אנו מודים לכומר ד&quot;ר ראלף Bohlmann וכומר ד&quot;ר ג&#39;יימס Voelz למציעים את המילה &quot;Anastasis&quot; כדי לתאר את ההיפוך של אפופטוזיס; דאגלס ר &#39;ירוק לתאים הלה ביציבות להביע ציטוכרום C -GFP; Charles M. רודין ואריק א גרדנר לH446 תאים; הת&#39;ר כבש לסיוע בציור קריקטורה בווידאו; איי הואי Yeo לדיון חשוב של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי אדוארד Youde זיכרון מלגת סר (HLT), מלגת ד&quot;ר וולטר Szeto הזיכרון (HLT), מענק פולברייט 007-2,009 (HLT), מלגת מדעי חיים קרן המחקר (HLT), NIH מעניק NS037402 (JMH) וNS083373 (JMH), וועדת מענקי אוניברסיטת הונג קונג AoE / B-07/99 (MCF). הו Lam טאנג הוא קרן עמית Shurl וקיי קורצ&#39;י של מדעי החיים קרן המחקר.

The authors have nothing to disclose.

Anastasis מתייחס לתופעה שבה תאים שהופעלו מסלול המוות של תאים לאחר מכן להפוך את תהליך הגסיסה ולשרוד. הנה, יש לנו הראינו שהדמית תא חי יכולה לשמש כדי לאשר שאותם תאים בודדים למעשה יכולים להפוך את תהליך המוות של תאים אפופטוטיים בשלב מאוחר, ולאחר מכן להמשיך ולשרוד ולהתרבות. הפרוטוקולים שלנו לתאר כמה תנאי טיפול ספציפי לסוג תא מותאם כדי לגרום לאפופטוזיס ולאפשר חלק גדול מהתאים לעבור ההיפוך של אפופטוזיס במעקב עם כמה סמנים ביולוגיים לאימות. בעניינים טכניים, מנות תחתית זכוכית שמשו לתאי תרבות הדמיה 12,13, בגלל הזכוכית שקופה מאוד דקה שבין תאים ואובייקטיביים מיקרוסקופ, המאפשרת מרחקי עבודה ארוכים לconfocal באיכות גבוהה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי העלית בהגדלה גבוהה, מאפשר תצפית של אפופטוזיס הקלאסי כוללים פיצול של המיטוכונדריה, שחרורו של ציטוכרום C, ועיבוי גרעיני ופיצול. זכוכית גם לא לעוות את הקוטביות של אור, כדי לאפשר מיקרוסקופיה DIC באיכות גבוהה עבור ניטור של blebbing קרום, התכווצות תא של תאים, והיווצרות גוף אפופטוטיים באפופטוזיס. יש מיקרוסקופיה DIC יתרונות על פני מיקרוסקופ לעומת השלב להתבונן סימני ההיכר מורפולוגיות אלה של אפופטוזיס, כדסק&quot;ש משפר את הניגודיות של דגימות תאים בלא כתם ושקופים, שיפור זיהוי של מורפולוגיות תא. אם דסק&quot;ש ומיקרוסקופ לעומת השלב אינו זמינים, CellTracker יכול לשמש כדי להכתים את cytosol להתוות את המורפולוגיה של תאי חיים עבור מיקרוסקופיה confocal או עלית הקרינה ולפקח על המורפולוגיה של התאים. היישום של מינונים המתאימים של גירויי מוות והאסטרטגיות של הסרת הגירויים הם צעדים קריטיים לזיהוי של Anastasis. אנחנו בחרנו להשתמש בריכוזים נמוכים של אתנול כגירוי למוות descr הניסוייםibed כאן כי אחוז גדול של תאים שטופלו באופן אחיד יכול לעבור אפופטוזיס ויכול להתאושש מזה, שעלול להיות מתון יותר, גירוי מוות. עם זאת, יכולות להיות מיושמות גם גישות אלה בהצלחה עם גירויי מוות אחרים, כפי שדיווחנו 12,13. עם זאת, כמה גירויי מות מטבעם יותר מאתגר מאשר כגון staurosporine (STS), סוכן גרימת אפופטוזיס-נפוץ, אחרים. אולי משום שהוא נקשר מצעים שלה עם זיקה גבוהה 46-48, שטיפות חוזרות ונשנות הן חיוניות, אבל עדיין לא ביעילות להסיר STS מהתאים. במקרה זה, שימוש בריכוזים נמוכים יותר בסמים וזמן דגירה קצר יותר תרופה שעדיין יכול להפעיל את תהליך גסיסה אפופטוטיים יכול להיות מועיל כדי לאפשר יותר תאים להפוך אפופטוזיס. תאים עם מדיום תרבות תא מותנה גם יכול לשפר את ההיפוך של אפופטוזיס טוב יותר מתרבית תאים הבינוני טרי האכלה מחדש. תאים אפופטוטיים בדרך כלל מחוברים באופן רופף על פני השטח צלחת התרבות במיוחד על sur הזכוכיתפרצופים, ולכן חשוב לשטוף את inducers אפופטוזיס בעדינות כדי למנוע ניתוק תאים. ציפוי זכוכית מאכל עם פולי-D ליזין, קולגן ו / או פיברונקטין יכול להגדיל את דבקות תא ולמאפשרים סוגים מסוימים של תאים, כגון cardiomyocytes 37, לצרף כראוי על משטח הזכוכית של מנות תרבית תאים, במיוחד לאחר החשיפה של תאים ל גירוי מוות. התהליך של אפופטוזיס, וסביר להניח ההיפוך של אפופטוזיס, תלוי בפעילות האנזימטית שיכול להיות מושפעת מטמפרטורה. לכן, שמירה על תאים על 37 מעלות צלזיוס או במצב הרגיל שלהם התרבות היא חשובה לאורך כל תהליך ההדמיה לחיות כדי להבטיח שחזור של תוצאות ניסויים. מיקרוסקופ טרום חם לפני שמתחיל הדמיה תא חי הוא גם שלב קריטי המאפשר רכיבי מיקרוסקופ כדי להגיע תרמו-שיווי משקל. זה יכול למנוע את הסחיפה של מיקוד ושינוי של מישור xy עקב ההתרחבות והתכווצות התרמית שלרכיבים במהלך הדמיה תא חי. החלת או הסרת גירוי המוות על ידי שינוי המדיום תרבות צלחת עם או pipet או על ידי זלוף במערכת מיקרוסקופיה מראש חימם במהלך הדמיה הזמן לשגות עדיין יכול לגרום לסחיפה של מוקד עקב שינויים בטמפרטורה או נפח של המדיום. רכישת Z-ערימה יכולה לעזור לתאי תמונה במישור המוקד הנכון, אבל תגדיל את הסיכון של phototoxicity בשל חשיפה נוספת של תאים ללייזרי ניאון. לחלופין, שימוש במערכות פיצוי להיסחף מוקד, כגון מערכת תיקון פוקוס האוטומטי מבוסס לייזר אינפרא-אדומה, יכול לשמור על תאים באותו מישור המוקד במהלך הדמיה תא חי זמן לשגות על ידי שמירה על המרחק בין התאים / הזכוכית והאובייקטיבית ללא נוסף חשיפה של התאים לאורך גל קצר, הקרינה phototoxic. שחרור מיטוכונדריאלי של חלבוני apoptogenic כגון ציטוכרום C, והפעלה של caspases מפעיל, כגון במורד הזרם / אפקטאו caspase-3 וcaspase-7, כבר נחשבו בדרך כלל להיות &quot;נקודת אל-חזור&quot; ב2,5,6 תהליך המוות של תאים אפופטוטיים. כתמים מערביים היו בשימוש כדי לזהות את המחשוף (הפעלה) של caspase-3 והמצעים שלה כגון פולי (ADP) -ribose פולימראז-1 (PARP) וDFF45 / ICAD באוכלוסיית כולה התא במהלך אינדוקציה אפופטוטיים ולאחר הסרת אפופטוטיים גירויים, וגילו שהבקיע caspase-3, ICAD, וPARP הופיע בתאים במהלך חשיפה לגירויי מוות, אך נעלמו לאחר התאים מחדש הזנה עם התרבות טרי בינוני 13. עם זאת, שיטות אלה חושפים את המצב הכללי באוכלוסיית תא, אך אינו מבחינות התאים הבודדים שסופו של דבר למות מאלו שיתהפכו אפופטוזיס ולאחר מכן לשרוד. יש חלוקה ביוכימיים לנתח שחרורו של המיטוכונדריה ג ציטוכרום אזהרות דומות. לכן, כדי לעקוב אחר גורלם של תאים בודדים לאחר שחרור ציטוכרום C וcaspase-activation, שני מסימני ההיכר המוכרים ביותר של אפופטוזיס 2,5,6, מתויג GFP ציטוכרום C (Cyto C -GFP) וbiosensor caspase, כגון זה המשמש כאן NES-DEVD-YFP-NLS, בשילוב עם תא חי מיקרוסקופיה לעקוף בעיות אלה על ידי ההתבוננות ישירות התאוששות מורפולוגיים וטרנסלוקציה של biosensor Cyto C -GFP באותם תאים. תוצאות אלו מצביעות על ההפיכות של אפופטוזיס לאחר שחרור ציטוכרום C המיטוכונדריה והפעלת caspase. האתגר הנוכחי ללימוד Anastasis הוא חוסר טכניקות תיוג כדי לזהות תאים שעברו Anastasis בכל נקודה לאורך כל החיים שלהם, in vivo או במבחנה. ביטוי יציב של biosensor caspase NES-DEVD-YFP-NLS גם מאפשר זיהוי של פעילות caspase אם caspases מופעל שוב בעתיד, אבל לא באופן קבוע להקליט פעילות caspase כbiosensor הופעל יהיה מושפל ללא sustaפעילות caspase אינו עומד ל-13. חיישנים ביולוגיים אחרים שדווחו בעבר caspase, כגון החיישנים הביולוגיים קישטא מבוסס סריג (למשל ECFP- [DEVD] -Venus) 26,49, כמו גם כתבי ניאון Apoliner (CD8-RFP- [DQVD] -GFP) 50 וCPV (למשל CD8 - [DEVD] -Venus) 51,52, יכול לשמש כדי לזהות פעילות caspase בכל בעלי חיים ובתאים בתרבית, אבל יש מגבלות דומות. באופן דומה, Cyto C -GFP לא ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר תאים שהתהפכו אפופטוזיס בטווח ארוך, כפי שהוא שוחרר מן המיטוכונדריה לתוך cytosol במהלך אפופטוזיס ונפגע בהמשך. תיוג V Annexin נעשה שימוש כדי לעקוב אחר תאים שהתהפכו אפופטוזיס, אך עוצמת האות גם יורדת עם זמן, ולכן הוא לא שימושי למעקב לטווח ארוך של Anastasis 13,45. לטווח ארוך רצוף בהדמיה vivo יכול לשמש כדי לעקוב אחר גורלם של אותם תאים לאחר החשיפה של גירויי מוות. עם זאת, לטווח ארוך בתחום ההדמיה vivo עדיין מאתגר to לבצע ברוב בעלי חיים. לכן יש צורך בגישות נוספות להארכת מחקר Anastasis למחקרים בבעלי חיים שלמים, ולסינון תרופות שיכולים לקדם או לעכב Anastasis שימוש בתאים בתרבית הרקמה בעתיד, יש צורך בפרוטוקולים חדשים וטכניקות העוקבים אחר גורל תא לטווח ארוך כדי לפתח ולבדוק את ההשלכות פיסיולוגיות, פתולוגי וטיפוליות של Anastasis. אנחנו הצענו שAnastasis יכול להיות מנגנון הישרדות תא כללי להצלת תאים נפצעו שקשה להחליף, כגון תאים בוגרים ותאי לב 13. עם זאת, Anastasis של תאי סרטן אפופטוטיים לאחר טיפולים כימותרפיים עלול לגרום להתאוששות של תאים מסוכנים המובילים להישנות של גידולים עמידים 12,13. גם Anastasis יכול להיות מנגנון חשוב של יצירת גידולים, כחלק מתאים להציג שינוי שבעור אחרי שהתהפכו אפופטוזיס 13. לפיכך, שיפור Anastasis יכול להיות Thera חדשאסטרטגית peutic לעיכוב תהליכי ניוון מוחיה ואי ספיקת לב, תוך דיכוי Anastasis כדרך חדשה למניעה או טיפול בסוגי הסרטן. פיתוח חיישנים ביולוגיים למעקב היפוך של אפופטוזיס במערכות מודל מחלה יקדם את הבנתנו את מנגנוני הישרדות תא של Anastasis, והתרופות פוטנציאליות למחלות סוררות על ידי ויסות Anastasis.

אפופטוזיס (יווני &quot;נופל למוות&quot;) הנחה הוא בדרך כלל להיות תהליך חד-כיווני המסתיים בתא התאבדות 1-7. הפרעה גנטית של תוצאות גני פרו-מוות בהישרדותם של תאים נוספים שאחרת היה מתים בכל בעלי חיים, כוללים תאים שכבר יזמו את 8,9 מסלול אפופטוזיס. באופן דומה, מניפולציות גנטיות מאפשרות לתאי יונקים בריאים באופן מלאכותי להציג &quot;לאכול אותי&quot; אותות או שיאבדו את הדביקות למטריצת החוץ תאית שלהם כדי להינצל ממוות על ידי phagocytosis כל תא או entosis, בהתאמה 10,11. עם זאת, אנחנו ואחרים הראינו כי ללא תאי מניפולציה גנטית נורמלים בריאים יונקים ושורות תאים יכולים גם להתאושש מהמוקדמים של אפופטוזיס 12-15 שלבים. שימוש בכלים כדי לעקוב אחר תאים בודדים, יש לנו הפגנו נוסף התאוששות מהשלבים מאוחרים של אפופטוזיס 12,13, לאחר התאים עברו מחסומים חשובים שאופייניly לסמן את &quot;נקודת אל-חזור&quot; 2-6. מחסומים אלה של אפופטוזיס שלב מאוחר כוללים שחרור המיטוכונדריה של ציטוכרום C, הפעלה של caspases, פיצול גרעיני, והיווצרותם של גופים אפופטוטיים. אנחנו אימצנו מילה יוונית מתחם &quot;Anastasis&quot;, שפירושו &quot;עולה לחיים&quot;, כדי לתאר את המהפך הזה של אפופטוזיס על סף מות תא 2-6. אלא אם כן את תהליך גסיסה-ההתאוששות כולו נצפה על ידי הדמיה תא חי, הוא מאתגר להבחין בין תאים שעברו Anastasis מהתאים שמעולם לא חוו אירועים אפופטוטיים. עשרות שנים של עבודה חשפו כי תכונות מורפולוגיות של התאבדות תאים על ידי אפופטוזיס מונעות על ידי אירועים ביוכימיים ומולקולריים אבולוציונית שמורה 16-19. אירועים אלה לקדם הרס עצמי של תאים כדי לווסת תהליכים התפתחותיים וhomoeostatic באורגניזמים חד תאיים ורבים תאיים על ידי ביטול פגום או דתאי angerous 16-19. בעוד תאים אפופטוטיים ניתן להבחין בקלות על ידי גילויים מורפולוגיים, ביוכימי ומולקולריים אחידים של אפופטוזיס 1,5,6,16,20, כרגע אין סמן ידוע ספציפי לAnastasis 12,13. חשוב לציין, תאים שעברו Anastasis נראים תאים נורמלים בריאים, ותאים שפשוט להתחיל היפוך אפופטוזיס מופיע תאים מתים אפופטוטיים כ12,13. לפיכך, יש צורך בכלים חדשים לקבוע בודאות כי תא ששרד נתון חווה בעבר תהליכים אפופטוטיים פעילים. אפופטוזיס מקובל להניח כמפל בלתי הפיך, כי זה הוא תהליך הרס מהיר ומסיבי. למרות שזה יכול לקחת דקות לימים לכמה תאים ליזום אפופטוזיס, פעם המיטוכונדריה שיחררה גורמי apoptogenic כגון ציטוכרום C לתוך cytosol 21,22, ניתן להפעיל caspases תוך 5 דקות 23,24, ואחריו cytoplasmic ועיבוי גרעיני בתוך 10 דקות 25-27, ותא מוות זמן קצר לאחר מכן 25-27. caspases הופעל לתזמר אפופטוזיס על ידי ביקוע וinactivating רכיבים מבניים ותפקודיים מפתח לצורך ההריסה הסלולרית 2,28, כגון מעכבי endonuclease DFF45 / ICAD 29,30. Caspases גם להפעיל גורמים פרו-אפופטוטיים, כגון BID חבר BCL-2 משפחה, אשר translocates למיטוכונדריה כדי לקדם את שחרורו של המיטוכונדריה של ציטוכרום C 31,32. פעילות caspase גם תוצאות חשיפת תא שטח של phosphatidylserine כאות &quot;לאכול אותי&quot; לקידום בליעה למות תאים על ידי מקרופאגים או תאי שכנים דרך phagocytosis 33. יתר על כן, אירועים אפופטוטיים להבהיר המיטוכונדריה מתפקדת, שיבוש ביו-אנרגיה תאית ו34,35,36 חילוף חומרים. כך, התאוששות מהרס כזה נראה באופן אינטואיטיבי סבירה. בניגוד למקורי מצפהations, תאים יכולים להפוך את תהליך המוות של תאים אפופטוטיים אפילו בשלב מאוחר. על ידי ברציפות ניטור הגורל למות תאים בתרבית, צפינו הפיכות של אפופטוזיס בשלב מאוחר בטווח של תאים ראשוניים ושורות תאים 12,13. הסרת גירוי המוות אפשרה התאוששות מהתכונות הגלויות של אפופטוזיס, כגון פיצול המיטוכונדריה, עיבוי הכרומטין, נזק לדנ&quot;א, blebbing קרום פלזמה, חשיפה של phosphatidylserine פני תא, שחרורו של המיטוכונדריה ג ציטוכרום, הפעלת caspase, פיצול גרעיני, התכווצות תא, והיווצרותם של גופים אפופטוטיים. תצפיות אלה מעלות שאלות לא פתורות לגבי פונקציות, השלכות, והמנגנונים של Anastasis. כדי לענות על שאלות אלה, תנאי הוא לזהות באופן אמין תאים שעברו Anastasis. כאן אנו מתארים שיטות מיקרוסקופיה חיות וbiosensor caspase לגילוי תאים שהתהפכו אפופטוזיס שלב מאוחר וה בעברen שרד.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="667">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">LSM780 confocal microscopy</td>
			<td style="width:139px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:127px;">/</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Glass bottom culture dish</td>
			<td style="width:139px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:127px;">P35G-0-14-C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Transparent CultFoi</td>
			<td style="width:139px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:127px;">000000-1116-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">CO2 independent medium</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">18045-088</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">CellTracker</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">C34552</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Mitotracker Red CMXRos</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">M-7512</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">H1399</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Fluorescently labeled annexin V</td>
			<td style="width:139px;">Biovision</td>
			<td style="width:127px;">K201</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis

Anastasis (יווני עבור &quot;עולה לחיים&quot;) מתייחס להתאוששות של תאים מתים. לפני תאים אלה להתאושש, הם עברו דרך מחסומים חשובים של אפופטוזיס, כוללים פיצול של המיטוכונדריה, שחרורו של המיטוכונדריה ג ציטוכרום לcytosol, הפעלה של caspases, עיבוי הכרומטין, נזק לדנ&quot;א, פיצול גרעיני, blebbing קרום פלזמה, התכווצות תא, חשיפת תא שטח של phosphatidylserine, והיווצרותם של גופים אפופטוטיים. Anastasis יכול להתרחש כאשר גירויים אפופטוטיים יוסרו לפני המוות, ובכך מאפשרים לתאים למות כדי להפוך אפופטוזיס ומנגנוני מוות פוטנציאלי אחרים. לכן, Anastasis מופיע לערב תהליכי ריפוי פיסיולוגיים שיכול גם לקיים תאים פגומים בצורה בלתי הולמת. הפונקציות והמנגנונים של Anastasis עדיין אינן ברורות, הקשו בחלקו על ידי הכלים מוגבלים לאיתור אירועי עבר לאחר ההתאוששות של תאים בריאים לכאורה. אסטרטגיות כדי לזהות anastasis יאפשר מחקרים של המנגנונים הפיסיולוגיים, סכנות של תאים מתים בפתולוגיה מחלה, ורפויים פוטנציאליים לווסת Anastasis. כאן אנו מתארים אסטרטגיות יעילות באמצעות מיקרוסקופ תא חי וbiosensor caspase יונקים לזיהוי ומעקב Anastasis בתאי יונקים.

Watch this Scientific Journal Video about Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis at JoVE.com

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

אסטרטגיות למעקב Anastasis, תופעת הישרדות תא שהיפוך אפופטוזיס

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

strategies-for-tracking-anastasis-cell-survival-phenomenon-that

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

17.9K Views.  Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health. The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis. 

Video: Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Studies of cellular apoptosis have been significantly impacted since the introduction of flow cytometry-based methods. Propidium iodide (PI) is widely used in conjunction with Annexin V to determine if cells are viable, apoptotic, or necrotic through differences in plasma membrane integrity and permeability1,2. The Annexin V/ PI protocol is a commonly used approach for studying apoptotic cells3. PI is used more often than other nuclear stains because it is economical, stable and a good indicator of cell viability, based on its capacity to exclude dye in living cells 4,5. The ability of PI to enter a cell is dependent upon the permeability of the membrane; PI does not stain live or early apoptotic cells due to the presence of an intact plasma membrane 1,2,6. In late apoptotic and necrotic cells, the integrity of the plasma and nuclear membranes decreases7,8, allowing PI to pass through the membranes, intercalate into nucleic acids, and display red fluorescence 1,2,9. Unfortunately, we find that conventional Annexin V/ PI protocols lead to a significant number of false positive events (up to 40%), which are associated with PI staining of RNA within the cytoplasmic compartment10. Primary cells and cell lines in a broad range of animal models are affected, with large cells (nuclear: cytoplasmic ratios &lt;0.5) showing the highest occurrence10. Herein, we demonstrate a modified Annexin V/ PI method that provides a significant improvement for assessment of cell death compared to conventional methods. This protocol takes advantage of changes in cellular permeability during cell fixing to promote entry of RNase A into cells following staining. Both the timing and concentration of RNase A have been optimized for removal of cytoplasmic RNA. The result is a significant improvement over conventional Annexin V/ PI protocols (&lt; 5% events with cytoplasmic PI staining).

An accurate method for the assessment of cell death is described. The protocol improves upon conventional Annexin V/ propidium iodide (PI) protocols, which display up to 40% false- positive events in cell lines and primary cells from a broad range of animal models.

השתנה Annexin V / Propidium אפופטוזיס יודיד Assay לקבלת הערכה מדויקת של מוות של תאים

Studies of cellular apoptosis have been significantly impacted since the introduction of flow cytometry-based methods. Propidium iodide (PI) is widely ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

מעקב אחר דפורמציות המוךפו&quot;גנטי שהולך רקמות בעובר צ&#39;יק מוקדם

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Formulations for Freeze-drying of Bacteria and Their Influence on Cell Survival

Cellular water can be removed to reversibly inactivate microorganisms to facilitate storage. One such method of removal is freeze-drying, which is considered a gentle dehydration method. To facilitate cell survival during drying, the cells are often formulated beforehand. The formulation forms a matrix that embeds the cells and protects them from various harmful stresses imposed on the cells during freezing and drying. We present here a general method to evaluate the survival rate of cells after freeze-drying and we illustrate it by comparing the results obtained with four different formulations: the disaccharide sucrose, the sucrose derived polymer Ficoll PM400, and the respective polysaccharides hydroxyethyl cellulose (HEC) and hydroxypropyl methyl cellulose (HPMC), on two strains of bacteria, P. putida KT2440 and A. chlorophenolicus A6. In this work we illustrate how to prepare formulations for freeze-drying and how to investigate the mechanisms of cell survival after rehydration by characterizing the formulation using of differential scanning calorimetry (DSC), surface tension measurements, X-ray analysis, and electron microscopy and relating those data to survival rates. The polymers were chosen to get a monomeric structure of the respective polysaccharide resembling sucrose to a varying degrees. Using this method setup we showed that polymers can support cell survival as effectively as disaccharides if certain physical properties of the formulation are controlled1.

Freeze-drying is often an easy and convenient way to obtain dry products of viable bacterial cells. An issue of the process is cell survival. We detail here a procedure to investigate how cell survival during freeze-drying is influenced by the properties of the formulation used.

ניסוחים להקפאת ייבוש של חיידקים והשפעתם על הישרדות תא

Cellular water can be removed to reversibly inactivate microorganisms to facilitate storage. One such method of removal is freeze-drying, which is ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...