The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia M&#252;nch for technical support.

<ol>
	<li>Walther, T. C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+in+cell+biology.">Mass spectrometry-based proteomics in cell biology.</a> J Cell Biol. 190 (4), 491-500 (2010).</li><li>Lenz, C., Urlaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+methodology+to+improve+proteome+coverage+depth.">Separation methodology to improve proteome coverage depth.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (4), 409-414 (2014).</li><li>Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+of+large-scale+analysis+of+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry.">Status of large-scale analysis of post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3444-3452 (2013).</li><li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture,+SILAC,+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Jimenez, C. R., Verheul, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics:+from+cancer+biology+to+protein+biomarkers,+drug+targets,+and+clinical+applications.">Mass spectrometry-based proteomics: from cancer biology to protein biomarkers, drug targets, and clinical applications.</a> Am Soc Clin Oncol Educ Book. , e504-e510 (2014).</li><li>Tang, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cancer+stem+cell+heterogeneity+and+plasticity.">Understanding cancer stem cell heterogeneity and plasticity.</a> Cell Res. 22 (3), 457-472 (2012).</li><li>Evans, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+into+iTRAQ:+where+do+we+stand+now.">An insight into iTRAQ: where do we stand now.</a> Anal Bioanal Chem. 404 (4), 1011-1027 (2012).</li><li>Ostasiewicz, P., Zielinska, D. F., Mann, M., Wisniewski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome,+phosphoproteome,+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry.">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 9 (7), 3688-3700 (2010).</li><li>Malmstr&#246;m, J., Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+targeted+mass+spectrometry+for+protein+biomarker+verification.">Perspectives of targeted mass spectrometry for protein biomarker verification.</a> Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 518-525 (2009).</li><li>Gillet, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+data+extraction+of+the+MS/MS+spectra+generated+by+data-independent+acquisition:+a+new+concept+for+consistent+and+accurate+proteome+analysis.">Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. 41, (2010).</li><li>Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+mammalian+tissue.">Laser capture microdissection of mammalian tissue.</a> J Vis Exp. 8, 309 (2007).</li><li>Liu, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+pipeline+for+biomarker+discovery+of+laser+capture+microdissected+breast+cancer+tissue.">Proteomics pipeline for biomarker discovery of laser capture microdissected breast cancer tissue.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 155-164 (2012).</li><li>Geiger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+as+a+spike-in+standard+in+quantitative+proteomics.">Use of stable isotope labeling by amino acids in cell culture as a spike-in standard in quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 6 (2), 147-157 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+sample+preparation+from+formalin+fixed+and+paraffin+embedded+tissue.">Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics.">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Sarvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++cancer+stem-like+cells+in+small+cell+lung+cancer+are+highly+tumorigenic+and+chemoresistant+but+sensitive+to+a+novel+neuropeptide+antagonist.">CD133+ cancer stem-like cells in small cell lung cancer are highly tumorigenic and chemoresistant but sensitive to a novel neuropeptide antagonist.</a> Cancer Res. 74 (5), 1554-1565 (2014).</li><li>Shlush, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pre-leukaemic+haematopoietic+stem+cells+in+acute+leukaemia.">Identification of pre-leukaemic haematopoietic stem cells in acute leukaemia.</a> Nature. 506 (7488), 328-333 (2014).</li><li>Schaab, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+phosphoproteome+analysis+of+human+bone+marrow+reveals+predictive+phosphorylation+markers+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia+with+quizartinib.">Global phosphoproteome analysis of human bone marrow reveals predictive phosphorylation markers for the treatment of acute myeloid leukemia with quizartinib.</a> Leukemia. 28 (3), 716-719 (2014).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Sci Transl Med. 4 (142), 142ra94 (2012).</li><li>Burgess, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+efficient+quantification+of+low-abundance+proteins+at+very+high+multiplex+via+targeted+mass+spectrometry.">Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (4), 1137-1149 (2014).</li><li>Boja, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Validation+Considerations+of+Multiplex+Mass+Spectrometry-based+Proteomic+Platforms+for+Measuring+Protein+Biomarkers.">Analytical Validation Considerations of Multiplex Mass Spectrometry-based Proteomic Platforms for Measuring Protein Biomarkers.</a> J Proteome Res. , (2014).</li></ol>

אי לנו ניגוד עניינים או נושאים אחרים לחשוף.

פרופיל ספקטרומטריה של proteomes סרטן תאים שמקורם בחולה נדרש לגילוי של סמנים חזוי / אבחון חדשים, כמו גם לתת הבנה טובה יותר של ביולוגיה של סרטן תאים, אשר עשוי בתורו להוביל לזיהוי של מטרות פוטנציאליות לתרופה חדשות. עם זאת, ניתוחי ספקטרומטריה כאלה הם מאתגרים מאוד, במיוחד בגלל בעיות מראש אנליטיות שונות צריכים להיפתר, אם אחד הוא להשיג תוצאות חזקות ורלוונטיות מבחינה ביולוגית. העבודה הניסויית המתוארת כאן מאפשרת אפיון כמותי של proteomic proteomes נגזר מאוכלוסיות סלולריות של שני גידולים נוזליים ומוצקים. יש צורך בהעשרה הראשונית של תאים סרטניים או על ידי microdissection התא-sortingor מבוסס FACS, כדי למנוע זיהום על ידי תאים של מייקרו-הסביבה של הגידול. יתר על כן, טכניקות אלו מאפשרות אחד לבודד אוכלוסיות סלולריות של עניין. מחקרי תא-ביולוגי אחרונים יש לי שדstrated שיש לי תת-אוכלוסיות סלולריות מסוימות נכסי ייזום-גידול ולכן הם רלוונטיים ביותר להיווצרות מחל סרטן 19,20. כספקטרומטריית מסה הפכה רגישה יותר בשנים האחרונות, ניתוחים כמותיים proteomic הם ריאלי עבור הכמויות הקטנות של חלבון שניתן להפיק מכמה אלף תאים, מה שמאפשרים להתמקד באוכלוסיות תאים רלוונטיות מבחינה תפקודית. הסט-אפ שהוצג כאן יכול לשמש כדי לזהות ולאמת את סמנים דיאגנוסטיים רומן בדגימות FFPE. לפיכך, הוא מבטיח BEA כלי שימושי לשיפור אבחון קליני, כעד כה עדיין יש חוסר של סמנים ביולוגיים מולקולריים במספר ובאיכות נאותים לסוגים רבים של סרטן. דוגמאות חשובות של אבחנה מבדלת קשה, שלסמנים ביולוגיים חסרות, הן האפליה בין סרטן הריאות ראשוני מגרורות בריאות, קרצינומה cholangiocellular intrapancreatic ואדנוקרצינומה של לבלב, כמו גם שונותentiation של neurofibroma השפיר מגידולי עצבים היקפיים נדן הממאירים ביותר. יתר על כן, אנו ואחרים הראו כי הבהרת כמותי של חתימות proteomic יכולה להיות שימושית בלימוד ביולוגיה של תא הסרטן באופן כללי, ולחושפים סמנים ביולוגיים חזוי של תגובה לטיפול בחולי סרטן 21. שני חסרונות הנוכחיים של השיטה שהוצגה כאן הם הדרישה לעיבוד מדגם ידני נרחב והביקוש בזמן רכישת NanoLC-MS / MS. בעוד ניתן לטפל לשעבר על ידי הזזת הכנת מדגם לדוגמה, פורמטים 96-היטב ובאמצעות עיבוד רובוטית, האחרון ידרוש שינוי באסטרטגיית רכישות ספקטרומטריה. ברגע תת קבוצות של חלבוני היעד זוהו שיכולה להיות קשורות לדוגמה, סיווג גידול, אנו חוזים את העיצוב של שיטות ספקטרומטריית מסה ממוקדות המספקות קריאות כמותי לתת אלה במאמץ הפרדה מופחת במידה ניכרת, ולכן עם זמן רכישה מופחתת בהתאם. אם זמן הרכישה הנדרש הנדרש יכול להיות מופחת 24-36 שעות (גידולים נוזליים) או 3 שעות (גידולים מוצקים) לדוגמה, שעה 1 באמצעות ספקטרומטר מסה ממוקדת והפרדה חד-ממדית פשוטה של פפטידים, אז רווח וכתוצאה מכך התפוקה יכול לשמש כדי להגדיל באופן משמעותי את מספרם של משכפל ביולוגי וטכני שנבדק, עם מקביל שיפורים במשמעות של תוצאות כימות. ממוקדת גישות ספקטרומטריה כבר הוכיחו להיות כלי מתאים לאימות של סמן ביולוגי-מועמדי חלבון סרטן הקשורים 22, ופותחו לנקודה שבה הם מראים הבטחה לאימות או אפילו ככלי פוטנציאלי לשימוש קליני שיגרתי 23 , 24.

פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה התפתחה וכיום היא משמעת בשימוש נרחב בביולוגיה של תא ומחקר ביו-רפואי translational. התקדמות טכנית בתחום הפכה אותו ניתן ללמוד תהליכים תאיים מורכבים בשורות תאים ומודלים של בעלי חיים, כאלף חלבונים יכולים להיות מזוהות בניסוי ספקטרומטריה יחיד 1,2. התקדמות דומה נעשתה לניתוח רבים שינויי posttranslational כגון זרחון או ubiquitination, אם כי זה בדרך כלל דורש זרימות עבודה העידו להעשרה וניתוח נתונים עבור כל סוג של 2,3 שינוי. יתר על כן, מעורבותם של אסטרטגיות כימיות ומטבולית תיוג, כוללים SILAC, מאפשרת כימות היחסית מדויקת של חלבונים וPTMs, מה שהופך שיטה זו אטרקטיבית במיוחד לגילוי תהליכים בסיסיים סלולריים, סמנים דיאגנוסטיים ויעדים אפשריים לתרופה בסרטן בבני אדם 4. עם זאת,כמה אתגרים יש להתגבר בכל קשור לניתוח proteomic של הסרטן אנושי ראשוני 5. קודם כל, דגימות סרטן בבני אדם לעתים קרובות להראות רמה גבוהה של ההטרוגניות סלולרית שנובעת מנוכחותם של סוגי תאים שונים השייכים למייקרו-הסביבה של הגידול, כולל תאים וfibroblasts חיסוניים. שנית, אבולוציה משובט מובילה למגוון גנטי בתוך הגידולים עצמם, וכתוצאה מכך קיומם של מספר תת-אוכלוסיות סלולריות עם תכונות פונקציונליות שונות. על פי התפיסה הנוכחית של כמה תאי גזע סרטני שהכוחות המניעים מאחורי התפתחות והתקדמות הסרטן, ניתוח proteomic של תת-אוכלוסיות (תפקודי רלוונטיות מאוד) כגון סלולריות צפוי להיות בעלת חשיבות גדולה להבנה טובה יותר של מנגנונים שעור רלוונטית ליישום קליני 6. שלישית, פרופילי ביטוי חלבון הכמותי של קבוצות גדולות של דגימות נדרשים לעתים לזיהוי biomar הקליני חזקKERS; זה לא יכול להיות מושלם על ידי תיוג כימי כגון 7 iTRAQ, ואילו אסטרטגיות תיוג מטבולית - הסתמכות, כפי שהם עושים, בהתרבות תאים 4 - הן גם ישימה. רביעית, רוב דגימות גידולים מוצקות הזמינות הן פורמלין-קבוע, אשר מסבך ניתוח proteome ספקטרומטריה עקב היווצרות של חלבון crosslinks 8. לבסוף, רוב תהליכי העבודה פרוטאומיקה הקיימת דורשים כמויות משמעותיות של עיבוד מדגם ורכישת נתונים, עיבוד הניתוח של מספרים לדוגמה רלוונטיים למחקר קליני קשה, וקוראות לעבודה חדשה פרדיגמות 9,10. כדי לטפל במכשולים הללו פיתחנו התקנה ניסיונית המשלבת גם תא זרימת cytometric מיון 11 או לייזר ללכוד microdissection 12,13 להעשרה סלולרית עם אסטרטגית Super-SILAC 14 להציג תקן פנימי עולמי לניתוח ספקטרומטריה מקיף. על ידי שימוש בשיטה שתוארה כאן, אפשר לכמת עד 8,000 חלבונים בדגימות גידולים אנושיים אחת הנגזרות משני סוגי הסרטן נוזליים או מוצק.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="943">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">660 nm Kit</td>
			<td style="width:181px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:151px;">22662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture medium depleted of arginine and lysine</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">88421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution</td>
			<td style="width:181px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:151px;">161-0436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialyzed fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:181px;">PAA</td>
			<td style="width:151px;">A15-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diffuser caps for microdissection</td>
			<td style="width:181px;">MMI</td>
			<td style="width:151px;">50202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS-sorter</td>
			<td style="width:181px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">FACSAria III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ionic Detergent Compatibility Reagent</td>
			<td style="width:181px;">Thermo scientific</td>
			<td>22663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser-capture microdissector</td>
			<td style="width:181px;">MMI&#160;</td>
			<td style="width:151px;">cell cut plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LDS buffer&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Membrane slides for microdissection</td>
			<td style="width:181px;">MMI</td>
			<td style="width:151px;">50103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcon YM-30</td>
			<td style="width:181px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">MRCF0R030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0335PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Picofrit Self-Pack Columns</td>
			<td style="width:181px;">New Objective</td>
			<td style="width:151px;">PF360-75-15-N-5</td>
			<td>Mass Spectrometry Column/Emitter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reducing agent</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase</td>
			<td style="width:181px;">Dr. Maisch</td>
			<td style="width:151px;">120 C18-AQ, 3 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase</td>
			<td style="width:181px;">Dr. Maisch</td>
			<td style="width:151px;">120 C18-AQ, 5 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SILAC-labeled arginine</td>
			<td style="width:181px;">Eurisotop</td>
			<td style="width:151px;">CLM-2265-H-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SILAC-labeled lysine</td>
			<td style="width:181px;">Eurisotop</td>
			<td style="width:151px;">DLM-2640-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, NB Sequencing Grade</td>
			<td style="width:181px;">Serva</td>
			<td style="width:151px;">3728301</td>
			<td>for in-gel digests</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, Sequencing Grade</td>
			<td style="width:181px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">V5111</td>
			<td>for in-solution digests</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buffer and solutions</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF,&#160; 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for FASP-protocoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for FASP-protocoll</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">0.05 M NH4HCO3</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for in-gel digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for in-gel digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;5% aqueous formic acid.</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative mass spectrometric profiling of cancer-cell proteomes derived from liquid and solid tumors

בניתוחים מעמיקים של proteomes תא הסרטני יש צורך להבהיר pathomechanisms שעור, כמו גם לזהות מטרות פוטנציאליות לתרופה, וסמנים דיאגנוסטיים. עם זאת, שיטות לאפיון proteomic כמותי של גידולים המופק מחולה ובתת-האוכלוסיות הסלולריות שלהם בפרט במידה רבה חסרות. כאן אנו מתארים ניסיוני הגדרה המאפשרת ניתוח כמותי של proteomes של תת-אוכלוסיות של תאי הסרטן נובעות משני גידולים נוזליים או מוצקים. זו מושגת על ידי שילוב של אסטרטגיות העשרה סלולריות עם ספקטרומטר מסה ואחריו ניתוח נתונים bioinformatic מבוסס Super-SILAC כמותיים. כדי להעשיר את תת סלולריים ספציפיים, גידולים נוזליים immunophenotyped ראשון על ידי זרימת cytometry אחרי FACS-מיון; לגידולים מוצקים, microdissection לייזר ללכוד משמש לטיהור תת-אוכלוסיות סלולריות ספציפיות. בשלב שני, חלבונים המופקים מהתאים המטוהרים ושילוב לאחר מכן עם גידול ספציפי,SILAC שכותרת סטנדרטי המאפשרת כימות חלבון ספייק-ב. תערובת חלבונים וכתוצאה מכך היא נתון או ג&#39;ל אלקטרופורזה או לדוגמא סינון בעזרת הכנה (FASP) ואחריו עיכול tryptic. לבסוף, פפטידים tryptic מנותחים באמצעות ספקטרומטר מסת quadrupole-orbitrap היברידי, והנתונים המתקבלים מעובדים עם חבילות תוכנת bioinformatic כולל MaxQuant. באמצעות זרימת העבודה שהוצגה כאן, עד 8,000 חלבונים ניתן לזהות ולכמת בדגימות שמקורם בחולה, וניתן להשוות את פרופילי ביטוי חלבון וכתוצאה מכך בקרב חולים לזהות חתימות proteomic לאבחון או למטרות תרופה פוטנציאליות.

פרופיל proteomic של גידולים נוזליים ומוצקים מחולים הוא גישה מבטיחה לגילוי של סמנים לאבחון וניבוי חדשים. עם זאת, הליך הכנת מדגם וניתוח ספקטרומטריה מאתגרים, בשל המורכבות של דגימות ואת הצורך בכימות מדויק של חלבון בקבוצות גדולות של דגימות. ההליך ניסיוני שתואר לעיל מתחיל בבידוד של תאים של עניין, בין אם על ידי מיון תא הקרינה המופעל או על ידי microdissection לייזר ללכוד. לצורך כך, תאים מaspirates-נגזר מטופל מח עצם או דגימות דם מגואלות נוגדנים שכותרתו הקרינה נגד סמנים פני הגדרה של עניין לפני מיון מבוסס FACS ותמוגה תא. כדי להעשיר את תת סלולריים מסעיפי רקמות, אלה שיש לי ראשון שרכובים על שקופיות מתאימות כדי לאפשר לmicrodissection לייזר ללכוד. לצורך כך הר tהוא סעיפי רקמות על שקופיות קרום מתאימות ולהשתמש בליזר ללכוד microdissector לפי הוראות יצרן. בחירת האזורים ותאים של עניין דורשת ידע מתאים על histomorphology של רקמה בריאה וגידולים. לאחר מכן התאים שחולצו הועברו לצינור איסוף מתאים. יש לבצע ניסויים ראשוניים על מנת להגדיר את כמות הרקמה הכרחית להפקת כמויות מספיקות של חלבון (חלבון הכולל של 10 מיקרוגרם מינימום) לכל רקמות חדשות של עניין. כל דגימת microdissected מטופל עם 60 μl של חיץ תמוגה הרקמה. לתמוגה היעילה, תאים מדגימות רקמה צריכים להיות sonicated במשך 3 דקות ולאחר התוספת של 15 μl דגימות SDS מודגרת בthermomixer ב -99 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי להסיר crosslinks חלבון הנוצר על-פורמלין. צנטריפוגה לבסוף תקל על האוסף של lysate הסלולרי פינה. לכל מחלה שליnterest (נוזל וגידולים מוצקים) יש סטנדרטי כימות Super-SILAC מתאים ליוקמו 14. סטנדרטי מתאים צריכים לייצג יותר מ -90% מהחלבונים המתבטאים בדגימות של עניין. להכנת סטנדרטית כימות, שורות תאים הקשורים לסוג הסרטן של עניין צריכים קודם להיות מנותחות על ידי ספקטרומטריית מסה כדי לקבוע פרופילי ביטוי החלבון שלהם וניתוח מרכיבים עיקרי לאחר מכן יש לבצע. יש לבחור 6 שורות תאים שונות עם דפוסי ביטוי חלבון ההפרש וSILAC שכותרתו עם ארגינין &quot;כבד&quot; וליזין - 4. יעילות תיוג צריכה להיבדק על ידי NanoLC-MS / MS וצריכה להיות גדול מ 98%. לאחר מכן, יש lysed שורות תאים באותו אופן כמו לדוגמא בהתאמה נגזר מטופל ו, לאחר מכן, כמויות חלבון equimolar של כל דגימה והסטנדרטית ספייק-בSILAC צריכים להיות מעורבות. צעד קריטי לכימות מדויק של חלבון דגימות קליניות oעניין f הוא התערובת מדויקת של כמויות חלבון equimolar של דגימות שמקורם בחולה וסטנדרטית כימות ספייק-בSILAC. כדי לקבוע את ריכוז החלבון של lysates שמקורם בתאים ממוינים, ניתן להשתמש במבחני כימות חלבון שונים. לlysates הסלולרי מתאים שמקורם ברקמה יש צורך assay שיכול להתמודד עם ריכוזים גבוהים של SDS וDTT בlysate. ריכוז חלבון של דגימות שמקורם בחולה וסטנדרטית ספייק-בSILAC יש למדוד בכל פעם לפני שילוב עם הדגימות קליניות המתאימות כדי להבטיח נכונה תערובת, שהוא חיוני בהפיכת אפילו מאות דגימות דומות. לאחר שהתערובת של כמויות שווה של עיכול ספייק-בדגימות סטנדרטית וlysate, המתקבלות מגידולים נוזליים מעורבבים עם LDS, מחוממים בthermomixer על 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן נחשפו ל1D-עמוד ובג&#39;ל של מופרד חלבונים עם טריפסין. דגימות שהתקבלו מרקמה משתחררת מSDS ומתעכלת עם טריפסין על ידי שימוש בגישת FASP כפי שנקבע על ידי וישנייבסקי et al. 15 פפטידים tryptic שהושגו ניתן לכמת על ידי מדידת הקרינה טריפטופן, שהוא בעל עניין מיוחד עבור דגימות רקמה כסכום של פפטידים שוחררו מהמסנן שונה בין 15% לבין 75% בהשוואה לכמויות החלבון בתחילה הועמסו על המסנן. לשם כך אנו מודדים את הקרינה של טריפטופן. השוואה עם סדרת דילול טריפטופן מתאימה מאפשרת כימות של פפטידים, כ1.1 מיקרוגרם של טריפטופן מתאים לכ 100 מיקרוגרם של פפטיד. במידת צורך, דגימות נגזרות בעיקר מעיבוד FASP ניתן מראש מטוהרות משני טיפים שלב מסחריים או תוצרת בית עמוס בחומר הפוך שלב C18 (RP-C18) לפני העמסתי על מערכת NanoLC / MS / MS 18. ניתוח המוני spectrometric מבוצע על גבוה-resolution, מערכת ספקטרומטר מסת רגישות גבוהה. בקיצור, דגימות פפטיד הם desalted וpreconcentrated על precolumn RP-C18, והפרידו על עמודה אנליטיים RP-C18 בשילוב ישירות לספקטרומטר המסה. כדי להשיג עומק מספק של ניתוח, אנו מעסיקים או שילוב של prefractionation חלבון SDS-PAGE עם מילויים 40 דקות RP-C18 (לגידולים נוזליים) או זריקות יחידים עם 2 ארוך - הדרגתיים RP-C18 3 שעות (לגידולים מוצקים מעובדים על ידי FASP ). MS ספקטרום נרכש ברזולוציה של 70,000 FWHM או טוב יותר, כדי לאפשר לכימות מדויק של זוגות SILAC על ידי שילוב של פרופילי שיא chromatographic. לזיהוי חלבון, שיטת רכישת נתונים תלויים Top15 משמשת להפקה מספר רב של פפטיד MS / MS ספקטרום לפפטיד וזיהוי חלבונים. מהנתונים הגולמיים וכתוצאה מכך, זיהוי חלבונים וכימות מושגות על ידי מסד נתונים עם תוכנת חיפוש MaxQuant נגד Knowledgebas UniProtמסד נתוני דואר אדם Proteome השלם רצף 17. בתוכנת MaxQuant (גרסה הנוכחית 1.5.0.25) פפטידים מזוהים מMS / MS הספקטרום שנרכש על ידי פפטיד בר-התאמה נגד ספקטרום נגזר בסיליקון ומבסיס נתוני רצף חלבון. במקביל, מבשר יון פרופילי איזוטופי מופק סביב הפעמים שמירת chromatographic, ואזורי השיא המשולבים שלהם משמשים לכימות יחסי של האור: זוגות פפטיד כבדים שנוצרו על ידי תיוג SILAC. זהויות פפטיד ועוצמות יחסי לאחר מכן הוקצו לנכסי החלבון המקביל. תוכנת פרסאוס (גרסה הנוכחית 1.5.0.15) לאחר מכן נעשה שימוש כדי לבצע הערכה נוספת במורד הזרם סטטיסטית של תוצאות עיבוד MaxQuant, כוללים השוואות מדגם למדגם, PCA וקיבוץ היררכי. שימוש בהגדרת הניסוי מתואר זיהינו ולכמת עד 8,000 חלבונים מקטנים כמו 30 מיקרוגרם של חלבון הכוללשמקורם בגידולים נוזליים. עד 2,500 חלבונים מדגימות מוצק-גידול יכולים להיות מזוהים ולכמת בגישת proteomic רובה עם שיפוע LC של רק 2 שעות, המאפשרים הניתוח של מאות דגימות קליניות בזמן קצר יחסית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig1highres.jpg" /> איור 1. זרימת עבודה ניסויית. השלבים העיקריים של העשרה סלולרית-משנה, בידוד חלבון, ספייק-בתקן כימות והניתוח המוני spectrometric מוצגים לגידולים נוזליים ומוצקים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig2highres.jpg" /> 2. אסטרטגיה העשרה סלולרית איורes. מיון FACS וLCM. (א) אסטרטגית gating מופת המתארת ​​gating על אוכלוסיית תאי leukemic המוכתם CD117 נרכשה על ידי סדרן תא. microdissection ללכוד לייזר (B) של רקמת גידול מוצקה. סעיפי רקמות של 5 - 10 עובי מיקרומטר היו רכובים על שקופיות קרום מכוסה סרט לפני הצביעה. האזור של אינטרסים שנבחר באופן ידני לmicrodissection ללכוד לייזר. מוצגים קטעים לפני microdissection עם האזור של עניין מסומן צהוב ולאחר microdissection. סרגל קנה מידה של 50 מיקרומטר כלול בדמות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig3highres.jpg" /> ניתוח איור 3. אשכול proteomes סרטן תאים האנושי. ניתוח אשכולות ללא פיקוח והשגחה של יחסי ציבורפרופילי ביטוי otein של גידולים נוזליים ומוצקים בוצעו באמצעות הפלטפורמה חישובית פרסאוס. AC - אדנוקרצינומה, SCC - קרצינומה של תאי קשקש, SCC-Met - גרורות קרצינומה של תאי קשקש מסרטן הראש והצוואר, R - לשכפל טכני.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors at JoVE.com

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Mass כמותי spectrometric פרופיל של Proteomes סרטן התאים נגזרים מנוזלים וגידולים מוצקים

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

quantitative-mass-spectrometric-profiling-cancer-cell-proteomes

Research

JoVE Journal

Medicine

16.0K Views.  University Medical Center, Göttingen. In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Video: Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of areas of distinct differentiation into recognized histological subtypes, or different pathological grade, often there are more subtle differences in phenotype which defy accurate classification (Figure 1). Ultimately, since morphology is dictated by the underlying molecular phenotype, areas with visible differences are likely to be accompanied by differences in the expression of proteins which orchestrate cellular function and behavior, and therefore, appearance. The significance of visible and invisible (molecular) heterogeneity for prognosis is unknown, but recent evidence suggests that, at least at the genetic level, heterogeneity exists in the primary tumor1,2, and some of these sub-clones give rise to metastatic (and therefore lethal) disease. 
Moreover, some proteins are measured as biomarkers because they are the targets of therapy (for instance ER and HER2 for tamoxifen and trastuzumab (Herceptin), respectively). If these proteins show variable expression within a tumor then therapeutic responses may also be variable. The widely used histopathologic scoring schemes for immunohistochemistry either ignore, or numerically homogenize the quantification of protein expression. Similarly, in destructive techniques, where the tumor samples are homogenized (such as gene expression profiling), quantitative information can be elucidated, but spatial information is lost. Genetic heterogeneity mapping approaches in pancreatic cancer have relied either on generation of a single cell suspension3, or on macrodissection4. A recent study has used quantum dots in order to map morphologic and molecular heterogeneity in prostate cancer tissue5, providing proof of principle that morphology and molecular mapping is feasible, but falling short of quantifying the heterogeneity. Since immunohistochemistry is, at best, only semi-quantitative and subject to intra- and inter-observer bias, more sensitive and quantitative methodologies are required in order to accurately map and quantify tissue heterogeneity in situ.
We have developed and applied an experimental and statistical methodology in order to systematically quantify the heterogeneity of protein expression in whole tissue sections of tumors, based on the Automated QUantitative Analysis (AQUA) system6. Tissue sections are labeled with specific antibodies directed against cytokeratins and targets of interest, coupled to fluorophore-labeled secondary antibodies. Slides are imaged using a whole-slide fluorescence scanner. Images are subdivided into hundreds to thousands of tiles, and each tile is then assigned an AQUA score which is a measure of protein concentration within the epithelial (tumor) component of the tissue. Heatmaps are generated to represent tissue expression of the proteins and a heterogeneity score assigned, using a statistical measure of heterogeneity originally used in ecology, based on the Simpson's biodiversity index7.
To date there have been no attempts to systematically map and quantify this variability in tandem with protein expression, in histological preparations. Here, we illustrate the first use of the method applied to ER and HER2 biomarker expression in ovarian cancer. Using this method paves the way for analyzing heterogeneity as an independent variable in studies of biomarker expression in translational studies, in order to establish the significance of heterogeneity in prognosis and prediction of responses to therapy.

Here we describe a method to quantify molecular heterogeneity in histological sections of tumor material using quantitative immunofluorescence, image analysis, and a statistical measure of heterogeneity. The method is intended for use in clinical biomarker development and analysis.

הטרוגניות מיפוי של ביטוי חלבון בתוך גידולים באמצעות immunofluorescence כמותי

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

MicroRNA איתור גידולים הערמונית ב כמותי בזמן אמת PCR (QPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

ניתוח הכמות של Proteomes הכרומטין במחלות

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome compared to matched normal tissue. Based on these analyses it is evident that there are many undiscovered genetic drivers of cancer1. Unfortunately these drivers are hidden within a much larger number of passenger anomalies in the genome that do not directly contribute to tumor formation. Another aspect of the cancer genome is that there is considerable genetic heterogeneity within similar tumor types. Each tumor can harbor different mutations that provide a selective advantage for tumor formation2. Performing an unbiased forward genetic screen in mice provides the tools to generate tumors and analyze their genetic composition, while reducing the background of passenger mutations. The Sleeping Beauty (SB) transposon system is one such method3. The SB system utilizes mobile vectors (transposons) that can be inserted throughout the genome by the transposase enzyme. Mutations are limited to a specific cell type through the use of a conditional transposase allele that is activated by Cre Recombinase. Many mouse lines exist that express Cre Recombinase in specific tissues. By crossing one of these lines to the conditional transposase allele (e.g. Lox-stop-Lox-SB11), the SB system is activated only in cells that express Cre Recombinase. The Cre Recombinase will excise a stop cassette that blocks expression of the transposase allele, thereby activating transposon mutagenesis within the designated cell type. An SB screen is initiated by breeding three strains of transgenic mice so that the experimental mice carry a conditional transposase allele, a concatamer of transposons, and a tissue-specific Cre Recombinase allele. These mice are allowed to age until tumors form and they become moribund. The mice are then necropsied and genomic DNA is isolated from the tumors. Next, the genomic DNA is subjected to linker-mediated-PCR (LM-PCR) that results in amplification of genomic loci containing an SB transposon. LM-PCR performed on a single tumor will result in hundreds of distinct amplicons representing the hundreds of genomic loci containing transposon insertions in a single tumor4. The transposon insertions in all tumors are analyzed and common insertion sites (CISs) are identified using an appropriate statistical method5. Genes within the CIS are highly likely to be oncogenes or tumor suppressor genes, and are considered candidate cancer genes. The advantages of using the SB system to identify candidate cancer genes are: 1) the transposon can easily be located in the genome because its sequence is known, 2) transposition can be directed to almost any cell type and 3) the transposon is capable of introducing both gain- and loss-of-function mutations6. The following protocol describes how to devise and execute a forward genetic screen using the SB transposon system to identify candidate cancer genes (Figure 1).

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

A method of identifying unknown drivers of carcinogenesis using an unbiased approach is described. The method uses the Sleeping Beauty transposon as a random mutagen directed to specific tissues. Genomic mapping of transposon insertions that drive tumor formation identifies novel oncogenes and tumor suppressor genes

זיהוי<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; הוספות Transposon בגידולים מוצקים באמצעות PCR לינקר בתיווך

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

בדימות אופטי Vivo של גידולים במוח ודלקת פרקים באמצעות פלורסנט SapC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

שיטה לקבלת תאי סרטן השחלות ראשיים מתוך דגימות מוצקים

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

דור של Microtumors שימוש 3D אדם Biogel תרבות מערכת תאי Glioblastoma נגזרות חולות להרכבת פרופיל Kinomic ובדיקת תגובה לתרופה

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

בידוד Profiling של MicroRNA המכיל Exosomes מן האדם מר

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and elevated IFP are linked to the heterogeneous intra-tumoral distribution of nanotechnology-based drug delivery systems such as liposomes. In the present study, the relationship between tumor microcirculation, elevated IFP, and accumulation of nanoparticles was investigated through in vivo experimentation. This was accomplished by evaluation of the tumor microcirculation using dynamic contrast enhanced computed tomography (DCE-CT) and measurement of tumor IFP using a novel image-guided robotic needle placement system connected to the micro-CT scanner. The intra-tumoral accumulation of liposomes was determined by CT image-based assessment of a nanoparticle liposomal formulation that stably encapsulate the contrast agent iohexol (CT-liposomes). CT imaging allowed for co-localization of the spatial distribution of tumor hemodynamics, IFP and CT-liposome accumulation in an individual subcutaneous xenograft mouse model of breast cancer. Measurements led to the discovery that perfusion and plasma volume fraction are strong mediators of the intra-tumoral distribution of liposomes. Furthermore, the results suggest that IFP plays an indirect role in mediating liposome distribution through modulating blood flow.

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes has been linked to an abnormal tumor microenvironment. Herein methods are presented to measure tumor microcirculation by perfusion imaging and elevated interstitial fluid pressure (IFP) using an image-guided robotic system. Measurements are compared to the intra-tumoral accumulation of liposomes, determined using volumetric micro-CT imaging.