מחקר זה נתמך על ידי למדעי הטבע וההנדסה המועצה של קנדה (NSERC) מחקר מענק החקלאות אלברטה המימון קונסורציום להעניק DRB. AMR נתמך באמצעות מלגת Vanier NSERC בוגר הקנדי, מאוניברסיטת אלברטה אסיסטנט הוראה לבין המלכה אליזבת השנייה מלגה לתואר שני.

הליך זה יכול להתבצע 500 צינורות siliconized μL או 6 פוליסטירן מ&quot;ל מסביב לתחתית צינורות FACS. האחרון משמש בדרך כלל בעת ביצוע ניתוח הכדאיות יחד עם הליכים אחרים. כל הכרכים נתון במשך 6 פוליסטירן מ&quot;ל מסביב לתחתית צינורות FACS. במשך 500 צינורות siliconized μL, לצמצם את כל הכרכים של 1 / 5. הריכוז האופטימלי עבור ניתוח cytometry זרימה הוא 2-4 x 10 6 תאים לכל נפח 200 μL. אובדן תאים עשויים לנבוע הליך זה ובכך אנו ממליצים מדגם זה מורכב 4 x 10 6 תאים בתחילת ההליך. 1. תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים קציר - מתייחסים להליכים מיוחדים שורות תאים המתאימים או isolations התא הראשוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות x 335 גרם במשך 10 דקות למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 2 פוספט x 1 מ&quot;ל בופר סליין (PBS) - / - (לא סידן, מגנזיום, לא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות x 335 גרם במשך 10 דקות למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים 1 מ&quot;ל 1 חיץ x V Annexin מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות x 335 גרם במשך 10 דקות למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 100 חיץ μL 1 x V Annexin מחייב. </li></ol> 2. יישום Annexin V / PI כתמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף Annexin V לפי ההמלצות של היצרן [למשל 5 μL Annexin V אלקסה פלואוריד 488 (בדיקות מולקולריות, A13201)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות בחושך במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של 1 חיץ x V Annexin מחייב צינור כל תגובה. לא צריך להיות כ 200 μL בצינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 μL של PI (Sigma, חתול # P-4864-10 מ&quot;ל) כי כבר מדוללת 1:10 ב 1 חיץ x V Annexin מחייב (כלומר 1 PI μL עם 9 1 μL חיץ x V Annexin מחייב). זו תניב ריכוז לצרכן הסופי של 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​במדגם אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות בחושך במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL 1 x Annexin חיץ V מחייב לשטוף את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות x 335 גרם במשך 10 דקות למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 500 1 μL חיץ x V Annexin מחייב 500 פורמלדהיד 2% μL כדי ליצור פתרון 1% פורמלדהיד (מיצב). מערבבים צינורות ידי מצליף עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן דגימות קרח במשך 10 דקות. לחלופין, ניתן לאחסן דגימות לילה ב 4 ° C בחושך. אם שיטת האחרון נבחר, הקפד להיות עקבי לאורך כל הצינורות שכותרתו עם Annexin V / לצרכן (כולל בקרות פיצוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל 1 x PBS - / - לדגום כל ומערבבים בעדינות על ידי מצליף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות ב 425 x גרם במשך שמונה דקות למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.10 ו - 2.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ידי מצליף את הצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 16 μL של 1:100 בדילול RNase (Sigma, R4642) לתת הריכוז הסופי של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל. דגירה של 15 דקות בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל 1 x PBS - / - ומערבבים בעדינות על ידי מצליף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות ב 425 x גרם במשך שמונה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות מוכנים כעת להיות מנותח. לחלופין, דגימות יכול לשמש הצעדים הבאים מכתים אם Annexin / PI מכתים מתבצע במקביל הליכים אחרים. </li></ol> 3. נציג תוצאות: דוגמאות של סוגי תאים שורות תאים בעלי דרגות שונות של צביעה חיוביות שגויות לצרכן מוצגות באיור 1. כדי להסביר את חיוביות שגויות אירועים, תאים תוקנו וטופלו לאחר מכן עם RNase A. התוצאה היא ירידה משמעותית במספר אירועי חיוביות שגויות, לעומת תאים שלא עברו טיפול RNase (תרשים 2B). איור 2C מראה תמונות נציג של תאים שעברו טיפול RNase, לעומת תאים לא היה טיפול RNase. איור 3 מראה כיצד Annexin שונה V / PI פרוטוקול, עם קיבעון צעדים RNase הטיפול, משפר עם פרוטוקולי קונבנציונלי על ידי הגבלת מספר חיוביות שגויות אירועים מכתים. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. קונבנציונלי יודיד propidium פרוטוקולים מכתים להביא מספר משמעותי של אירועים חיובי כוזב. יש לנו הערכה בעבר מידת מכתים חיובי כוזב על פני תאים ראשוניים במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים כמו גם במגוון רחב של שורות תאים 10. נציג להראות תמונות היקף מכתים חיובי כוזב בשלוש אוכלוסיות תאים ייחודיים (קו אחד התא הנפוץ - מקרופאגים RAW ושני תאים ראשוניים - Murine מח עצם מקרופאגים (BMM) ו העיקרית דגי זהב כליה מקרופאגים (PKM)). אירועים חיוביים אמנם צפוי להציג את שיתוף לוקליזציה בין PI ו DRAQ5 בתוך תא גרעיני (אזורים צהובים מתארים colocalization בין PI ו DRAQ5). DRAQ5 הוא membra מאודנה חדיר כתמי צבע במדויק תא גרעיני הן תאים חיים ומתים 10,11,12. לקביעת ויזואלי קל של colocalization DRAQ5 כתם קיבל pseudocolour ירוק. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. שיפור הדיוק של מכתים לצרכן גרעיני. (א) בחנו הדיוק של מכתים לצרכן גרעיני המבוסס על מידת הדמיון של מספר היטב המאופיינת בכתמים גרעיני (BrdU, 7-AAD ו DAPI) כדי DRAQ5. BrdU הוא nucleoside סינתטי משולב אל תוך הדנ&quot;א של התאים מתרבים, וככזה יהיה רק ​​כתם בתוך תא גרעיני. 7-AAD יש זיקה גבוהה עבור דנ&quot;א, בדומה לצרכן, לא יכול לעבור ללא פגע הממברנה הפלסמטית. DAPI יש גם זיקה חזקה דנ&quot;א הוא הגרעין הנפוץ ביותר כתם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מידת הדמיון היה&gt; 99% בין BrdU, 7-AAD, DAPI ו DRAQ5, המדגיש את יכולתם במדויק כתם לגרעין התא ב 264.7 מקרופאגים RAW. לעומת זאת, מכתים לצרכן cytoplasmic מבוסס על פרוטוקולים קונבנציונאלי מוביל להפחתה ניכרת של דמיון אחוז מכתים יחסית DRAQ5. (ב) תוצאות דומות נצפו בשני תאים ראשוניים נבדק: Murine מח עצם מקרופאגים (BMM) ו העיקרית דגי זהב כליה מקרופאגים (PKM). התאגדות של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​RNase בשלב מסוים בתוך ההליך מסיר כתמים ללא גרעיני מכתים PI ו מגביר באופן משמעותי את מידת הדמיון ביחס מכתים DRAQ5. (ג) נציג תמונות של מקרופאגים כליה העיקרי להראות את מידת הדמיון של תאים עם או בלי טיפול RNase. לקביעת ויזואלי קל יותר של ההבדלים בין הטיפולים, DRAQ5 ניתנה ירוק. אזורים צהוב מתארים colocalization בין BrdU ו DRAQ5 ו PI ו DRAQ5. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. השתנה Annexin V / PI מפחית באופן משמעותי אפופטוזיס שווא / אירועים נמקי. ראשי כליה דגי זהב מקרופאגים (PKM) הוכתמו קונבנציונאלי שונה Annexin V / PI פרוטוקולים. Scatterplots לתאר את V Annexin / PI כתם PKM דגי זהב. Scatterplot משמאל מראה קונבנציונאלי Annexin V / PI מכתים (אין RNase) של תאים PKM. Scatterplot בצד ימין מראה תאים PKM מוכתמות Annexin שונה V / פרוטוקול PI (עם RNase). תוספת של תוצאות RNase לירידה הניכרת של מכתים לצרכן עקב הסרת כתמים חיובי כוזב. תאים PKM היו אז ניתחו מבוסס על אוכלוסיות שונות בתוך תרבויות מוקדמת אבות (EP), מונוציטים (מונו) ומקרופגים בוגרת (מאט מק). הירידה במספר האירועים החיוביים לצרכן, בשל הסרת אירועים חיוביים כוזבים הינה בולטת יותר גדול תאים macrophage בוגרת מאשר קטן ובתאים המוקדמות. מסקנות מבוסס על פרוטוקולים קונבנציונלי היה מציע בטעות מתאם חיובי במוות הסלולר עבור תת macrophage יותר בוגרת.

<ol>
	<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+apoptotic+cell+death.">Flow cytometry of apoptotic cell death.</a> J Immunol Methods. 243, 167-190 (2000).</li><li>Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., De Ridder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+V+expression+in+apoptotic+peripheral+blood+lymphocytes:+An+electron+microscopic+evaluation.">Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation.</a> Apoptosis. 7, 41-47 (2002).</li><li>Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytofluorometric+analysis+of+cell+cycle+distributions+using+propidium+iodide.+Properties+of+the+method+and+mathematical+analysis+of+the+data.">Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data.</a> J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).</li><li>Bacso, Z., Everson, R. B., Eliason, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+of+Annexin+V-binding+apoptotic+cells+is+highly+fragmented.">The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented.</a> Cancer Res. 60, 4623-4628 (2000).</li><li>Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P., Traganos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+apoptotic+cells+measured+by+flow+cytometry.">Features of apoptotic cells measured by flow cytometry.</a> Cytometry. 13, 795-808 (1992).</li><li>Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+death/life+regulator+in+apoptosis+and+necrosis.">The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis.</a> Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).</li><li>Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+and+necrotic+cell+death+induced+by+death+domain+receptors.">Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors.</a> Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).</li><li>Faleiro, L., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+disrupt+the+nuclear-cytoplasmic+barrier.">Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier.</a> J Cell Biol. 151, 951-959 (2000).</li><li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Luong, L. T., Schang, L. M., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+apoptosis+assays+using+propidium+iodide+generate+a+significant+number+of+false+positives+that+prevent+accurate+assessment+of+cell+death.">Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death.</a> J Immunol Methods. 358, 81-92 (2010).</li><li>Edward, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Use+of+DNA-specific+anthraquinone+dyes+to+directly+reveal+cytoplasmic+and+nuclear+boundaries+in+live+and+fixed+cells.">Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells.</a> Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).</li><li>Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+analysis+of+the+DNA+targeting+bisalkylaminoanthraquinone+DRAQ5+in+intact+living+cells.">Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells.</a> Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

V Annexin / PI פרוטוקול המוצג כאן הוא גרסה שונה של פרוטוקולים קונבנציונאלי לוקח בחשבון את נוכחותם של רנ&quot;א בציטופלסמה שיש לה גם זיקה גבוהה עבור לצרכן. מבוא של RNase (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לאחר שלב 1% פורמלדהיד קיבעון מאוחר בהליך מכתים משפר משמעותית את הדיוק של מכתים לצרכן גרעיני. השפעות שליליות הן לא נצפתה מכתים לצרכן גרעיני או פלזמה קרום מכתים Annexin V. ללא טיפול RNase, עד 40% של תוצאות PI כתם יכול להוביל לאירועים חיובי כוזב, אשר מוביל השפעה משמעותית פוטנציאל שלילי על מסקנות במורד 10. שונה שלנו Annexin V / PI פרוטוקול מכתים הוא פשוט נעשה שימוש יעיל במגוון רחב של סוגי תאים (תאים ראשוניים: Murine מח עצם מאקרופאגים splenocytes; החזירים תושב לתאי ריאה, מקרופאגים ריאות מכתשיים, mesenteric צומת מבודד הלימפה, leukocytes דם היקפיים , splenocytes; blastoderm תאים עוף, דג זהב העיקרי מקרופאגים כליה; leukocytes קרפיון דם היקפיים; קווי נייד: RAW 264.7 מקרופאגים, Jurkat בתאי T, החזירים 3D4/31 מקרופאגים, CCL-71 fibroblasts סנפיר דג, שפמנון 3B11 B תאים 10). חשוב לציין כי התאים מושפעים באופן דיפרנציאלי על ידי מכתים שווא לצרכן חיובית, עם תאים ראשוניים בדרך כלל לאחר מספר גדול יותר של אירועים חיובי כוזב 10. ההבדלים לצרכן שווא מכתים חיובית בקרב אוכלוסיות אלה הסלולר ניתן לייחס בחלקו ההבדלים בגודל התא, אך יכול גם לנבוע הבדלים בתוכן RNA. כמו שילוב כזה, של הליך זה רלוונטי במיוחד עבור מערכות ניסיוניות לנצל, בין היתר, התאים העוברים מתח genotoxic, בתאים שטופלו מחזור התא תרופות כגון מעצר או thymidine hydroxyurea, תאים נגועים בנגיף, מחקרים על תאים עובריים שבהם התקדמות התפתחותית מאופיין על ידי שינויים בדידים בסינתזה RNA התאי.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1 x PBS-/-</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 x Annexin V Binding Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>556454</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Annexin V-Alexa Fluor 488</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes (Invitrogen)</td>
<td>A13201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Propidium iodide (PI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P4864</td>
<td>1 mg/mL in H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>2% Formaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F1268</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A from bovine pancreas</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R4642</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DRAQ5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biostatus</td>
<td>DR50050</td>
<td>Dilute 1:60 in 1 x PBS-/-</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

modified annexin v/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death

מחקרים של אפופטוזיס הסלולר כבר מושפע באופן משמעותי מאז כניסתה של cytometry שיטות מבוססות זרימה. יודיד Propidium (PI) נעשה שימוש נרחב בשיתוף עם Annexin V כדי לקבוע אם התאים קיימא, אפופטוטיים, נמקי או באמצעות ההבדלים שלמות קרום פלזמה ו 1,2 חדירות. V / PI Annexin פרוטוקול היא גישה הנפוץ לחקר תאים אפופטוטיים 3. PI משמש לעתים קרובות יותר מאשר כתמים גרעיני אחרים כי זה חסכוני, יציבה אינדיקטור טוב של כדאיות התא, המבוססת על יכולתה להוציא לצבוע בתאים חיים 4,5. היכולת של PI לחדור לתא תלויה החדירות של הממברנה; לצרכן לא להכתים תאים אפופטוטיים לחיות או מוקדם בשל נוכחותם של קרום פלזמה שלם 1,2,6. בשנת תאים אפופטוטיים, נמקי מאוחר, את שלמות פלזמה ו ממברנות הגרעין פוחתת 7,8, המאפשר לצרכן לעבור דרך הממברנות, intercalate לתוך חומצות גרעין, ולהציג אדום פלואורסצנטי 1,2,9. למרבה הצער, אנו מוצאים כי קונבנציונאלי Annexin V / PI פרוטוקולים להביא מספר משמעותי של אירועים חיובי כוזב (עד 40%), אשר משויכים מכתים לצרכן של RNA בתוך תא cytoplasmic 10. תאים ראשוניים שורות תאים במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים מושפעים, עם תאים גדולים (הגרעין: יחסי cytoplasmic &lt;0.5) מראה את המופע הגבוהה ביותר 10. בזאת, אנחנו מדגימים שונה Annexin V / PI שיטה המספקת שיפור משמעותי להערכה של מוות של תאים בהשוואה לשיטות קונבנציונליות. פרוטוקול זה מנצל שינויים בחדירות התא הסלולרי במהלך תיקון כדי לקדם את כניסתם של RNase לתאים הבאים מכתים. גם עיתוי וריכוז RNase מוטבו להסרת RNA cytoplasmic. התוצאה היא שיפור משמעותי לעומת המקובל Annexin V / פרוטוקולי PI (&lt;5% עם אירועים מכתים cytoplasmic PI).

Watch this Scientific Journal Video about Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death at JoVE.com

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

שיטה מדויקת להערכת מוות של תאים מתואר. פרוטוקול משפר עם קונבנציונאלי Annexin V / propidium (PI) פרוטוקולים יודיד, אשר להציג עד חיוביות שגויות אירועי 40% בשורות תאים תאים ראשוניים מתוך מגוון רחב של מודלים של בעלי חיים.

השתנה Annexin V / Propidium אפופטוזיס יודיד Assay לקבלת הערכה מדויקת של מוות של תאים

Studies of cellular apoptosis have been significantly impacted since the introduction of flow cytometry-based methods. Propidium iodide (PI) is widely ...

modified-annexin-vpropidium-iodide-apoptosis-assay-for-accurate

Research

JoVE Journal

Biology

102.4K Views.  University of Alberta. שיטה מדויקת להערכת מוות של תאים מתואר. פרוטוקול משפר עם קונבנציונאלי Annexin V / propidium (PI) פרוטוקולים יודיד, אשר להציג עד חיוביות שגויות אירועי 40% בשורות תאים תאים ראשוניים מתוך מגוון רחב של מודלים של בעלי חיים.

Video: Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

השתנה עכבר תא גזע עובריים Assay מבוסס על כימות יעילות אינדוקציה קרדיוגני

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative positive or negative regulators of cell death. In this system, N. benthamiana leaves are co-infiltrated with a 35S driven expression cassette containing the gene to be analyzed, and the GUS vector pCAMBIA 2301 using Agrobacterium strain LBA4404 as a vehicle. Because live cells are required for GUS expression to occur, loss of GUS activity is expected when this marker gene is co-expressed with positive regulators of cell death. Equally, increased GUS activity is observed when anti-apoptotic genes are used compared to the vector control. As shown below, we have successfully used this system in our lab to analyze both pro- and anti-death players. These include the plant anti-apoptotic Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) family, as well as, known mammalian inducers of cell death, such as BAX. Additionally, we have used this system to analyze the death function of specific truncations within proteins, which could provide clues on the possible post-translational modification/activation of these proteins. Here, we present a rapid and sensitive plant based method, as an initial step in investigating the death function of specific genes.

A &amp;#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Programmed cell death assays commonly used in mammalian systems such as DNA laddering or TUNEL assays, are often difficult to reproduce in plants. In combination with a GUS reporter system, we propose a rapid, plant based transient assay to analyze the potential death properties of specific genes.

Β-glucuronidase (גאס) נייד מבוסס מוות Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

שימוש בLysoTracker לזהות מות תאים מתוכנים בעוברים ומיון תאי גזע עובריים

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

אסטרטגיות למעקב Anastasis, תופעת הישרדות תא שהיפוך אפופטוזיס

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and pathological roles, there is need of high-throughput screening (HTS) assays to identify GJ modulators in drug discovery and toxicology assays. A novel iodide-yellow fluorescent protein-gap junction-intercellular communication (I-YFP-GJIC) assay fulfills this need. It is a cell-based assay including acceptor and donor cells that are engineered to stably express a yellow fluorescent protein (YFP) variant, whose fluorescence is sensitively quenched by iodide, or SLC26A4, an iodide transporter, respectively. When iodide is added to a mixed culture of the two cell types, they enter the donor cells via the SLC26A4 transporter and diffuse to the adjacent acceptor cells via GJs where they quench the YFP fluorescence. YFP fluorescence is measured well by well in a kinetic mode. The YFP quenching rate reflects GJ activity. The assay is reliable and rapid enough to be used for HTS. The protocol for the I-YFP-GJIC assay using the LN215 cells, human glioma cells, is described.

Here, we present a protocol for a novel gap junction intercellular communication assay designed for the high-throughput screening of gap junction-modulating chemicals for drug discovery and toxicological assessment.

Assay תקשורת צומת-המערכת יודיד-צהוב הניאון חלבון-Gap

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

תפילת מיופיבר יחיד לבדיקה להערכת פונקציונליות תאי גזע שריר למבוגרים Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous research indicated that multiple pathways could mediate the spontaneous death of neutrophils. A cocktail was developed by simultaneously targeting these pathways, caspases-lysosomal membrane permeabilization-oxidant-necroptosis inhibition plus granulocyte colony-stimulating factor (CLON-G), which prolonged the neutrophil lifespan to greater than 5 days without significantly compromising the neutrophil function. Concurrently, a reliable and stable protocol for assessing and evaluating neutrophil death was also developed. In this work, we show that CLON-G can prolong the neutrophil lifespan in vitro to more than 5 days, and we exhibit the lengthening of the neutrophil lifespan with FACS and confocal fluorescence microscopy. This report introduces procedures for the preparation of CLON-G and showcases an in vitro spontaneous death assay of neutrophils, which can be used for the study of neutrophils and for subsequently interrogating neutrophil death, thus providing a reliable resource for the neutrophil community.

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

This protocol details the preparation of CLON-G to extend the neutrophil lifespan to greater than 5 days and provides a reliable procedure for evaluating neutrophil death with flow cytometry and confocal fluorescence microscopy.

הארכת תוחלת החיים של נויטרופילים עם CLON-G ובדיקת מוות ספונטני במבחנה

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous ...