This study was supported by a K08 Award (DK090154-01) from the National Institutes of Health (NIH; to F.M.S.).

קבלת המרה מחולה ידי cholangiopancreatography מדרדר אנדוסקופית (ERCP) טעון אישור פרוטוקול מחקר בבני אדם על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי. כל העבודה המוצגת כאן אושרה על ידי הדירקטוריון סקירה מוסדיים באוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס. 1. בידוד Exosome מן המרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע cholangiopancreatography מדרדר אנדוסקופית (ERCP). מניחים את המטופל במצב שכיבה ו לצנרר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר ערך מסוג duodenoscope דרך הפה של המטופל להכניס אותו לתוך החלק השני של התריסריון ולזהות את הגבשושיות הגדולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סלקטיבי cannulate צינור המרה המשותף על ידי החדרת לומן משולש sphincterotome טעון מראש עם guidewire הידרופילי 0.035 אינץ &#39;(0.9 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדם את guidewire תחת הדרכתו fluoroscopic אל צינור כבד השמאל מאז בהזדמנות זה יכול להיות קשה להבדיל צינור פיברוזיס מן הצינור הכבד התקין, אז לקדם אתsphincterotome 5 ס&quot;מ לתוך צינור המרה לרכוש עמדה יציבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את guidewire, לצרף מזרק 10 מ&quot;ל לנמל guidewire דרך המנעול Luer לשאוב מרה באמצעות 10 מ&quot;ל של לחץ שלילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המזרק המכיל את מרה להמשיך עם ERCP ידי והכנסה מחדש של guidewire והזרקת חומר ניגוד דרך נמל הזרקת opacify העץ המרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את מרה שנאספו לתוך צינור 15 מ&quot;ל על קרח ולשמור על הקרח עד מוכן להמשיך לשלב צנטריפוגה. זהירות: יש להשתמש בכפפות כדי להגן על עצמך ועל הדגימות! פנק את המרה כמקור פוטנציאלי לזיהום כפי שהוא יכול להכיל חלקיקים הפטיטיס ויראלי! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את המדגם (ים) על קרח. כך או להמשיך עם שלב 1.2 או צנטריפוגות ב XG 500 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן להקפיא ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. הערה: דוגמאות מאוחסנות בדרך זו במשך מספר שנים כבר בשימוש שיגרתי עם תוצאות טובות 19. </li></ol&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 400 μl של מרה לתוך צינור microcentrifuge ולאסוף תאים פסולת התא על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ידי pipetting, להעביר צינור microcentrifuge טרי צנטריפוגות לדוגמא (ו) ב 16,500 XG במשך 20 דקות אחרות ב 4 ° C כדי לנקות את supernatant של פסולת נוספת. מחק את הצינורות הפסולים Biohazard. לחלופין, לסובב את הדגימות בתוך ultracentrifuge במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את supernatant ולסנן אותה בתוך ארון בטיחות ביולוגי עם מזרק דרך פילטר קרום 0.2 מיקרומטר polyethersulfone (PES) אשר יש ספיקות טובות וחלבון נמוך מחייבים להסיר כל חלקיקים גדולים יותר מ -200 ננומטר עזבו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את supernatant המסונן ultracentrifuge צינורות ולהוסיף PBS כך הצינורות הם יותר 2/3 מלאים. אם הצינורות מכילים פחות נוזלים מזה, הצינורות יקרסו במהלך צנטריפוגה! צינורות ניתן לכבס, autoclaved ולעשות בהם שימוש חוזר מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלואח exosomes דרך ultracentrifugation ב 120,000 XG במשך 70 דקות ב 4 ° C. לאחר מבט צנטריפוגה בתחתית צינור ultracentrifuge לפעמים לראות כדורים צהובים קטנים; אלה הם exosomes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ידי בקפידה decanting זה ולחטא את פסולת על ידי הוספת אקונומיקה לריכוז סופי של נ 10% v / ולתת לו לעמוד במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים במורד זרם, או לעבד את הגלולה (ים) בנפח קטן של הפתרון המתאים (כלומר, assay radioimmunoprecipitation (Ripa) חיץ לבידוד חלבון, חיץ תמוגה RNA לבידוד miR) או resuspend אותו 50-150 μl של פוספט שנאגר מלוחים (PBS) אשר ניתן לאחסן גם ב -80 ° C לשימוש עתידי (תגובת שרשרת פולימראז כמותיים בזמן אמת (qRT-PCR) או מיצוי חלבון וכו &#39;) או בשימוש לאפיון של התכשיר exosome ידי TEM או ניתוח אופטי ננו-חלקיקים . </li></ol> 2. Exosome זיהוי על ידימיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (TEM) או CryoEM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend שלפוחית ​​תאית 100 μl של PBS על ידי pipetting. באופן אידיאלי, להשתמש exosomes שלא היה מאוחסן ב -20 ° C או -80 ° C, במיוחד בעת ביצוע הבידוד בפעם הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספוג aliquot 20 μl (כ -2 מיקרוגרם) ל -400 רשתות נחושת Parlodion רשת מצופה פחמן למשך 2 דקות ולאפשר לו להתייבש ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את exosome ב -1% (v / v) glutaraldehyde (EM-כיתה) במשך 5 דקות ב RT על ידי הצבת טיפות בזהירות על הכנת יבשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרשתות פעמים במים במשך 5 דקות ולאחר מכן בניגוד כלי רכב חשמלי כתם עם חומצת phosphotungstic 1% (PTA) למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות עם מיקרוסקופ אלקטרונים עם מתח אץ של 80 kilovolts החל בהגדלות של 20,000X והגדלה כדי 100,000X בעת קביעת גודל החלקיקים. הערה: preps אחר כמו שכבות על גבי 200 רשתות נחושת או ניקל רשת Formvar מצופה פחמן והניגודיות המכתים like 1% או 2% אצטט uranyl במשך 10-15 דקות גם אפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת CryoEM, לערבב aliquot 20 μl (כ -2 מיקרוגרם) עם 60 10 זהב μl חלבון G ננומטר (1: 3 יחס). זה יעזור לקבוע את קוטר exosome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הדגימות על רשתות פחמן מחורר-משוחרר זוהרות במול C ולהסיר נוזל עודף ידי סופג. להקפיא את הרשתות על ידי טבילה אותם מייד לתוך אתאן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הרשתות בתוך cryoholder בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכש את התמונות ב 200 קילו וולט עם בהגדלה של 20,000X ו 100,000X. </li></ol> 3. זיהוי Exosome ידי ניתוח אופטי Nanoparticle Multi-פרמטר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את exosomes מבודד 100 μl של PBS על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל exosomes ב 600 μl PBS בכמה יחסים שונים (כמו 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 ו -1: 1,200). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את exosomes ידי פיזור אור לייזר עם כלי מתאים ותוכנה בזמן אמת על פי manufactu20 פרוטוקול של RER. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות את רמת המצלמה במצב לכיד עד החלקיקים להיות גלויים, אז לשנות את הפוקוס כדי להפוך את החלקיקים להיראות חלקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד במצב רגיל, להקטין את המצלמה לרמה הנמוכה ביותר כי החלקיקים עדיין ניתן לראות, ואם יש צורך להתאים תריס מצלמה ורווח כדי להשיג זאת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחינה ויזואלית לבדוק על מנת להבטיח 20-100 חלקיקים גלויים על המסך, אם לא לרוקן את היחידה ולהתאים את הדילול ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז להתאים את משך הזמן ללכוד בין 30-60 שניות. אחרי שהסרט הוא נתפס, להתאים את הפרמטרים עיבוד עד שכל החלקיקים מזוהים על המסך ולעבד את קובץ הווידאו. </li></ol> 4. אפיון Exosome ידי המערב כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse exosome כדורי 2-5 מ&quot;ל של מרה 100 μl של assay radioimmunoprecipitation קרים כקרח (Ripa) חיץ עם מעכב פרוטאז ידי pipetting למעלה ולמטה ביסודיות ומערבבים lysates במרץ למשך 30 שניותעל מערבולת כדי solubilize החלבונים ביעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד רוב הזמן אין צורך, השתמש דופק-sonication של דגימות קרח עם 2 פעימות במשך 10 שניות כל מנת להבטיח תמוגה מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה חומר מסיס על ידי צנטריפוגה ב 15,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהעביר supernatant לצינור נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז חלבון עם שיטת הבחירה (כלומר, חומצה bicinchoninic (BCA), Coomassie, שונה לורי, 660 Assay חלבון ננומטר, וכו &#39;) על פי פרוטוקול של היצרן. השיטה היא לא חשובה כמו עוד באותה השיטה משמשת בעקביות להשגת תוצאות שניתן לעומת פני ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 50 מיקרוגרם חלבון לכל מדגם חיץ Laemmli לאחר חימום מדגם ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לתוך באר של ג&#39;ל polyacrylamide אלקטרופורזה (עמוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrophorese הדגימות על ג&#39;ל העמוד עבור 1.5 שעות ולהעביר את החלבונים המופרדים על קרום ניילון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bלנעול את קרום (ים) עם חלב ללא שומן 5% ב מלוחים שנאגרו טריס עם 0.1% Tween 20 (TBS-T) עבור 1 שעה, ואז דגירה עם נוגדנים ספציפיים-exosome כמו אנטי CD63 ואנטי-TSG-101 בדילול של 1: 500 רצוי O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את ממברנות עם 10 דקות TBS-T 3 x, ואז דגירה עם מתאים, התאמת נוגדנים משני HRP-מצומדות ללא שומן חלב 5% ב TBS-T במשך 1-2 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה (ים) 3 x 5 דקות עם TBS-T לזהות את החלבונים הספציפיים עם ריאגנטים chemiluminescence על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה הממברנות עם סרט או מערכת הדמיה דיגיטלית על פי הפרוטוקול של היצרן. </li></ol> בידוד MicroRNA 5. מן Exosomes המבודד הערה: בידוד של מירנה מן exosomes המר מתבצעת באמצעות בידוד מירנה שונה מבוסס על ערכה זמינה מסחרי, אבל כל שיטת בידוד RNA אחרת יכולה לשמש או מותאמת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 &amp;# 181; תמוגה l / חיץ הבניין גלולה exosome (מבודד 400 מרה μl), מערבולת, pipet או לעבור דרך מזרק מחט / כדי lyse exosomes לחלוטין להשיג lysate הומוגנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1/10 (30 μl) נפח של מירנה homogenate האפס, ומערבבים היטב על ידי vortexing או היפוך הזמן הצינור מספר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התמהיל של 10 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח של פנול חומצה: כלורופורם שווה homogenate הראשונית (300 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של 5 fmol / μl cel-miR 39 ו מערבולת למשך 30-60 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות במשך 5 דקות ב XG 10,000 ב RT להפריד בין המימייה (עליון) ואורגניים שלבים (נמוכים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב את השלב העליון על ידי pipetting והעביר צינור טרי תוך ציון הנפח הועבר. מחק את השלב האורגני בתוך המיכל פסולת אורגנית המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעשיר את RNA קטנים להוסיף 1/3 נפח של 100% אתנול לשלב מימית התאושש ומערבבים ידי vortexing ביסודיות או היפוך tuלהיות מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את התערובת lysate / אתנול על מחסנית מסנן, עד 700 μl בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מחסניות במשך 15 שניות לכל היותר של XG 10,000 או להחיל ואקום כדי להעביר את התערובת דרך מסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את התסנין ואם תערובת lysate / אתנול עולה 700 μl, להעביר את הזרימה דרך לצינור טרי לחזור על התהליך כדי לאסוף את כל filtrates. מסנן אלה מכיל שברי RNA נטולים RNA הקטן וניתן להשתמש בו כדי לשחזר RNAs אלה גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2/3 נפח של אתנול 100% RT אל תסנין הכולל ומערבבים היטב על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את תערובת תסנין / אתנול על מחסנית מסנן שנייה. כמו לפני הנפח המקסימאלי שניתן ליישמה מייד הוא 700 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות במשך 15 שניות ב XG 10,000 או להחיל ואקום כמתואר בשלב 5.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הזרימה דרך, וחזור עד שכל תערובת תסנין / אתנול סונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 70081; l מירנה לשטוף פתרון 1 למחסנית המסננת, צנטריפוגות במשך 5-10 שניות או להחיל ואקום וזורק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את המסנן עם פתרון 500 μl לשטוף 2/3 כפי שנעשה צעד 5.16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף בפעם שנייה עם 500 μl של פתרון לשטוף 2/3 כמו בשלב 5.16, להשליך את הזרימה דרך ומניח את המסנן בחזרה צינור האיסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מחסנית מסנן דקות 1 ב XG 10,000 להסיר את כל נוזל שיורי מהמסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את המחסנית מסנן לתוך צינור איסוף טרי ולהחיל 100 μl של חם (95 ° C) מי nuclease חופשיים אל המרכז של המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מכלולים עבור 20-30 שניות במהירות המרבית כדי לשחזר את רנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את eluate ולהשתמש מיד או לאחסן ב -80 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Admyre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+with+immune+modulatory+features+are+present+in+human+breast+milk.">Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk.</a> J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).</li><li>Aushev, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+microRNA+patterns+in+plasma+before+and+after+tumor+removal+reveal+new+biomarkers+of+lung+squamous+cell+carcinoma.">Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma.</a> PLoS One. 8 (10), e78649 (2013).</li><li>Ben-Dov, I. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+microRNA+as+potential+biomarkers+of+autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease+progression:+description+of+miRNA+profiles+at+baseline.">Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline.</a> PLoS One. 9 (1), e86856 (2014).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).</li><li>Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+mechanisms+and+intercellular+transfer+of+microRNAs+in+living+cells.">Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells.</a> J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).</li><li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells.">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nat. Commun. 2, 282 (2011).</li><li>Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+miRNAs+exploiting+the+endosomal-exosomal+pathway+for+intercellular+cross-talk+and+immune+evasion.">Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).</li><li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+exosomes+educate+bone+marrow+progenitor+cells+toward+a+pro-metastatic+phenotype+through+MET.">Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET.</a> Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).</li><li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).</li><li>Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).</li><li>Bessho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+identifies+candidate+microRNAs+for+pathogenesis+of+experimental+biliary+atresia.">Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia.</a> BMC Syst. Biol. 7, (2013).</li><li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+reveals+distinct+signatures+in+B+cell+chronic+lymphocytic+leukemias.">MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).</li><li>Collins, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differential+microRNA+profile+distinguishes+cholangiocarcinoma+from+pancreatic+adenocarcinoma.">A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene.">A microRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).</li><li>Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+of+tumor-derived+exosomes+as+diagnostic+biomarkers+of+ovarian+cancer.">MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.</a> Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).</li><li>Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+microRNA:+a+diagnostic+marker+for+lung+cancer.">Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer.</a> Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li><li>Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+recognition+assay+reveals+prostasomes+as+promising+plasma+biomarkers+for+prostate+cancer.">Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer.</a> Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bile+contains+microRNA-laden+extracellular+vesicles+that+can+be+used+for+cholangiocarcinoma+diagnosis.">Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis.</a> Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).</li><li>Gabriel, D. A., Giordano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticle+sizing+and+counting+using+light+scattering+methods.">Microparticle sizing and counting using light scattering methods.</a> Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).</li></ol>

None of the authors have competing financial interests.

כדי לנצל exosomes מבודד באופן אמין מר, חשוב לנקוט אמצעי בידוד באיכות גבוהה ועקבי להשיג דגימות באיכות גבוהות בתמורה. המתודולוגיה המוגדר במאמר זה הוא דרך ומבוססת לבודד exosomes ו מירנה מן מרת אדם. זה מדגיש כמה צעדים מכריעים באפיון exosomes המבודד אשר לכל הפחות צריך מהווה במיקרוסקו...

כמו נוזלים ביולוגיים אחרים, כלומר, חלב אם, פלזמה או שתן, מרה מכילה exosomes, שלפוחית ​​עשירה שומנים 1-4. Exosomes יכול לגרום או לשנות תפקודים ביולוגיים בתאי נמען 5, 6, צורה של תקשורת בין תאים שעלול להיות חלק התפקוד התקין שלהם 4, 7-9. Exosomes יכול להכיל מיני מירנה אשר יכול לספק מקור חשוב של סמנים ביולוגיים לאבחון 10. פרופילים miRNAs שלנו זכו לתשומת לב משמעותית בשנים האחרונות כסמנים דיאגנוסטיים ופרוגנוסטיים עבור מגוון רחב של מחלות 11-14. ניתן למצוא מירנה עצמה נוזלים ביולוגיים, ואולי שפורסמו על ידי תאים מתים ואת כמות התאים המחסן יכול להיות מושפע במידה רבה על ידי המחלה הבסיסית. הפרופיל מירנה של exosomes אינו משקף בהכרח את פרופיל מירנה של שמקורם בתא 6, 10, 15-17, עדיין exosomes עשוי לשאת חתימות מירנה שעשויה להיות מאפיין עבור ce ההוריתll כמו תאים סרטניים. Exosomes הנגזרות גידול זוהתה בפלזמה של חולים עם אדנוקרצינומה ריאות, סרטן הערמונית וגידולים אחרים 8, 16, 18. המטרה של שיטה זו היא הבידוד האמין ויציב של exosomes דגימות מרת אדם, בלתי תלויות בעיקרם כיצד לטפל בדבר ומראש. הוא פותח כדי לנצל מרה כמקור אמין של מירנה לאבחון פוטנציאל של מחלות של צינור המרה כגון בכיס המרה 19. זה מורכב של מספר שלבים של צנטריפוגה עם הגדלת מהירויות לבודד exosomes ו שעשויים לחול על נוזלים ביולוגיים אחרים.

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m Polyethersulfone (PES) membrane filter</td><td>Corning</td><td>431229</td><td></td></tr><tr><td>thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>331374</td><td></td></tr><tr><td>SW40Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LM10-HS&amp;nbsp;</td><td>Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software&amp;nbsp;</td><td>Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirVANA</td><td>Life Technologies</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor</td><td>Roche distributed by Sigma-Aldrich</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon PSQ</td><td>Millipore, Bedford MA</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD63 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab59479</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tsg101</td><td>Abcam</td><td>ab30871</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and profiling of microrna-containing exosomes from human bile

מחקר Exosome בשלוש השנים האחרונות הרחיב מאוד את ההיקף לקראת זיהוי ואפיון של סמנים ביולוגיים והשימושים הטיפוליים שלהם. Exosomes הוכחו לאחרונה להכיל מיקרו-רנ&quot;א (מירס). מירס עצמם שהתעורר כסמנים ביולוגיים חשובים למטרות אבחון. כמו אוסף דגימה הניתנות במרפאות ובבתי חולים משתנה מאוד, בידוד מירנה מן המרה כולו משתנה באופן משמעותי. כדי להשיג פרופילים מירנה חזקים, מדויקים לשחזור ממדגמים מרים שנאספו בצורה פשוטה הנדרש לפיתוח פרוטוקול באיכות גבוהה לבודדים ולאפיין exosomes מן המרה. השיטה מחייבת מספר centrifugations וצעד סינון עם צעד ultracentrifugation סופי כדי גלול exosomes המבודד. מיקרוסקופי אלקטרונים, כתמים מערביים, cytometry זרימה וניתוח אופטי ננו-חלקיקים רב-פרמטר, הדבר אפשרי, הם צעדי אפיון חיוניים כדי לאמת את איכות exosomes. עבור הבידוד של מירנה מן exosomes אלה, תוקע את lysate עם מירנה שאינו ספציפי, סינטטי מזן כמו elegans Caenorhabditis, כלומר, Cel-miR-39, חשובים לנורמליזציה של יעילות מיצוי RNA. בידודו של exosome מנוזל המרה הבא שיטה זו מאפשר מירנה המוצלחת פרופיל ממדגמים מרים מאוחסנים במשך מספר שנים ב -80 מעלות צלזיוס.

מאז exosomes הם קטנים מדי כדי להיות מזוהים על ידי מיקרוסקופיה רגיל או cytometry זרימה, מיקרוסקופ אלקטרונים או ניתוח ננו-חלקיקים אופטיים צריך להתבצע. הניתוח האופטי nanoparticle יש יתרון על פני במיקרוסקופ אלקטרונים שזה גם כמותית ומספק התפלגות גודל וריכוז. המכשיר מ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile at JoVE.com

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

בידוד Profiling של MicroRNA המכיל Exosomes מן האדם מר

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

isolation-profiling-microrna-containing-exosomes-from-human

Research

JoVE Journal

Medicine

10.2K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine. Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Video: Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most interestingly, sRNAs are also found outside of cells and are stably present in all biological fluids. As such, extracellular sRNAs represent a novel class of disease biomarkers and are likely involved in cell signaling and intercellular communication networks. To assess their potential as biomarkers, sRNAs can be quantified in plasma, urine, and other fluids. Nevertheless, to fully understand the impact of extracellular sRNAs as endocrine signals, it is important to determine which carriers are transporting and protecting them in biological fluids (e.g., plasma), which cells and tissues contribute to extracellular sRNA pools, and cells and tissues capable of accepting and utilizing extracellular sRNA. To accomplish these goals, it is critical to isolate highly pure populations of extracellular carriers for sRNA profiling and quantification. We have previously demonstrated that lipoproteins, particularly high-density lipoproteins (HDL), transport functional microRNAs (miRNA) between cells and HDL-miRNAs are significantly altered in disease. Here, we detail a new protocol that utilizes tandem HDL isolation with density-gradient ultracentrifugation (DGUC) and fast-protein-liquid chromatography (FPLC) to obtain highly pure HDL for downstream profiling and quantification of all sRNAs, including miRNAs, using both high-throughput sequencing and real-time PCR approaches. This protocol will be a valuable resource for the investigation of sRNAs on HDL.

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה עבור Non-קידוד RNA קטנים כימות

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Biochemistry

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, and intrinsic capability in intercellular delivery of various biomolecules. This work establishes an isolation protocol to achieve high yield and high purity of exosomes for siRNA delivery. Human Embryonic Kidney cells (HEK-293 cells) are cultured in bioreactor flasks and the culture supernatant (hereon referred to as conditioned medium) is harvested on a weekly basis to allow for enrichment of HEK-293 exosomes. The conditioned medium (CM) is pre-cleared of dead cells and cellular debris by differential centrifugation and is subjected to ultracentrifugation onto a sucrose cushion followed by a washing step, to collect the exosomes. Isolated HEK-293 exosomes are characterized for yield, morphology and exosomal marker expression by nanoparticle tracking analysis, protein quantification, electron microscopy and flow cytometry, respectively. Small interfering RNA (siRNA), fluorescently labeled with Atto655, is loaded into exosomes by electroporation and excess siRNA is removed by gel filtration. Cell uptake in PANC-1 cancer cells, after 24 h incubation at 37 &#176;C, is confirmed by flow cytometry. HEK-293 exosomes are 107.0 &#177; 8.2 nm in diameter. The exosome yield and particle-to-protein ratio (P:P) ratio are 6.99 &#177; 0.22 &#215; 1012 particle/mL and 8.3 &#177; 1.7 &#215; 1010 particle/&#181;g, respectively. The encapsulation efficiency of siRNA in exosomes is ~ 10-20%. Forty percent of the cells show positive signals for Atto655 at 24 h post-incubation. In conclusion, exosome isolation by ultracentrifugation onto sucrose cushion offers a combination of good yield and purity. siRNA could be successfully loaded into exosomes by electroporation and subsequently delivered into cancer cells in vitro. This protocol offers a standard procedure for developing siRNA-loaded exosomes for efficient delivery to cancer cells.

An exosome is a new generation of drug delivery carriers. We established an exosome isolation protocol with high yield and purity for siRNA delivery. We also encapsulated fluorescently labelled non-specific siRNA into exosomes and investigated the cellular uptake of siRNA-loaded exosomes in cancer cells.

הכנה של Exosomes siRNA מסירה תאים סרטניים

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Cancer Research

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, milk and urine. One subset of these RNAs are the posttranscriptional regulators &#8211; microRNAs (miRNAs). To delineate the miRNAs produced by specific cell types, in vitro culture systems can be used to harvest and profile exRNAs derived from one subset of cells. The secreted factors of mesenchymal stem cells are implicated in alleviating numerous diseases and is used as the in vitro model system here. This paper describes the process of collection, purification of small RNA and library generation to sequence extracellular miRNAs. ExRNAs from culture media differ from cellular RNA by being low RNA input samples, which calls for optimized procedures. This protocol provides a comprehensive guide to small exRNA sequencing from culture media, showing quality control checkpoints at each step during exRNA purification and sequencing.

This protocol demonstrates how to purify extracellular microRNAs from cell culture media for small RNA library construction and next generation sequencing. Various quality control checkpoints are described to allow readers to understand what to expect when working with low input samples like exRNAs.

בידוד, קביעת רצף וניתוח מיקרו Rna חוץ-תאי של גזע Mesenchymal אנושי

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Genetics

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

בידוד של Exosomes מהפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Immunology and Infection

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Biology

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during physiological and pathological states. The isolation of EVs continues to be a major challenge in this field, due to limitations intrinsic to each technique. The differential ultracentrifugation with density gradient centrifugation method is a commonly used approach and is considered to be the gold standard procedure for EV isolation. However, this procedure is time-consuming, labor-intensive, and generally results in low scalability, which may not be suitable for small-volume samples such as bronchoalveolar lavage fluid. We demonstrate that an ultrafiltration centrifugation isolation method is simple and time- and labor-efficient yet provides a high recovery yield and purity. We propose that this isolation method could be an alternative approach that is suitable for EV isolation, particularly for small-volume biological specimens.

Here, we describe two extracellular vesicle isolation protocols, ultrafiltration centrifugation and ultracentrifugation with density gradient centrifugation, to isolate extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid samples. The extracellular vesicles derived from murine bronchoalveolar lavage fluid by both methods are quantified and characterized.

בידוד של שלפוחית חוץ-תאי של נוזל שטיפה Bronchoalveolar מאתר באמצעות טכניקת צנטריפוגה אולטראפילטרציה

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs are protected from degradation by sequestration in small vesicles called exosomes. Exosomes can fuse with the plasma membrane resulting in the transfer of RNA and proteins to the target cell. Their biological functions include immune response, antigen presentation, and intracellular communication. Delivery of miRNAs that can regulate gene expression in the recipient cells via blood has opened novel avenues for target intervention. In addition to offering a strategy for delivery of drugs or RNA therapeutic agents, exosomal contents can serve as biomarkers that can aid in diagnosis, determining treatment options and prognosis.	Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.	
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media.	
 Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media

The presence of stable microRNAs (miRNAs) in exosomes has generated immense interest as a novel mode of intercellular communication, for their potential utility as biomarkers and as a route for therapeutic intervention. Here we demonstrate exosome purification from blood and culture media followed by quantitative PCR to identify miRNAs being transported.

טיהור וmicroRNA פרופיל של Exosomes נגזר מדיה דם ותרבות

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

בידוד של קטן noncoding RNAs מסרום האדם

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

MicroRNAs play an important regulatory role and are emerging as novel therapeutic targets for various human diseases. It has been shown that miRNAs are carried in high density lipoproteins. We have developed a simplified method to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from human plasma.

שיטה מהירה ופשוטה עבור בידוד גבוה באמצעות-לשים של מירנה מן ליפופרוטאין בצפיפות הגבוה מאוד מטוהר

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...