The authors would like to thank the Lam Lab at Georgia Tech for many helpful discussions in developing the experimental assays. Research reported in this publication was supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number K01HL115486 and by New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 from the Office of the Director, National Institutes of Health. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

REMARQUE: Le protocole suivant est conforme aux orientations fixées par le Conseil d&#39;examen institutionnel (IRB) à Georgia Tech. 1. Collecte de sang et de globules rouges Isolation procédure <ol><li> Recueillir 40 à 120 ml de sang provenant de donneurs dans 10 ml tubes Vacutainer héparinisés. Lancer PBMC (cellules mononucléées du sang périphérique) isolement au sein de quatre heures de la collecte. Pendant ce temps, maintenir le sang à température ambiante. REMARQUE: O / N stockage du sang en RT ou 4 ° C ne est pas recommandé car cela se traduira par un rendement plus faible CMSP. </li><li> Diluer sang total 1: 1 dans de la glace-froid (4 ° C) PBS stérile. </li><li> Pipette 10 ml de glace-froid polysaccharide hydrophile en un, 50 ml tube conique stérile vide. Transférer doucement sang total dilué sur le dessus du polysaccharide hydrophile. </li><li> Utiliser une pipette de 25 ml dans le sang et à prise lente de la pipette le long du côté du tube très lentement. Assurez-vous que le sang ne est pas mélangé avec le saccharide avant Centrifugation parce que le polysaccharide hydrophile est toxique pour les cellules et les autres, le rendement PBMC sera plus faible. </li><li> Centrifuger des échantillons de sang pour 30 min à 400 g à 4 ° C. Le cas échéant, réduire la vitesse de frein de la centrifugeuse à la moitié du maximum pour une meilleure séparation après centrifugation. </li><li> Aspirer la fraction plasma / plaquettes de l&#39;échantillon de sang centrifugé. Aspirer soigneusement la couche de polysaccharide hydrophile directement au-dessus de la couche de RBC emballé. </li><li> Recueillir 8-10 ml de globules rouges emballés et diluer 1: 1 avec 0,9% de NaCl non stérile saline. </li></ol> 2. confocale Microscopie évaluation de glyquée Structures Clot (simulées diabétiques caillots) <ol><li> Dégivrage fibrinogène humain marqué par fluorescence et de fibrinogène humain conjugué à 37 ° C. </li><li> Pipetter le suivant dans un 0,5 ml tube gradué à centrifuger. <ol><li> Pour les caillots de fibrinogène, normaux en bonne santé, mélanger fibrinogène humain avec 10% marqué par fluorescence fibrinogène humainconjugué dans un tampon Tris 50 mM / NaCl 100 mM à une concentration de 5 mg / ml. </li><li> Pour fibrinogène glyquée artificiellement (pour simuler les caillots diabétiques), incuber fibrinogène humain et de 10% de fibrinogène marqué par fluorescence conjugué dans une solution à 5 mM de glucose dissous dans Tris / NaCl 100 mM 50 pour une concentration résultante de 6,8 mg / ml. </li></ol></li><li> Couvrir les tubes micro-centrifugeuse en utilisant un matériau opaque pour éviter l&#39;exposition à la lumière. Incuber les tubes dans un bain d&#39;eau à 37 ° pendant 48 heures. </li><li> Faites une chambre sur une lame de microscope en verre par l&#39;apposition d&#39;une mince adhésif sur 2 côtés de la lame. </li><li> Après la période d&#39;incubation de 48 heures, préparer des réactifs pour la formation de fibrine par la thrombine et la décongélation FXIIIa alpha humain à TA. </li><li> Diluer FXIIIa à 80 U / ml dans un tampon 5 mM de CaCl 2. </li><li> Diluer la thrombine à 4 U / ml dans un tampon 5 mM de CaCl 2. <ol><li> Pour caillots normaux, se assurer que les concentrations finales de fibrinogène, FXIIIa, et la thrombine sont de 2,5 mg / ml, 20 U / ml et 1 U / ml, respectivement à un volume de 50 ul. </li><li> Pour les caillots glyquées, en sorte que les concentrations finales de fibrinogène, FXIIIa, et la thrombine sont 3,4 mg / ml, 20 U / ml, et 1 U / ml, respectivement à un volume de 50 ul. </li></ol></li><li> Immédiatement pipette 30 ul de la solution de fibrine dans la chambre formée par l&#39;adhésif. </li><li> Placez un 22 mm x 22 mm lamelle de verre d&#39;une épaisseur de 0,15 mm sur le dessus des deux couches d&#39;adhésif. Sceller les côtés ouverts avec adhésif transparent pour empêcher le caillot de fibrine de se dessécher. Se assurer que l&#39;adhésif ne interagit pas avec le caillot de fibrine. </li><li> Autoriser les caillots de fibrine polymériser à 21-23 ° C pendant 2 heures avant l&#39;imagerie confocale. </li><li> Prendre des images de microscopie confocale des caillots utilisant un microscope confocal avec un objectif 40X / 1,30 huile M27 avec un laser à argon 488 nm. </li></ol> 3. microscopie confocale évaluation des caillots de fibrine contenant des hématies de patients Sickle Cell <ol><li> Dégivrage fibrinogène humain marqué par fluorescence et de fibrinogène humain conjugué à 37 ° C. </li><li> Pipetter le suivant dans un 0,5 ml tube gradué à centrifuger. <ol><li> Pour la bonne santé, un caillot de fibrine normale, mélanger le fibrinogène humain avec 10% de conjugué marqué par fluorescence du fibrinogène humain dans un tampon Tris 50 mM / NaCl 100 mM à une concentration de 5 mg / ml. </li><li> Pour les caillots contenant des globules rouges SCD, mélanger le fibrinogène humain et de 10% de conjugué marqué par fluorescence du fibrinogène humain dans un tampon Tris 50 mM / NaCl 100 mM de sorte que la concentration résultante du fibrinogène est de 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Étiqueter les globules rouges isolés (à la fois normales et ceux provenant de patients drépanocytaires obtenues à partir du protocole d&#39;isolement RBC) en utilisant une solution cellulaire étiquetage. <ol><li> Suspendre les cellules à une densité de 1 x 10 6 par ml dans un milieu de culture sans sérum choisi. </li><li> Ajouter 5 ul / ml de la suspension cellulaire à la solution de cellules étiquetage. Mélangez bien par pipetage doux doucement. </li><li&gt; incuber pendant 20 min à 37 ° C. </li><li> Centrifuger les tubes de suspension marqués à 1500 rpm pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Retirer délicatement le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 37 ° C moyenne. </li><li> Répétez la procédure de lavage (3.3.4 et 3.3.5) deux fois de plus. </li></ol></li><li> Diluer FXIIIa à 80 U / ml dans un tampon 5 mM de CaCl 2. </li><li> Diluer la thrombine à 4 U / ml dans un tampon 5 mM de CaCl 2. <ol><li> Pour caillots normaux, en sorte que les concentrations finales de fibrinogène, FXIIIa, et la thrombine sont de 2,5 mg / ml, 20 U / ml, et 1 U / ml, respectivement à un volume de 50 ul. </li><li> Pour les caillots contenant SCD globules rouges, en sorte que les concentrations finales de fibrinogène, FXIIIa, et la thrombine sont de 5 mg / ml, 20 U / ml, et 1 U / ml, respectivement à un volume de 50 ul. </li></ol></li><li> Introduire à la pipette 10 ul des globules rouges marqués dans la solution de fibrine. Pipette 30 ul de la fibrine avec des hématies sur le verre de microscope (voir glisser préparation glycated caillots). </li><li> Laisser la fibrine polymériser à 21-23 ° C pendant 2 heures avant l&#39;imagerie confocale. </li><li> Prenez images confocales des caillots à l&#39;aide du microscope confocal, et d&#39;utiliser des lasers d&#39;excitation avec des longueurs d&#39;onde de 488 nm et 633 nm pour exciter la fibrine marqué par fluorescence et de globules rouges. </li></ol> 4. microscopie confocale évaluation de la fibrinolyse Tarifs en glyquée Structures Clot <ol><li> Répétez le protocole de microscopie confocale de caillots glyquée (Protocole Step 2) pour l&#39;évaluation du taux de la fibrinolyse dans caillots glyquée. </li><li> Ne pas fermer les extrémités de la chambre avec un adhésif clair. Laisser les caillots de fibrine à polymériser pendant 1,5 heures à 21-23 ° C dans une enceinte étanche contenant 250 ml d&#39;eau pour éviter la déshydratation. </li><li> Après polymérisation, d&#39;obtenir des images des caillots à l&#39;aide du microscope confocal. </li><li> Pipette plasmine dans l&#39;extrémité ouverte de la chambre et disperser la plasmine par l&#39;intermédiaire du caillot par action capillaire. <ol><li> Pourles expériences de la fibrinolyse normales et avec des concentrations normales glyquées, pipette 25 ul à 200 pg / ml de plasmine dans l&#39;ouverture de la chambre. </li><li> Pour les caillots glyquées, avec des concentrations réduites pipette 25 ul à 50 ug / ml dans l&#39;ouverture de la chambre. </li></ol></li><li> Utilisez la fonction de séries chronologiques (voir la figure 1) dans le logiciel de microscope confocal à capturer en temps réel des séquences vidéo de la plasmine lyse du caillot. <ol><li> Cliquez sur le mode d&#39;acquisition, puis sélectionnez «Time Series&quot;. Sélectionnez le nombre de cycles et l&#39;intervalle de temps d&#39;enregistrement. </li></ol></li></ol> 5. Calcul de la fibrinolyse Tarifs <ol><li> Déterminer le taux de lyse en définissant un espace (2500 um 2) et en calculant le temps écoulé nécessaire pour dissoudre une zone fixe du caillot. Calculer le taux de lyse à l&#39;aide de l&#39;équation suivante (figure 2): <img alt="Equation 1" fo:content-width="2in" src = &quot;/ files / ftp_upload / 52019 / 52019eq1.jpg&quot; /&gt; </li></ol> 6. Analyse statistique de la fibrinolyse Tarifs <ol><li> Analyser les données de lyse en utilisant un logiciel d&#39;analyse statistique. Effectuer une analyse de variance à une voie et un post hoc de Tukey-Kramer 44,45 essai. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Pour obtenir des données significatives sur la structure des mécanismes de coagulation dans des états pathologiques, il est important d&#39;isoler les facteurs impliqués dans la coagulation pour déterminer les effets des protéines et des cellules dans ces conditions. Ce protocole a été développé pour les fins de l&#39;enquête sur la structure du caillot de fibrine dans les états diabétiques et SCD in vitro. Il est nécessaire de comprendre les mécanismes impliqués dan...

Des traumatismes de la paroi endothéliale d&#39;un vaisseau sanguin est réparé par la réponse hémostatique, ou la formation d&#39;un caillot de sang. Lorsque le sang pénètre dans la matrice extracellulaire, les facteurs tissulaires activer les plaquettes dans le flux de sang qui facilitent l&#39;initiation de la cascade de coagulation. L&#39;élément mécanique essentiel de ce processus de guérison est la matrice de fibrine, composé de fibres de fibrine qui sont hautement élastique, et peut supporter des forces importantes 1-4. De nombreux chercheurs ont étudié la structure de la formation, et la fonction de la fibrine abondamment dans les dernières décennies 5-13. Les patients atteints de maladies telles que le diabète sucré et la drépanocytose ont un risque accru de développer des complications thrombotiques telles que l&#39;infarctus du myocarde, la cardiopathie ischémique, les accidents vasculaires cérébraux et 14-19. Plus de 2 millions de personnes sont nouvellement diagnostiquées avec le diabète sucré chaque année aux États-Unis. Il existe deux types de diabète: type I, où lecorps ne parvient pas à produire des quantités adéquates d&#39;insuline, et Type II, où le corps devient résistant à l&#39;insuline. Chez les patients diabétiques, les maladies cardiovasculaires (CVD) est la cause de 80% de la morbidité et de la mortalité associée à la maladie 20,21. La drépanocytose (SCD) est une maladie génétique du sang qui touche plus de 100 000 personnes aux États-Unis 22. SCD est une maladie point mutation qui provoque des globules rouges à devenir en forme de croissant, ce qui rend difficile pour les cellules de passer à travers le système vasculaire sanguin 23. Ces deux états pathologiques augmenter les chances de développer des maladies athérothrombotiques dans le corps. Une des raisons à cela est le résultat de la structure de fibrine modifié et la fonction dans les Etats malades 14,24-26. Dans les deux diabète et la drépanocytose, il est hypercoagulation et l&#39;activité de hypofibrinolyse qui induit l&#39;athérothrombose et les maladies cardiovasculaires (CVD) par rapport à des patients sains 17,27,28. Il est connu que hypofibrinolyse favorise la progression de l&#39;athérosclérose et engendre des événements ischémiques récurrents pour les patients atteints de maladie coronarienne prématurée 29. Dans le manuscrit en cours, nous avons étudié le rôle des propriétés physiques fibrine dans ce contexte particulier. Structures de caillot de fibrine chez les patients non malades sont composés de fibres fines et des pores plus grands, et généralement moins dense 14,24. La porosité accrue et des caillots de fibrine moins denses chez les patients en bonne santé ont été trouvées 16 pour faciliter la fibrinolyse. Dans des conditions hyperthrombotic telles que la maladie diabétique et la faucille cellule, il existe une augmentation de la production de fibrinogène, ce qui provoque la concentration de fibrinogène à augmenter à partir de niveaux normaux de 2,5 mg / ml dans 30 à 33 patients en bonne santé. Les caillots de fibrine formés chez les patients diabétiques se sont révélés être moins poreux, plus rigide, plus de points de ramification, et plus dense en comparaison avec sain, non-diapatients Bétique 14,24,33-35. La structure de fibrine modifiée est le résultat de mécanismes de glycation qui se produisent dans les protéines impliquées dans la formation du caillot. Non enzymatique (irréversible) glycation se produit lorsque les molécules de glucose se lient à des résidus de lysine sur la molécule de fibrinogène, qui inhibe le facteur XIIIa humaine (FXIIIa) à partir de résidus lysine et glutamine correctement reticulation 33,36,37. L&#39;analyse structurale des réseaux de fibrine a été largement étudié ces derniers temps. En particulier, les chercheurs ont utilisé la microscopie électronique et reconstruction 3D de réseaux de fibrine 38, a étudié comment les deux (endotheliales) Les piles et extravasculaires (fibroblastes et de muscle lisse) intravasculaires cellules influent sur ​​la structure de fibrine 39, viscoélastique utilisé et l&#39;analyse spectrale à analyser les structures de fibrine 40, et corrélations développés entre la structure de fibrine et les propriétés mécaniques utilisant des approches expérimentales et informatiques 41 </sup&gt;. L&#39;objectif de l&#39;étude était de formuler des structures de caillot dans des conditions de thrombose cellulaire diabétique et la faucille simulées et d&#39;utiliser la microscopie confocale pour l&#39;examen de la structure et la fonction des caillots dans les États malades. Les caillots de fibrine ont été formés à partir de fibrinogène humain, de la thrombine humaine, et FXIIIa. Les caillots ont été lysées à l&#39;aide de plasmine. Pour simuler les conditions diabétiques, augmentation de la concentration de fibrinogène a été incubé dans une solution de glucose pour induire in vitro fibrinogène glycation. Pour simuler les conditions de coagulation drépanocytaires, une augmentation des concentrations de fibrinogène ont été mélangés avec hématocrite falciforme recueillies auprès de patients comme précédemment par notre groupe 42. Ces méthodes ont été utilisées pour examiner la structure et les fonctions impliquées dans la formation de caillot de fibrine et de la fibrinolyse dans des conditions malades, ainsi que les mécanismes qui induisent les maladies cardiovasculaires. Basé sur l&#39;information courante sur ces maladies, les structures de fibrine caillot glyquée étaient plus dense avec moins d&#39;unnd pores plus petits. Les caillots de fibrine avec les globules rouges provenant de patients atteints de drépanocytose (RBC) étaient également plus dense et affichées agrégation des globules rouges et des grappes agglomérées de fibrine. Ce est un phénomène bien établi qui a été précédemment déterminé 43. On a également émis l&#39;hypothèse que le taux de la fibrinolyse est sensiblement inférieure à la formation de caillots de fibrine avec ou sans glyquées réduite par rapport à la plasmine en bonne santé, la fibrine normal. Les résultats ont montré que, pour la formation de caillots de fibrine glyquées, des résultats sensiblement différents de taux de lyse n&#39;a été observée que dans des conditions de concentration de la plasmine réduite. Cette technique expérimentale de l&#39;utilisation de la microscopie confocale offre des avantages significatifs par rapport à d&#39;autres méthodes d&#39;imagerie parce que les cellules et les protéines restent dans leur état natif, ce qui permet la capture de vidéo en temps réel de l&#39;activité de coagulation. Cette méthode de coagulation synthétiquement induction est également moins coûteux et plus efficace du temps que l&#39;obtention d&#39;échantillons de patients et le filtrage out individueldes protéines et des enzymes. En outre, en utilisant des protéines et des enzymes séparés de synthétiser des caillots, les caillots ont été normalisées de sorte qu&#39;il n&#39;y avait pas variabilité entre les échantillons à la suite d&#39;autres protéines dans le plasma.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="887">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:287px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">PBS</td>
			<td style="width:287px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide)</td>
			<td style="width:287px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">45-001-749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml heparinized vacutainer tubes</td>
			<td style="width:287px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Human Fibrinogen</td>
			<td style="width:287px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate</td>
			<td style="width:287px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">F13191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 mL graduated microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:287px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Glucose powder</td>
			<td style="width:287px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15023-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">FXIIIa</td>
			<td style="width:287px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VIS Confocal Microscope</td>
			<td style="width:287px;">Zeiss LSM 510</td>
			<td style="width:119px;">LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">50 mM Tris</td>
			<td style="width:287px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">S50-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:315px;">Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:287px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">449709-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vybrant DiD cell-labeling solution</td>
			<td style="width:287px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L7781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Plasmin</td>
			<td style="width:287px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium Chloride (5 M NaCl)</td>
			<td style="width:287px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Statistical Modeling Software</td>
			<td>IBM</td>
			<td style="width:119px;">SPSS Statistics 22</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental and imaging techniques for examining fibrin clot structures in normal and diseased states

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.

Microscopie confocale Analyse des glyquée fibrine Structures Clot Les images de microscopie confocale de caillots normaux et glyquée sont présentés dans la figure 3. Confocale analyse au microscope des caillots normaux et glyquée révèle que caillots glyquée sont plus denses avec des pores plus petits que les caillots normaux à la fois avec et sans l&#39;ajout de FXIIIa cours de la polymérisation caillot. Sur la figure 3A et 3B, il ...

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Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States

In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.

Techniques expérimentales et d&#39;imagerie pour examen caillot de fibrine Structures en normaux et malades Unis

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on ...

experimental-imaging-techniques-for-examining-fibrin-clot-structures

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11.3K vues.  Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine. In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.