The authors would like to thank the Lam Lab at Georgia Tech for many helpful discussions in developing the experimental assays. Research reported in this publication was supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number K01HL115486 and by New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 from the Office of the Director, National Institutes of Health. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

הערה: הפרוטוקול הבא פועל לפי ההנחיות שנקבעו על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי (IRB) בג&#39;ורג&#39;יה טק. איסוף דם 1. והליך בידוד תאי דם אדום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 40-120 מיליליטר של דם מתורמים ב 10 מיליליטר צינורות Vacutainer heparinized. התחל PBMC בידוד (תאי דם היקפיים mononucleated) בתוך 4 שעות של אוסף. במהלך תקופה זו, לשמור על דם בRT. הערה: O / אחסון N של דם בRT או ב 4 ° C אינה מומלץ כזה יגרום לתשואת PBMC נמוכה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל דם כל 1: 1 בPBS סטרילי קר כקרח (4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 מיליליטר של פוליסכריד הידרופילי קר כקרח לתוך צינור ריק, סטרילי 50 מיליליטר חרוטי. בעדינות להעביר כל דם מדולל על גבי פוליסכריד הידרופילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה 25 מיליליטר בהגדרה איטית ודם טפטפת לאורך הצד של הצינור באיטיות רבה. ודא שהדם אינו מעורבב עם saccharide לפני centrifugation כי פוליסכריד הידרופילי הוא רעיל לתאים ואחרת, תשואת PBMC תהיה נמוכה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות דם צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 400 XG ב 4 מעלות צלזיוס. אם זמין, להפחית את מהירות הבלם של צנטריפוגות למחצית המרבית להפרדה טובה יותר לאחר צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את חלק פלזמה / טסיות דם של דגימת דם centrifuged. בזהירות לשאוב את שכבת פוליסכריד הידרופילי ישירות מעל שכבת RBC ארוזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 8-10 מיליליטר של תאי דם אדומים ארוזים ולדלל 1: 1 עם 0.9% מלוחים NaCl לא סטרילי. </li></ol> 2. מבני קריש Confocal מיקרוסקופית הערכת Glycated (קרישי סוכרתיים סימולציה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר פיברינוגן האדם והמצומד פיברינוגן אדם שכותרתו fluorescently על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה הבאה ל0.5 מיליליטר סיים צינור microcentrifuge. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרישי פיברינוגן הבריאים, נורמלים, לערבב פיברינוגן אדם עם 10% פיברינוגן אדם שכותרתו fluorescentlyהמצומד בחיץ 50 מ&quot;מ טריס / 100 מ&quot;מ NaCl בריכוז של 5 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפיברינוגן Glycated באופן מלאכותי (כדי לדמות קרישים סוכרתיים), דגירה פיברינוגן אדם ו -10% המצומד פיברינוגן fluorescently שכותרתו בפתרון 5 מ&quot;מ של גלוקוז מומס ב-50 מ&quot;מ טריס / 100 מ&quot;מ NaCl לריכוז של 6.8 מ&quot;ג / מיליליטר וכתוצאה מכך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את צינורות מיקרו צנטריפוגות באמצעות חומר אטום כדי להימנע מחשיפה לאור. דגירה הצינורות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תא בשקופית מיקרוסקופ זכוכית על ידי ההדבקה בדבק דק על 2 צדדים של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה 48 שעות, להכין חומרים כימיים להיווצרות הפיברין ידי הפשרת FXIIIa ותרומבין אלפא האנושי בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל FXIIIa 80 U / ml ב 5 מ&quot;מ CaCl חיץ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרומבין 4 U / ml ב 5 מ&quot;מ CaCl חיץ 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרישים רגילים, להבטיח כי הריכוזים הסופיים של פיברינוגן, FXIIIa, ותרומבין הם 2.5 מ &#39;g / ml, 20 U / ml, ו1 U / ml, בהתאמה בהיקף של 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרישים Glycated, להבטיח כי הריכוזים הסופיים של פיברינוגן, FXIIIa, ותרומבין הם 3.4 מ&quot;ג / מיליליטר, 20 U / ml, ו1 U / ml, בהתאמה בהיקף של 50 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד פיפטה 30 μl של פתרון הפיברין לתוך התא שהוקם על ידי הדבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 22 מ&quot;מ כיסוי הזכוכית להחליק x 22 מ&quot;מ עם עובי של 0.15 מ&quot;מ על גבי 2 שכבות של דבק. חותם את הצדדים הפתוחים עם דבק ברור כדי למנוע קריש הפיברין מהתייבשות. ודא שהדבק אינו אינטראקציה עם קריש הפיברין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לקרישי פיברין לפלמר ב21-23 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 לפני ההדמיה confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות מיקרוסקופיה confocal של קרישים באמצעות מיקרוסקופ confocal עם עדשת השמן M27 40X / 1.30 עם לייזר ארגון 488 ננומטר. </li></ol> 3. Confocal מיקרוסקופית הערכת קרישי פיברין מכילים RBCs מחולי אנמיה חרמשית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר פיברינוגן האדם והמצומד פיברינוגן אדם שכותרתו fluorescently על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה הבאה ל0.5 מיליליטר סיים צינור microcentrifuge. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקריש הפיברין הבריא, נורמלי, לערבב פיברינוגן אדם עם 10% המצומד פיברינוגן האדם שכותרתו fluorescently בחיץ mM NaCl 50 מ&quot;מ טריס / 100 בריכוז של 5 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרישים המכילים SCD RBCs, לערבב פיברינוגן אדם ו -10% המצומד פיברינוגן האדם שכותרתו fluorescently ב-50 מ&quot;מ טריס / 100 מ&quot;מ NaCl כך שהריכוז של פיברינוגן וכתוצאה מכך הוא 10 מ&quot;ג / מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית RBCs המבודד (הן נורמליות ואלה מחולי אנמיה חרמשית שהתקבלו מפרוטוקול בידוד RBC) באמצעות פתרון תא תיוג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות תאים בצפיפות של 1 x 10 6 לכל מיליליטר בכל מדיום תרבות סרום ללא בחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl / מיליליטר של ההשעיה התא לפתרון תא תיוג. מערבבים היטב על ידי pipetting העדין בעדינות. </li><li&gt; דגירה של 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות השעיה שכותרתו ב 1500 סל&quot;ד במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ועדינות מחדש להשעות את התאים 37 ° C בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך השטיפה (3.3.4 ו3.3.5) עוד פעמיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל FXIIIa 80 U / ml ב 5 מ&quot;מ CaCl חיץ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרומבין 4 U / ml ב 5 מ&quot;מ CaCl חיץ 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרישים רגילים, להבטיח כי הריכוזים הסופיים של פיברינוגן, FXIIIa, ותרומבין הם 2.5 מ&quot;ג / מיליליטר, 20 U / ml, ו1 U / ml, בהתאמה בהיקף של 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרישים המכילים SCD RBCs, להבטיח כי הריכוזים הסופיים של פיברינוגן, FXIIIa, ותרומבין הם 5 מ&quot;ג / מיליליטר, 20 U / ml, ו1 U / ml, בהתאמה בהיקף של 50 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של RBCs שכותרתו לפתרון הפיברין. פיפטה 30 μl של הפיברין עם RBCs על משטח הזכוכית מיקרוסקופ (ראה להחליק הכנה לGLקרישי ycated). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר ליפין לפלמר ב21-23 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 לפני ההדמיה confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות confocal של קרישים באמצעות מיקרוסקופ confocal, ולנצל לייזרי עירור עם אורכי גל של 488 ננומטר 633 ננומטר ולהלהיב את הפיברין שכותרתו fluorescently וRBCs. </li></ol> 4. Confocal מיקרוסקופית הערכת הפירוק פיברין המחירים במבני קריש Glycated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פרוטוקול מיקרוסקופיה confocal של קרישי Glycated (פרוטוקול שלב 2) להערכת שיעור הפירוק פיברין בקרישי Glycated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לא לאטום את הקצוות של החדר עם דבק ברור. לאפשר לקרישי פיברין לפלמר עבור 1.5 שעות ב21-23 מעלות צלזיוס במארז אטום המכיל 250 מיליליטר של מים על מנת למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פילמור, להשיג תמונות של קרישים באמצעות מיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמין פיפטה לקצה הפתוח של החדר ולפזר את פלסמין דרך הקריש באמצעות פעולת נימים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניסויי פירוק פיברין נורמלים וGlycated עם ריכוזים נורמלים, פיפטה 25 μl ב 200 מיקרוגרם / מיליליטר של פלסמין לתוך הפתח של החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרישים Glycated עם ריכוזים מופחתים, פיפטה 25 μl ב 50 מיקרוגרם / מיליליטר לתוך הפתח של החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתכונת זמן הסדרה (ראה איור 1) בתוכנת מיקרוסקופ confocal ללכוד צילומי וידאו של פלסמין lysing הקריש בזמן אמת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ מצב רכישה ולאחר מכן בחר &quot;סדרות עתיות.&quot; בחר את מספר המחזורים ואת מרווח זמן הקלטה. </li></ol></li></ol> 5. חישוב המחירים הפירוק פיברין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את שיעור תמוגה ידי הגדרת אזור (2,500 מיקרומטר 2) וחישוב הזמן שחלף נדרש לפזר אזור קבוע של הקריש. לחשב את שיעור תמוגה באמצעות המשוואה הבאה (איור 2): <img alt="משוואת 1" fo:content-width="2in" src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,019 / 52019eq1.jpg&quot; /&gt; </li></ol> 6. ניתוח סטטיסטי של המחירים הפירוק פיברין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את נתוני תמוגה באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטית. לבצע ניתוח שונה חד-כיווני ופוסט הוק מבחן Tukey-Kramer 44,45. </li></ol>

<ol>
	<li>Averett, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+Fibrinogen+Model+that+Captures+the+Stress-Strain+Behavior+of+Fibers.">A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers.</a> Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).</li><li>Carlisle, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+properties+of+individual,+electrospun+fibrinogen+fibers.">The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers.</a> Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).</li><li>Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+origins+of+the+mechanical+properties+of+fibrin.">The molecular origins of the mechanical properties of fibrin.</a> Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).</li><li>Guthold, M., Cho, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+Unfolding+Mechanisms+Are+Not+Too+Much+of+a+Stretch.">Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch.</a> Structure. 19, 1536-1538 (2011).</li><li>Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+fibrin+clots+II:+Linear+viscoelastic+behavior+in+shear+creep.">Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep.</a> Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).</li><li>Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+fibrin+clots.+v.+shear+modulus,+creep,+and+creep+recovery+of+fine+unligated+clots.">Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots.</a> Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).</li><li>Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+fibrin+clots.+I.:+Dynamic+viscoelastic+properties+and+fluid+permeation.">Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation.</a> Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).</li><li>Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Origins+of+Fibrin+Clot+Rheology.">Structural Origins of Fibrin Clot Rheology.</a> Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).</li><li>Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+assembly.+Lateral+aggregation+and+the+role+of+the+two+pairs+of+fibrinopeptides.">Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides.</a> Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).</li><li>Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+properties+of+fibrin+for+basic+scientists+and+clinicians.">The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians.</a> Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).</li><li>Wolberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+generation+and+fibrin+clot+structure.">Thrombin generation and fibrin clot structure.</a> Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).</li><li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+generation,+fibrin+clot+formation+and+hemostasis.">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).</li><li>Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructure+of+the+Fibrin+Clot.">Nanostructure of the Fibrin Clot.</a> Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).</li><li>Dunn, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+fibrin+clot+structure+in+diabetes.">Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes.</a> Herz. 29, 470-479 (2004).</li><li>Gladwin, M. T., Sachdev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+abnormalities+in+sickle+cell+disease.">Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).</li><li>Collet, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Fibrin+Architecture+Is+Associated+With+Hypofibrinolysis+and+Premature+Coronary+Atherothrombosis.">Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).</li><li>Carr, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus:+a+hypercoagulable+state.">Diabetes mellitus: a hypercoagulable state.</a> Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).</li><li>Ajjan, R. A., Ari&#235;ns, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+disease+and+heritability+of+the+prothrombotic+state.">Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state.</a> Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).</li><li>Standeven, K. F., Ari&#235;ns, R. A. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+physiology+and+pathology+of+fibrin+structure/function.">The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function.</a> Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).</li><li>Alzahrani, S., Ajjan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+article:+Coagulation+and+fibrinolysis+in+diabetes.">Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes.</a> Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).</li><li>Stuart, M. J., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle-cell+disease.">Sickle-cell disease.</a> The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).</li><li>Dunn, E. J., Ari&#235;ns, R. A. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+type+2+diabetes+on+fibrin+structure+and+function.">The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function.</a> Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).</li><li>Dunn, E. J., Philippou, H., Ari&#235;ns, R. A. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+involved+in+the+resistance+of+fibrin+to+clot+lysis+by+plasmin+in+subjects+with+type+2+diabetes+mellitus.">Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).</li><li>Famodu, A., Reid, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+fibrinogen+levels+in+sickle+cell+disease.">Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease.</a> Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).</li><li>Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+Changes+in+Coagulation+and+Viscosity+during+Sickle-Cell+Crisis.">Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis.</a> British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).</li><li>Ataga, K. I., Orringer, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercoagulability+in+sickle+cell+disease:+a+curious+paradox.">Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox.</a> The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).</li><li>Collet, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+fibrin+architecture+is+associated+with+hypofibrinolysis+and+premature+coronary+atherothrombosis.">Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).</li><li>Barazzoni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Fibrinogen+Production+in+Type+2+Diabetic+Patients+without+Detectable+Vascular+Complications:+Correlation+with+Plasma+Glucagon+Concentrations.">Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).</li><li>Ceriello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulation+activation+in+diabetes+mellitus:+the+role+of+hyperglycaemia+and+therapeutic+prospects.">Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects.</a> Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).</li><li>Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+adhesiveness,+plasma+fibrinogen+and+factor+VIII+levels+in+diabetes+mellitus.">Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 6, 436-440 (1970).</li><li>Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+fibrin.">Fibrinogen and fibrin.</a> Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).</li><li>Collet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Fibrin+Network+Conformation+and+Fibrin+Fiber+Diameter+on+Fibrinolysis+Speed+Dynamic+and+Structural+Approaches+by+Confocal+Microscopy.">Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).</li><li>J&#246;rneskog, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+properties+of+the+fibrin+gel+structure+in+patients+with+IDDM.">Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM.</a> Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).</li><li>Svensson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+and+glycation+of+fibrinogen+in+vitro+occur+at+specific+lysine+residues+in+a+concentration+dependent+manner:+A+mass+spectrometric+and+isotope+labeling+study.">Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).</li><li>Pieters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycation+of+fibrinogen+in+uncontrolled+diabetic+patients+and+the+effects+of+glycaemic+control+on+fibrinogen+glycation.">Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation.</a> Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).</li><li>Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+fibrin+clot+networks+from+stereoscopic+intermediate+voltage+electron+microscope+images+and+analysis+of+branching.">Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching.</a> Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).</li><li>Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+extravascular+and+intravascular+cells+to+fibrin+network+formation,+structure,+and+stability.">Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability.</a> Blood. 114, 4886-4896 (2009).</li><li>Curtis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+microstructural+templating+in+fibrin-thrombin+gel+networks+by+spectral+and+viscoelastic+analysis.">A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis.</a> Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).</li><li>Kim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+fibrin+network+structure+and+mechanical+properties:+an+experimental+and+computational+analysis.">Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis.</a> Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).</li><li>Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+cell+disease+activates+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+induce+cathepsins+k+and+v+activity+in+endothelial+cells.">Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells.</a> Anemia. 2012, 201781 (2012).</li><li>Allison, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+sickle-cell+haemoglobin.">Properties of sickle-cell haemoglobin.</a> Biochemical Journal. 65, 212 (1957).</li><li>Kuehl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , (2000).</li><li>Lindman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis of variance in experimental designs. , (1992).</li><li>Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastable+Mesoscopic+Clusters+in+Solutions+of+Sickle-Cell+Hemoglobin.">Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin.</a> Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).</li><li>Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+and+theoretical+study+on+the+dissolution+of+mural+fibrin+clots+by+tissue-type+plasminogen+activator.">An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator.</a> Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).</li><li>Sazonova, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=127+Mathematic+model+of+fibrin+clot+lysis+by+plasmin.">127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin.</a> Fibrinolysis and Proteolysis. 12, 45 (1998).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כדי לקבל נתונים משמעותיים על המבנה של מנגנוני קרישה במצבי מחלה, חשוב לבודד את הגורמים מעורבים בקרישה כדי לקבוע את ההשפעות של החלבונים ותאים בתנאים אלה. פרוטוקול זה פותח לצורך חקירת המבנה של קריש הפיברין במדינות סוכרת וSCD במבחנה. <p class="jove_content" style=";text-align:right;directio...

פגיעה ברירית האנדותל של כלי דם לתיקון דרך התגובה לעצרת הדם, או היווצרות של קריש דם. כאשר דם מחלחל לתוך מטריצת החוץ תאית, גורמי רקמה להפעיל טסיות דם בזרם הדם המאפשרים חניכה של מפל הקרישה. המרכיב המכני המפתח של תהליך ריפוי זה הוא מטריצת הפיברין, מורכבת מסיבי הפיברין שאלסטיות גבוהה, ויכול לקיים כוחות גדולים 1-4. חוקרים רבים חקרו את מבנה המערך, ותפקוד של הפיברין בהרחבה בעשורים האחרונים 5-13. יש חולים במחלות כגון סוכרת וחרמשית סיכון מוגבר לפתח סיבוכים טרומבוטיים כגון אוטם שריר לב, מחלת לב איסכמית, ומלטף 14-19. מעל 2 מיליון אנשים שאובחנו לאחרונה עם סוכרת בכל שנה בארצות הברית. ישנם שני סוגים של סוכרת: הסוג I, שבוגוף לא מצליח לייצר כמות מספקת של אינסולין, וסוג השני, שבו הגוף הופך עמיד לאינסולין. בקרב חולי סוכרת, מחלות לב וכלי דם (CVD) היא הסיבה ל- 80% מהתחלואה והתמותה הקשורים במחלה 20,21. מחלה מגל תא (SCD) היא הפרעה גנטית המשפיעה על דם יותר מ -100,000 אנשים בארצות הברית 22. SCD הוא מחלה נקודה-מוטציה שגורמת לתאי דם אדומים להפוך בצורה חצי סהר, מה שהקשה על התאים לעבור בכלי דם הדם 23. שתי מדינות מחלה אלה מגבירים את הסיכוי לפתח תנאי atherothrombotic בגוף. אחת הסיבות לכך היא תוצאה של מבנה הפיברין שינה ותפקוד במצבים חולים 14,24-26. בשתי הסוכרת ומחלות חרמשית, יש hypercoagulation ופעילות hypofibrinolysis שגורמת atherothrombosis ומחלות לב וכלי דם (CVD), בהשוואה למטופלים בריאים 17,27,28. זה ידוע שhypofibrinolysis מקדם התקדמות טרשת עורקים ומולידה אירועים איסכמיים חוזרים בחולים עם מחלת לב כלילית מוקדמת 29. בכתב היד הנוכחית, החוקרים בחנו את התפקיד של תכונות פיזיות הפיברין בהגדרה המסוימת הזה. מבני קריש הפיברין בחולים שאינם חולים מורכבים מסיבים דקים, נקבוביות גדול, ו14,24 בדרך כלל פחות צפופים. הנקבוביות המוגברת וקרישי פיברין פחות צפופים בנבדקים בריאים נמצאו כדי להקל על פירוק פיברין 16. בתנאי hyperthrombotic כגון מחלת סוכרת תא ומגל, יש עלייה בייצור פיברינוגן, גורמת לריכוז פיברינוגן להגדיל מהרמות נורמליות של 2.5 מ&quot;ג / מיליליטר בחולים בריאים 30-33. קרישי פיברין נוצרו בחולי סוכרת נמצאו להיות פחות נקבובי, נוקשה יותר, יש יותר נקודות סניף, וצפוף יותר בהשוואה למי שאינו dia הבריא,חולי betic 14,24,33-35. מבנה הפיברין שינה הוא תוצאה של מנגנוני glycation המתרחשים בחלבונים מעורבים בהיווצרות קריש דם. glycation Nonenzymatic (בלתי הפיך) מתרחש כאשר מולקולות גלוקוז להיקשר לשאריות ליזין על מולקולת פיברינוגן, אשר מעכבת XIIIa האנושי גורם (FXIIIa) משאריות גלוטמין וליזין cross-linking כראוי 33,36,37. הניתוח המבני של רשתות הפיברין נחקר בהרחבה לאחרונה. בפרט, חוקרים נצלו את מיקרוסקופ אלקטרונים ושחזור 3D של רשתות הפיברין 38, חקרו כיצד תאים שני תאי intravascular (אנדותל) וextravascular (fibroblasts ושריר חלק) משפיעים על מבנה הפיברין 39, viscoelastic מנוצלת וניתוח ספקטרלי לנתח מבני הפיברין 40, ו מתאמים מפותחים בין מבנה ליפין ותכונות מכאניות באמצעות ניסוי וחישובי גישות 41 </sup&gt;. המוקד של המחקר הנוכחי היה לגבש מבני קריש בתנאים פקקת תא סוכרת ומגל מדומים ולהשתמש במיקרוסקופ confocal לבחינת המבנה ותפקוד של קרישים במדינות נגועות. קרישי פיברין נוצרו מפיברינוגן האנושי, תרומבין האנושי, וFXIIIa. קרישים היו lysed באמצעות פלסמין. כדי לדמות תנאים סוכרתיים, ריכוז מוגבר של פיברינוגן הודגרה בפתרון גלוקוז כדי לגרום במבחנת glycation פיברינוגן. כדי לדמות תנאי קרישת מחלה חרמשית, ריכוזי פיברינוגן מוגברים היו מעורבים עם המטוקריט חרמשית שנאסף מחולים כפי שנעשה בעבר על ידי הקבוצה שלנו 42. שיטות אלה שמשו לבדיקת המבנה והפונקציות מעורבות בהיווצרות קריש הפיברין ופירוק פיברין בתנאים חולים, כמו גם את המנגנונים שגורמים לCVD. בהתבסס על מידע נוכחי על מחלות אלו, מבני קריש הפיברין Glycated היו צפופים יותר עם פחותnd נקבוביות קטן יותר. קרישי פיברין עם תאי דם אדומים של חולי אנמיה חרמשית (RBCs) היו גם צפופים ומוצגים אגרגציה של תאי הדם האדומים ואשכולות הפיברין מגובבים. זוהי תופעה מבוססת היטב כי כבר נקבעה בעבר 43. כמו כן, החוקרים שיערו כי שיעור הפירוק פיברין יהיה נמוך באופן משמעותי בקרישי פיברין Glycated עם ובלי פלסמין המופחת בהשוואה ליפין בריא, נורמלי. התוצאות הראו כי לקרישי פיברין Glycated, תוצאות שיעור תמוגה שונות באופן משמעותי נצפו רק בתנאים של ריכוז פלסמין מופחת. טכניקה ניסויית זו של שימוש במיקרוסקופ confocal מציעה יתרונות משמעותיים על פני שיטות הדמיה אחרות, כי התאים והחלבונים להישאר במדינה האם שלהם, המאפשרת הלכידה וידאו של פעילות הקרישה בזמן אמת. שיטה זו של קרישה סינטטי התרמה היא גם זולה יותר ויעילה יותר זמן מאשר קבלת דגימות מטופל וסינון בודדחלבונים ואנזימים. יתר על כן, על ידי שימוש בחלבונים ואנזימים מופרדים לסנתז קרישים, קרישים היו סטנדרטיים, כך שלא היה שונות בין דגימות כתוצאה מחלבונים אחרים בפלזמה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="887">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:287px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">PBS</td>
			<td style="width:287px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide)</td>
			<td style="width:287px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">45-001-749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml heparinized vacutainer tubes</td>
			<td style="width:287px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Human Fibrinogen</td>
			<td style="width:287px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate</td>
			<td style="width:287px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">F13191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 mL graduated microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:287px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Glucose powder</td>
			<td style="width:287px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15023-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">FXIIIa</td>
			<td style="width:287px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VIS Confocal Microscope</td>
			<td style="width:287px;">Zeiss LSM 510</td>
			<td style="width:119px;">LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">50 mM Tris</td>
			<td style="width:287px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">S50-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:315px;">Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">449709-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vybrant DiD cell-labeling solution</td>
			<td style="width:287px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L7781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Plasmin</td>
			<td style="width:287px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium Chloride (5 M NaCl)</td>
			<td style="width:287px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Statistical Modeling Software</td>
			<td>IBM</td>
			<td style="width:119px;">SPSS Statistics 22</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental and imaging techniques for examining fibrin clot structures in normal and diseased states

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.

Confocal ניתוח מיקרוסקופית של מבני קריש פיברין Glycated תמונות מיקרוסקופיה confocal של קרישים נורמלים וGlycated מוצגות באיור 3. ניתוח מיקרוסקופיה Confocal של קרישים נורמלים וGlycated מגלה כי קרישי Glycated הם צפופים עם נקבוביות קטנות יותר מהקרישי...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States at JoVE.com

Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States

In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.

טכניקות ניסיוניות והדמיה לבחינת מבני פיברין קריש בבריאה והחולה הברית

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on ...

experimental-imaging-techniques-for-examining-fibrin-clot-structures

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Medicine

Unit 1

Cardiovascular Drugs: Anticoagulants and Antianginal Agents

SCIENTISTS IN ACTION

11.3K Views.  Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine. In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.

Video: Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit's Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular cartilage and subchondral bone in recent years led to increased attention to restoration of the entire osteochondral unit. In comparison to chondral lesions the regeneration of osteochondral defects is much more complex and a far greater surgical and therapeutic challenge. The damaged tissue does not only include the superficial cartilage layer but also the subchondral bone. For deep, osteochondral damage, as it occurs for example with osteochondrosis dissecans, the full thickness of the defect needs to be replaced to restore the joint surface 1. Eligible therapeutic procedures have to consider these two different tissues with their different intrinsic healing potential 2. In the last decades, several surgical treatment options have emerged and have already been clinically established 3-6.
Autologous or allogeneic osteochondral transplants consist of articular cartilage and subchondral bone and allow the replacement of the entire osteochondral unit. The defects are filled with cylindrical osteochondral grafts that aim to provide a congruent hyaline cartilage covered surface 3,7,8. Disadvantages are the limited amount of available grafts, donor site morbidity (for autologous transplants) and the incongruence of the surface; thereby the application of this method is especially limited for large defects.
New approaches in the field of tissue engineering opened up promising possibilities for regenerative osteochondral therapy. The implantation of autologous chondrocytes marked the first cell based biological approach for the treatment of full-thickness cartilage lesions and is now worldwide established with good clinical results even 10 to 20 years after implantation 9,10. However, to date, this technique is not suitable for the treatment of all types of lesions such as deep defects involving the subchondral bone 11.
The sandwich-technique combines bone grafting with current approaches in Tissue Engineering 5,6. This combination seems to be able to overcome the limitations seen in osteochondral grafts alone. After autologous bone grafting to the subchondral defect area, a membrane seeded with autologous chondrocytes is sutured above and facilitates to match the topology of the graft with the injured site. Of course, the previous bone reconstruction needs additional surgical time and often even an additional surgery. Moreover, to date, long-term data is missing 12.
Tissue Engineering without additional bone grafting aims to restore the complex structure and properties of native articular cartilage by chondrogenic and osteogenic potential of the transplanted cells. However, again, it is usually only the cartilage tissue that is more or less regenerated. Additional osteochondral damage needs a specific further treatment. In order to achieve a regeneration of the multilayered structure of osteochondral defects, three-dimensional tissue engineered products seeded with autologous/allogeneic cells might provide a good regeneration capacity 11.
Beside autologous chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) seem to be an attractive alternative for the development of a full-thickness cartilage tissue. In numerous preclinical in vitro and in vivo studies, mesenchymal stem cells have displayed excellent tissue regeneration potential 13,14. The important advantage of mesenchymal stem cells especially for the treatment of osteochondral defects is that they have the capacity to differentiate in osteocytes as well as chondrocytes. Therefore, they potentially allow a multilayered regeneration of the defect.
In recent years, several scaffolds with osteochondral regenerative potential have therefore been developed and evaluated with promising preliminary results 1,15-18. Furthermore, fibrin glue as a cell carrier became one of the preferred techniques in experimental cartilage repair and has already successfully been used in several animal studies 19-21 and even first human trials 22.
The following protocol will demonstrate an experimental technique for isolating mesenchymal stem cells from a rabbit's bone marrow, for subsequent proliferation in cell culture and for preparing a standardized in vitro-model for fibrin-cell-clots. Finally, a technique for the implantation of pre-established fibrin-cell-clots into artificial osteochondral defects of the rabbit's knee joint will be described.

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit&#039;s Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

An experimental technique for the treatment of osteochondral defects in the rabbit's knee joint is described. The implantation of allogeneic mesenchymal stem cells into osteochondral defects provides a promising development in the field of tissue engineering. The preparation of fibrin-cell-clots in vitro offers a standardized method for implantation.

טיפול במומי Osteochondral במפרק הברך של הארנב על ידי השתלה של תאי גזע mesenchymal אלוגנאית בקרישי הפיברין

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

רומן ברזולוציה גבוהה<em&gt; בvivo</em&gt; טכניקת הדמיה כדי לחקור את התגובה דינמית של מבנים תוך גולגולתי לצמיחה גידול וTherapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as multiple sclerosis. Here we present a low-cost and reproducible glass window implantation protocol that is suitable for intravital microscopy and studying the dynamics of spinal cord cytoarchitecture with subcellular resolution in live adult mice with EAE. Briefly, we surgically expose the vertebrae T12-L2 and construct a chamber around the exposed vertebrae using a combination of cyanoacrylate and dental cement. A laminectomy is performed from T13 to L1, and a thin layer of transparent silicone elastomer is applied to the dorsal surface of the exposed spinal cord. A modified glass cover slip is implanted over the exposed spinal cord taking care that the glass does not directly contact the spinal cord. To reduce the infiltration of inflammatory cells between the window and spinal cord, anti-inflammatory treatment is administered every 2 days (as recommended by ethics committee) for the first 10 days after implantation. EAE is induced only 2-3 weeks after the cessation of anti-inflammatory treatment.
Using this approach we successfully induced EAE in 87% of animals with implanted windows and, using Thy1-CFP-23 mice (blue axons in dorsal spinal cord), quantified axonal loss throughout EAE progression. Taken together, this protocol may be useful for studying the recruitment of various cell populations as well as their interaction dynamics, with subcellular resolution and for extended periods of time. This intravital imaging modality represents a valuable tool for developing therapeutic strategies to treat autoimmune demyelinating diseases such as EAE.

We describe a method for implanting and maintaining glass windows over the exposed spinal cords of adult mice for studying experimental autoimmune encephalomyelitis. These windows provide chronic optical access to the spinal cord for monitoring cell dynamics at the subcellular level in live animals using two-photon microscopy.

השתלת זכוכית חוט השדרה של Windows בעכברים בוגרים עם ניסיון אוטואימוניות Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

A Pipeline for 3D Multimodality Image Integration and Computer-assisted Planning in Epilepsy Surgery

Epilepsy surgery is challenging and the use of 3D multimodality image integration (3DMMI) to aid presurgical planning is well-established. Multimodality image integration can be technically demanding, and is underutilised in clinical practice. We have developed a single software platform for image integration, 3D visualization and surgical planning. Here, our pipeline is described in step-by-step fashion, starting with image acquisition, proceeding through image co-registration, manual segmentation, brain and vessel extraction, 3D visualization and manual planning of stereoEEG (SEEG) implantations. With dissemination of the software this pipeline can be reproduced in other centres, allowing other groups to benefit from 3DMMI. We also describe the use of an automated, multi-trajectory planner to generate stereoEEG implantation plans. Preliminary studies suggest this is a rapid, safe and efficacious adjunct for planning SEEG implantations. Finally, a simple solution for the export of plans and models to commercial neuronavigation systems for implementation of plans in the operating theater is described. This software is a valuable tool that can support clinical decision making throughout the epilepsy surgery pathway.

We describe the steps to use our custom designed software for image integration, visualization and planning in epilepsy surgery.

צינור אינטגרצית תמונת 3D Multimodality ותכנון בסיוע מחשב בכירורגיה אפילפסיה

Epilepsy surgery is challenging and the use of 3D multimodality image integration (3DMMI) to aid presurgical planning is well-established. Multimodality ...

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the silicone compound, via a 26 G catheter, into the portal or hepatic vein. After silicone injection, organs were explanted and prepared for ex-vivo micro-CT (&#181;CT) scanning. The silicone injection procedure is technically challenging. Achieving a successful outcome requires extensive microsurgical experience from the surgeon. One of the challenges of this procedure involves determining the adequate perfusion rate for the silicone compound. The perfusion rate for the silicone compound needs to be defined based on the hemodynamic of the vascular system of interest. Inappropriate perfusion rate can lead to an incomplete perfusion, artificial dilation and rupturing of vascular trees.
The 3D reconstruction of the vascular system was based on CT scans and was achieved using preclinical software such as HepaVision. The quality of the reconstructed vascular tree was directly related to the quality of silicone perfusion. Subsequently computed vascular parameters indicative of vascular growth, such as total vascular volume, were calculated based on the vascular reconstructions. Contrasting the vascular tree with silicone allowed for subsequent histological work-up of the specimen after &#181;CT scanning. The specimen can be subjected to serial sectioning, histological analysis and whole slide scanning, and thereafter to 3D reconstruction of the vascular trees based on histological images. This is the prerequisite for the detection of molecular events and their distribution with respect to the vascular tree. This modified silicone injection procedure can also be used to visualize and reconstruct the vascular systems of other organs. This technique has the potential to be extensively applied to studies concerning vascular anatomy and growth in various animal and disease models.

Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using &#181;CT and histological serial sections.

ויזואליזציה של התחדשות כלי דם Parenchymal לאחר 70% חלקיות כריתה בעכברים נורמליים

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

An Intramedullary Locking Nail for Standardized Fixation of Femur Osteotomies to Analyze Normal and Defective Bone Healing in Mice

Bone healing models are essential to the development of new therapeutic strategies for clinical fracture treatment. Furthermore, mouse models are becoming more commonly used in trauma research. They offer a large number of mutant strains and antibodies for the analysis of the molecular mechanisms behind the highly differentiated process of bone healing. To control the biomechanical environment, standardized and well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory in mice. Here, we report on the design and use of an intramedullary nail to stabilize open femur osteotomies in mice. The nail, made of medical-grade stainless steel, provides high axial and rotational stiffness. The implant further allows the creation of defined, constant osteotomy gap sizes from 0.00 mm to 2.00 mm. Intramedullary locking nail stabilization of femur osteotomies with gap sizes of 0.00 mm and 0.25 mm result in adequate bone healing through endochondral and intramembranous ossification. Stabilization of femur osteotomies with a gap size of 2.00 mm results in atrophic non-union. Thus, the intramedullary locking nail can be used in healing and non-healing models. A further advantage of the use of the nail compared to other open bone healing models is the possibility to adequately fix bone substitutes and scaffolds in order to study the process of osseous integration. A disadvantage of the use of the intramedullary nail is the more invasive surgical procedure, inherent to all open procedures compared to closed models. A further disadvantage may be the induction of some damage to the intramedullary cavity, inherent to all intramedullary stabilization techniques compared to extramedullary stabilization procedures.

This protocol describes an osteosynthesis technique using an intramedullary locking nail for standardized fixation of femur osteotomies, which can be used to analyze normal and defective bone healing in mice.

מסמר נעילת intramedullary עבור קיבוע סטנדרטי של Osteotomies עצם הירך כדי לנתח רגיל ופגום עצם ריפוי עכברים

Bone healing models are essential to the development of new therapeutic strategies for clinical fracture treatment. Furthermore, mouse models are becoming ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of cerebral malaria can be difficult. We present an experimental mouse model of cerebral malaria that shares multiple features of the human disease, including edema and microvascular pathology. Using magnetic resonance imaging (MRI), we can detect and track the blood-brain barrier disruption, edema development, and subsequent brain swelling. We describe multiple MRI techniques that can visualize these pertinent pathological changes. Thus, we show that MRI represents a valuable tool to visualize and track pathological changes, such as edema, brain swelling, and microvascular pathology, in vivo.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

We describe a mouse model of experimental cerebral malaria and show how inflammatory and microvascular pathology can be tracked in vivo using magnetic resonance imaging.

בשנת מעקב Vivo של בצקת פיתוח ופתולוגיה מיקרוסקולרית במודל של מלריה מוחית ניסיוני באמצעות תהודה מגנטית הדמיה

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

ויזואליזציה כמותית של ליקוציטים לחדור במודל Murine של שריר הלב הדוקרני על ידי מיקרוסקופית גיליון אור

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this patient group but has yet to be confirmed. This protocol describes a method of in vivo evaluation of neural changes especially well suitable for cranial nerve analysis using magnetic resonance imaging (MRI). MD-patients and normal hearing persons were examined in a 3-T MR-scanner using a scan protocol including strongly T2-weighted 3D gradient-echo-sequence (3D-CISS). In the patient group, MD was additionally confirmed using MRI-based assessment of endolymphatic hydrops. Morphometric analysis was performed using a freeware DICOM viewer. Evaluation of cranial nerves included measurements of cross-sectional areas (CSAs) of the nerves at different levels as well as orthogonal diametric measurements.

&lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&amp;#232;re&#039;s Disease Ears and Normal Hearing Ears

To evaluate morphological changes of cranial nerves such as loss of neural structures or swelling of cranial nerves in Meni&#232;re&#39;s Disease (MD) or in healthy persons in vivo, a protocol of evaluation has been developed using magnetic resonance imaging (MRI). Additional MRI-based confirmation of MD was performed.

אין ויוו ניתוח Morphometric של עצבי האנושי באמצעות תהודה מגנטית של Menière מחלת האוזניים ואת האוזניים שמיעה רגילה

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Cardiac Magnetic Resonance for the Evaluation of Suspected Cardiac Thrombus: Conventional and Emerging Techniques

We present the conventional cardiac magnetic resonance (CMR) protocol for evaluating a suspected thrombus and highlight emerging techniques.&#160;The appearance of a mass on certain magnetic resonance (MR) sequences can help differentiate a thrombus from competing diagnoses such as a tumor. T1 and T2 signal characteristics of a thrombus are related to the evolution of hemoglobin properties. A thrombus typically does not enhance following contrast administration, which also helps differentiation from a tumor. We also highlight the emerging role of T1 mapping in the evaluation of a thrombus, which can add another level of support in diagnosis. Prior to any CMR exam, patient screening and interviews are critical to ensure safety and to optimize patient comfort. Effective communication during the exam between the technologist and the patient promotes proper breath holding technique and higher quality images. Volumetric post processing and structured reporting are helpful to ensure that the radiologist answers the ordering services&#39; question and communicates these results effectively. Optimal pre-MR safety evaluation, CMR exam execution, and post exam processing and reporting allow for delivery of high quality radiological service in the evaluation of a suspected cardiac thrombus.

The goal of this article is to describe how cardiac magnetic resonance can be used for the evaluation and diagnosis of a suspected cardiac thrombus. The method presented will describe data acquisition as well as the pre-procedure and post-procedure protocol.

תהודה מגנטית קרדיולוגית להערכת החשוד בתרובוס הלב: טכניקות קונבנציונליות והמתעוררים

We present the conventional cardiac magnetic resonance (CMR) protocol for evaluating a suspected thrombus and highlight emerging techniques.&#160;The ...