, באמצעות למשל Ca 2+ וחיישנים מחנים, 11 GCaMP3, 13 ו Epac2camps 14, בהתאמה, כמו גם טכניקות אלקטרו 12. כמו בכל הדגמים במבחנה, תרבויות המעיים העיקריות יש מגבלות מובנות מסוימות, לרבות אובדן הקוטביות של תאי האפיתל בתרבות, כמו גם האובדן של היצע עצבוב דם. קשה לאמוד את ההשפעות האפשריות של תנאים מלאכותיים אלה על תפקוד התא enteroendocrine. עם זאת, נתונים המתקבלים מתרבויות עיקריות עמדו פעמים רבות לתרגום ב in vivo settiננוגרם (למשל ההשפעות של חומצות שומן קצרות שרשרת על GLP-1 הפרשת 15). תרבויות המעיים העיקריות הן טכניקה תכליתית עם יישומים פוטנציאליים רבים. הם כבר סיפקו תובנות מכניסטית חשוב אל תקנה של הפרשת פפטיד המעיים.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבודד תאי מעי בעכברים מעורב תרבות כדי לאפשר לימוד הפרשת פפטיד במעי הדמית תא חי של תאי enteroendocrine. גרסה מוקדמת של הליך זה פורסם במקור ב- 2008 על ידי ריימן ואח. 1 ומאז היווה את הבסיס של 20 פרסומים נוספים מהקבוצה שלנו. עבור כתב היד הזה, בחרנו להתמקד תרבויות מעי דק כפי שהם יותר מאתגרים להקים מ תרבויות גסות. תאים Enteroendocrine להפריש מערך של פפטידים הבטן כולל פפטיד גלוקגון דמוי 1 (GLP-1), גלוקוז-תלויים insulinotropic פפטיד (GIP), כולציסטוקינין (CCK) ו פפטיד YY (PYY) 2. יש פפטידים המעיים אלו תפקידים פיזיולוגיים חשובים ובארגון התגובות postprandial כגון האטת המעבר במעי, הגברה של שחרור אינסולין מגורה הגלוקוז אינדוקציה של שובע. GLP-1 mimeticsnd תרופות אשר מעכבים השפלה שלה מורשים כיום לטיפול בסוכרת מסוג 2 קיימת הערכה מתמשכת של הפוטנציאל הטיפולי של המרצת הפרשת אנדוגניים של פפטיד זה 3. הבנה טובה יותר של פיזיולוגית enteroendocrine ואת המנגנונים שבאמצעותם הפרשה או מגורה או עכבות הן, אפוא, חשיבות קריטית. גוט הפרשת פפטיד ניתן ללמוד באמצעות מגוון של במבחנה לשעבר vivo מודלים ניסיוניים, כל אחד עם יתרונות וחסרונות (לסקירה מקיפה האחרונות גם מכסה את השימוש במודלים vivo לראות סוונדסן et al. 4). Ex vivo טכניקות כגון לתאי Ussing המעי 5 ו perfused המבודד 6 כרגע בשימוש לחקור הפרשת פפטיד בטן בתגובה לחומרים שונים. היתרון העיקרי של שיטות אלה, כמולעומת תרבויות עיקריות, הוא שהסביבה המיידית של תאי enteroendocrine נותרת שלמה ברובו וחשובה, את הקוטביות של התאים נשמרה. לכן, אפשר לשאוב מידע לגביהם תא משטח secretagogue פועל 6. עם זאת, אלה הם בדרך כלל טכניקות נמוכה התפוקה ואיכות הנתונים הנגזרים מהם מסתמכת במידה רבה על היושרה ואת הכדאיות של רקמת המעי, אשר בהכרח ירידה לאורך זמן. Organoids מעיים כיום יותר ויותר בשימוש כמודלים חוץ גופית לחקר תפקוד התא enteroendocrine ופיתוח 7. Organoids, אשר יכול לנבוע הוא בעכברים ורקמות אדם, יש את היתרון של יצירת &quot;דמוית הקריפטה&quot; 3D מבנים המקיימים קוטבי בתא בתרבות. עם זאת, תאי enteroendocrine organoid הנגזרת טרם לאפיין באופן מלא דמיונם cel L מקורהls נשאר ברובו לא ידוע. יש תרבויות ראשיות היתרון של להיות צעד אחד קרוב יותר את ההגדרה הפיזיולוגית, כמו תאי enteroendocrine אינם מתוחזקים בדיל בתנאים מלאכותיים לתקופות זמן ממושכות. שיטת תרבות העיקרית חלופה אשר הועסקה על ההערכה של הפרשת פפטיד בטן היא הבידוד של תאים במעי עכברוש עוברי (FRICs) 8. עם זאת, התרבות של רקמת מעי מבוגרת זוכה להצלחה פחות כמה הבדלים נצפו על היענות FRICs לעומת תאי מעי בעכברים בוגרים (למשל גלוקוז 8). Enteroendocrine דמוי קווים סלולריים (למשל GLUTag, STC-1 ו- NCI-H716) שימשו באופן מסורתי להבחין vs ישיר. השפעות עקיפות על תאי enteroendocrine ולבתר מנגנונים מולקולריים שבבסיס צימוד גירוי ההפרשה; לראות Kuhre ואח </em&gt;. 9 לייצור והפרשת פפטיד ידי שורות תאי &quot;L תא דמוי&quot; הונצחו. זה כבר צורך כתאי enteroendocrine, הפזורים לאורך מערכת העיכול, מהווים רק תחת 1% של תאי האפיתל במעי 10 ו תאים ממוינים, בידיים שלנו, אינם שורדים בתרבות 1. קווים סלולריים להישאר כלים שימושיים בשל העובדה כי הם אוכלוסייה הומוגנית בעיקרה תא שבו היא תורמת מניפולציות גנטיות כגון-להשתקת גנים. כתוצאה מכך, קל לחקור את התפקיד של חלבונים אשר לא יכול להיות ממוקד פרמקולוגית, כאשר עכברים מהונדסים אינם זמינים. עם זאת, שורות תאים אינן מודלים תמיד תקפים של תאים ראשוניים. אמנם יש קווי דמיון רבים, ממצאים מתרבויות ראשיות בהזדמנות הדגישו הבדלי מסלולי האיתות מופעלים על ידי חומרים מזינים מסוימים בתאי L העיקריים לעומת תאי GLUTag, למשל (למשל. Peptones &lt;sup class = &quot;Xref&quot;&gt; 11). באופן מכריע, בשילוב עם עכברי כתב ניאון מהונדסים, מודל התרבות העיקרי מאפשר בחינה מפורטת של תאי enteroendocrine העיקרי בודדים ברמת תאיים. Fluorescently- מתויגים בתאי L בתוך תרבויות עיקריות כבר בשימוש על ידי הקבוצה שלנו עבור תיקון clamping 1, 12 מחקרים, וסידן תא בודד 11, 13 ו הדמית monophosphate סריג אדנוזין מחזורי 14 מחקרים, אשר הניבו התקדמות משמעותית בתחום enteroendocrine פִיסִיוֹלוֹגִיָה. הפרוטוקול הבא מותאם לביצוע ניסויי הפרשה, באמצעות צלחת 24-היטב או לעריכה של עד 16 מנות הדמיה, מן קטע 10 סנטימטרים של המעי הדק בין עכבר מבוגר יחיד. הפרוטוקול ניתן לשנות בקלות לחקר תאי המעי הגס על ידי הגדלת פעמים עיכול ושיתוףריכוז llagenase.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td>For secretion experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bombesin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4272</td>
			<td>Positive control (calcium imaging experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 ml, sterile</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td>For tissue preperation/ digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 ml, sterile</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430828</td>
			<td>For tissue preperation/ digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI (Crude)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9407</td>
			<td>For making up digestion medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High glucose (4500 mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6546</td>
			<td>For dissolving matrigel (keep at 4 oC). For making up digestion medium, pre-warm to 37 oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm)</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>For making up culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps/Tweezers</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT520</td>
			<td>For dissection/removal of intestine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td>Positive control (secretion experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottomed dishes (35 mm)</td>
			<td>MatTek</td>
			<td><a href="https://ufslive.admin.cam.ac.uk/OA_HTML/OA.jsp?OAFunc=ICX_POR_REQMGMT_DETAIL&amp;OASF=ICX_POR_REQMGMT_DETAIL&amp;reqHeaderId=%7B%21%21VHZooXq3GHQ6ng85h4o4sA%7D&amp;retainAM=Y&amp;addBreadCrumb=Y&amp;_ti=372495995&amp;oapc=18&amp;oas=dSLT2zPz7cgLm-ZkBP6Y6Q.." title="MatTek glass bottom dishes P35G-0-14-C">P35G-0-14-C</a></td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High precision tweezer (110 mm)</td>
			<td>IDEAL-TEK</td>
			<td>3480641 (5 SA)</td>
			<td>For removing muscle layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution digital CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-ER</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>Positive control (secretion experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 Medium (Leibovitz)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1518</td>
			<td>For collecting tissue, keep on ice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>For making up culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaFluor&#160;</td>
			<td>Molecular Devices (supplied by Cairn Research)</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescence ratio imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (C57BL6)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)</td>
			<td>in house</td>
			<td>-</td>
			<td>For calcium imaging and secretion experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (EVOS XL Core)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMEX1000</td>
			<td>For photomicrographs of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Inverted microscope with 40x oil objective used for imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>LW4234</td>
			<td>For cleaning tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS containing Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>For washing tissue, keep on ice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#38; Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td>For making up culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td>For cleaning tissue and removing muscle layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P/4280/53</td>
			<td>Positive control (calcium imaging experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT554</td>
			<td>For dissection/removal of intestine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>For filtering crypt cell suspension prior to plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless)</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>0308</td>
			<td>For dicing tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters, Minisart NML (0.2 &#181;m pore size)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534-K</td>
			<td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 20 ml, disposable, sterile, Luer slip</td>
			<td>BD</td>
			<td>300613</td>
			<td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon arc lamp 75W</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1000 in final culture medium)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells

המעי הוא האיבר האנדוקרינית הגדול ביותר בגוף, עם תאים enteroendocrine מפרישי ההורמון ממוקמים לאורכה של האפיתל של הקיבה והמעיים. למרות החשיבות הפיזיולוגית שלהם, תאי enteroendocrine מייצגים רק חלק קטן של אוכלוסיית התא האפיתל ובעבר, אפיונם הציג אתגר משמעותי וכתוצאה מכך הסתמכות על מודלי קו התא. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור הבידוד וההתרבות של תאי מעי דק בעכברים מעורבים. תרבויות העיקריות אלה שמשו לזיהוי מסלולי האיתות שבבסיס הגירוי והעיכוב של הפרשת פפטיד בטן בתגובת מספר החומרים מזינים נוירופפטידים כמו גם סוכנים תרופתיים. יתר על כן, בשילוב עם שימוש עכברי כתב ניאון מהונדסים, הוכחנו כי התרבויות העיקריות אלה הופכים כלי רב עצמה עבור הבדיקה של תאי enteroendocrine fluorescently-tagged בבית ברמת tracellular, באמצעות שיטות כגון הידוק תיקון וסידן תא בודד הדמית cAMP-סריג.

שימוש צעדי עיכול סדרו מאפשר האיסוף של הכנה יחסית נקיה של שברי הקריפטה להיות מצופה לניסויים. שני מעכל תחילה להסיר תאים בודדים בעיקר ופסולת תא מהחומר לעכל (איור 1A). במהלך Digest השלישי, שברי הקריפטה מופיעים חומר מתעכל (איור 1B). מעכל תשואה 4 ו 5 מספר גדול יותר של שברי הקריפטה עם תאים בודדים פחות (איור 1C). סינון החומר אסף מעכל 3-5 מסיר חתיכות גדולות של רקמה מעוכלת, שעלולה להזיק לתרבות, הפקת הכנת שבר הקריפטה נקיה (1D איור). בעקבות 18-24 שעות של תרבות, monolayers של תאי מעי דק עיקריים הם נצפו (איור 2 א). שימוש בתרביות המופקות עכברים טרנסגניים המבטאות את קאל במיוחדחיישן פלורסנט cium, GCaMP3, תחת שליטה של האמרגן proglucagon 11, תאי L שניתן לזהותם בקלות משובצים בתוך התרבות (איור 2B). בתרבויות מעי דק עיקריות, תרכובות מיקוד G q -Ca 2+ אני וקמפ אני תלויות מסלולים מגורים את הפרשת GLP-1 (עבור מתודולוגיה ניסוי הפרשה לראות ריימן et al. 1). Bombesin (BBS, 100 ננומטר) ושיתוף יישום של forskolin ו 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (F / I, 10 מיקרומטר אחד) עורר 2 ו 11-לקפל, גירוי של GLP-1 שחרור ביחס הבסיס, בהתאמה (איור 2C). ביטוי תא L ספציפי של GCaMP3 מאפשר זיהוי של וניטור בזמן אמת של גיוס סידן בתאי L פרט. שני 100 ננומטר bombesin (BBS) ו אשלגן כלורי 30 מ&quot;מ (KCl) מגורה עלייה זמנית סידן תאיים מעיד על q G ידוע &lt;תת /&gt; - ומסלולי electrogenic מצמיד בתאי L העיקריים (2D איור). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig2.jpg" /> איור 2: נציג נתונים שמקורם בתרבויות מעי דק עיקריות. תמונות דוגמא של תרבויות מעי דק עיקריות מעורבות משמשות (א) הפרשה ו (ב) ניסויי הדמיה לפרסם 24 ציפוי h. תמונה (א) שנלקחה צלחת 24-היטב, באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי הפוך עם מטרת 4X. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (ב) שימוש Glu-Cre x עכברים ROSA26 GCamP3, תאי L בתוך שדה הראייה (תאים ירוקים) זוהו על ידי הקרינה של GCaMP3. סרגל קנה מידה מייצג 50 מיקרומטר. (ג) הפרשת GLP-1 נמדדה בתגובה bombesin (BBS, 100 ננומטר) forskolin / 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (F / I, 10 מיקרומטר אחד). הפרשת GLP-1 אחוז חושבהעל ידי מדידת רמות GLP-1 ב supernatants ו lysates תא. הנתונים מייצגים את אמצעי ± SEM של n = 3 עבור כל תנאי. (ד) הקרינה GCaMP3 (המשקף סידן cytosolic) של שני תאים שהותוו (B) במעקב בזמן אמת בתגובה אשלגן כלורי (KCl, 30 מ&quot;מ) ו BBS (100 ננומטר). הדמית תא יחידה בוצעה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם מטרת נפט טבילת 40X. GCaMP3 הסעירה ננומטר 475/10, באמצעות מנורת קשת קסנון 75 W ו monochromator בשליטת התוכנה דימות פלואורסצנטי. פליטה נרשמת עם מצלמה למכשיר תשלום מצמידים דיגיטלית ברזולוציה גבוהה (CCD) באמצעות מראה dichroic ומסנן רוחב פס 510-560 ננומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells at JoVE.com

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והתרבות של תאי מעי דק בעכברים מעורבים. תרבויות מעיים העיקריות אלה מאפשרות החקירה של מסלולי איתות שבבסיס הפרשת פפטיד בטן באמצעות מספר הטכניקות.

תרבויות עיקריות מעורבות של Murine מעי דק המיועד לחקר הפרשת הורמון גוט וההדמיה של תא חי תאי Enteroendocrine

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

mixed-primary-cultures-murine-small-intestine-intended-for-study-gut

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K Views.  Wellcome Trust-MRC Institute of Metabolic Science, University of Cambridge.  פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והתרבות של תאי מעי דק בעכברים מעורבים. תרבויות מעיים העיקריות אלה מאפשרות החקירה של מסלולי איתות שבבסיס הפרשת פפטיד בטן באמצעות מספר הטכניקות. 

Video: Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

תרבויות עצבית ראשונית של המוח של Late Stage תסיסנית גלמים

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

דור של תרביות תאים המפוזרים Presomitic המזודרם להדמיה של דג הזברה פילוח השעון בתאים בודדים

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל<em&gt; Ex Vivo</em&gt; מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

לימוד חלבון מערכת בקרת איכות של<em&gt; D. discoideum</em&gt; שימוש הדמית תא חי בקרת טמפרטורה

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...