This research was performed while the author (JAM) held a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratories. Co-author MW held a Wright Scholar Fellowship supported by the Air Force Office of Scientific Research. This work was supported by Air Force Office of Scientific Research, Air Force Research Laboratory, and Bio-X Strategic Technology Thrust.

<ol>
	<li>McKeague, M., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+small+molecule+aptamer+development.">Challenges and opportunities for small molecule aptamer development.</a> J. Nucleic Acids. 2012, 1-20 (2012).</li><li>Gatti, R., Antonelli, G., Prearo, M., Spinella, P., Cappellin, E., De Palo, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortisol+assays+and+diagnostic+laboratory+procedures+in+human+biological+fluids.">Cortisol assays and diagnostic laboratory procedures in human biological fluids.</a> Clin. Biochem. 42, 1205-1217 (2009).</li><li>Morgan, C. A., Wang, S., Rasmusson, A., Hazlett, G., Anderson, G., Charney, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+among+plasma+cortisol,+catecholamines,+neuropeptide+Y,+and+human+performance+during+exposure+to+uncontrollable+stress.">Relationship among plasma cortisol, catecholamines, neuropeptide Y, and human performance during exposure to uncontrollable stress.</a> Psychosom. Med. 63 (3), 412-422 (2001).</li><li>Michael, D. J., Valle, B., Cox, J., Lalns, J. E., Fogt, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+Biomarkers+of+Physical+Fatigue+as+Markers+of+Sleep+Deprivation.">Salivary Biomarkers of Physical Fatigue as Markers of Sleep Deprivation.</a> J. Clin. Sleep Med. 9 (12), 1325-1331 (2013).</li><li>Kwak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+biomarkers+from+human+melanoma+cells.">Volatile biomarkers from human melanoma cells.</a> J. Chrom. B. 931, 90-96 (2013).</li><li>Stevens, R. C., Soelberg, S. D., Near, S., Furlong, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Cortisol+in+Saliva+with+a+Flow-Filtered,+Portable+Surface+Plasmon+Resonance+Biosensor+System.">Detection of Cortisol in Saliva with a Flow-Filtered, Portable Surface Plasmon Resonance Biosensor System.</a> Anal. Chem. 80 (17), 6747-6751 (2008).</li><li>Arya, S. K., Ghornokur, G., Venugopal, M., Bhansali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+functionalized+interdigitated+&#956;-electrode+(ID&#956;E)+based+impedimetric+cortisol+biosensor.">Antibody functionalized interdigitated &#956;-electrode (ID&#956;E) based impedimetric cortisol biosensor.</a> Analyst. 135 (8), 1941-1946 (2010).</li><li>Kapczinski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allostatic+load+in+bipolar+disorder:+Implications+for+pathophysiology+and+treatment.">Allostatic load in bipolar disorder: Implications for pathophysiology and treatment.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 32 (4), 675-692 (2008).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li><li>Ciesiolka, J., Gorski, J., Yarus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+RNA+domain+that+binds+Zn2.">Selection of an RNA domain that binds Zn2.</a> RNA. 1 (5), 538-550 (1995).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Aptamers+Specific+for+Adipose+Tissue.">Selection of Aptamers Specific for Adipose Tissue.</a> PlosOne. 7, e37789 (2012).</li><li>McCauley, T. G., Hamaguchi, N., Stanton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-based+biosensor+arrays+for+detection+and+quantification+of+biological+macromolecules.">Aptamer-based biosensor arrays for detection and quantification of biological macromolecules.</a> Anal. Biochem. 319 (2), 244-250 (2003).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+label-free+electrochemical+biosensor+based+on+a+DNA+aptamer+against+codeine.">A label-free electrochemical biosensor based on a DNA aptamer against codeine.</a> Anal. Chim. Acta. 787, 203-210 (2013).</li><li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SELEX&#8212;A+(r)evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands.">SELEX&#8212;A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomol. Eng. 24 (4), 381-403 (2007).</li><li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+An+Emerging+Class+of+Molecules+That+Rival+Antibodies+in+Diagnostics.">Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics.</a> Clin Chem. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li><li>Morse, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+selection+of+RNA+beacon+aptamers.">Direct selection of RNA beacon aptamers.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 94-101 (2007).</li><li>Nutiu, R., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Switching+Signaling+Aptamers.">Structure-Switching Signaling Aptamers.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (16), 4771-4778 (2003).</li><li>Luo, F., Zheng, L., Chen, S., Cai, Q., Lin, Z., Qiu, B., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+aptamer-based+fluorescence+biosensor+for+multiplex+detection+using+unmodified+gold+nanoparticles+Chem.">An aptamer-based fluorescence biosensor for multiplex detection using unmodified gold nanoparticles Chem.</a> Commun. 48 (51), 6387-6389 (2012).</li><li>Li, H., Rothberg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Colorimetric+Detection+of+Specific+Sequences+in+Genomic+DNA+Amplified+by+the+Polymerase+Chain+Reaction.">Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).</li><li>Ch&#225;vez, J. L., MacCuspie, R. I., Stone, M. O., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+with+aptamer&#8211;gold+nanoparticle+conjugates:+effect+of+aptamer+length+on+response.">Colorimetric detection with aptamer&#8211;gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response.</a> J. Nanopart. Res. 14 (9), 1166-1177 (2012).</li><li>Hagen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofunctionalized+Zinc+Oxide+Field+Effect+Transistors+for+Selective+Sensing+of+Riboflavin+with+Current+Modulation.">Biofunctionalized Zinc Oxide Field Effect Transistors for Selective Sensing of Riboflavin with Current Modulation.</a> Sensors. 11 (7), 6645-6655 (2011).</li><li>Han, K., Liang, Z., Zhou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Strategies+for+Aptamer-Based+Biosensors.">Design Strategies for Aptamer-Based Biosensors.</a> Sensors. 10 (5), 4541-4557 (2010).</li><li>Martin, J. A., Ch&#225;vez, J. L., Chushak, Y., Chapleau, R. R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+stringency+aptamer+selection+and+gold+nanoparticle+assay+for+detection+of+cortisol.">Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).</li><li>Hall, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+and+Amplification+of+DNA+Pools+for+In+Vitro+Selection.">Synthesis, and Amplification of DNA Pools for In Vitro Selection.</a> Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 39, 9.2.1-9.2.28 (2009).</li><li>Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O&#8217;Donoghue, M. B., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+DNA+aptamers+using+Cell-SELEX.">Development of DNA aptamers using Cell-SELEX.</a> Nat. Protoc. 5 (6), 1169-1185 (2010).</li><li>Djordjevic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SELEX+experiments:+New+prospects,+applications+and+data+analysis+in+inferring+regulatory+pathways.">SELEX experiments: New prospects, applications and data analysis in inferring regulatory pathways.</a> Biomol. Eng. 24 (2), 179-189 (2007).</li><li>Thomas, J. R., Hergenrother, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RNA+with+Small+Molecules.">Targeting RNA with Small Molecules.</a> Chem. Rev. 108 (4), 1171-1224 (2008).</li><li>Jing, M., Boswer, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Methods+for+Measuring+Aptamer-Protein+Equilibria.">A Review of Methods for Measuring Aptamer-Protein Equilibria.</a> Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-12 (2011).</li><li>Sachs, E. -. F., Diederichsen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Binding of Triostin Analogues to DNA. , (2011).</li><li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+aptamer-linked+gold+nanoparticle+purple+aggregates+for+colorimetric+sensing+of+analytes.">Preparation of aptamer-linked gold nanoparticle purple aggregates for colorimetric sensing of analytes.</a> Nat. Protoc. 1 (1), 246-252 (2006).</li><li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+selection+of+DNA+aptamers+through+microfluidic+selection+and+high-throughput+sequencing.">Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (35), 15373-15378 (2010).</li><li>Martin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+Aptamer+Antidote+to+the+Anticoagulant+Drug+Bivalirudin.">Selection of an Aptamer Antidote to the Anticoagulant Drug Bivalirudin.</a> Plos One. 8 (3), e57341 (2013).</li><li>Sch&#252;tze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+SELEX+Process+with+Next-Generation+Sequencing.">Probing the SELEX Process with Next-Generation Sequencing.</a> Plos One. 6 (12), e29604 (2011).</li><li>Kupakuwana, G. V., Crill, J. E., McPike, M. P., Borer, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclic+identification+of+aptamers+for+human+alpha-thrombin+using+over-represented+libraries+and+deep+sequencing.">Acyclic identification of aptamers for human alpha-thrombin using over-represented libraries and deep sequencing.</a> Plos One. 6 (5), (2011).</li><li>Smith, J. E., Griffin, D. K., Leny, J. K., Hagen, J. A., Ch&#225;vez, J. L., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+detection+with+aptamer-gold+nanoparticle+conjugates+coupled+to+an+android-based+color+analysis+application+for+use+in+the+field.">Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field.</a> Talanta. 121, 247-255 (2014).</li><li>Chatterton Jr, R. T., Vogelsong, K. M., Lu, Y. -. C., Hudgens, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+Responses+to+Psychological+Stress+in+Men+Preparing+for+Skydiving.">Hormonal Responses to Psychological Stress in Men Preparing for Skydiving.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (8), 2503-2509 (1997).</li><li>Gold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-Based+Multiplexed+Proteomic+Technology+for+Biomarker+Discovery.">Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery.</a> Plos One. 5 (12), (2010).</li><li>Musheev, M. U., Krylov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+aptamers+by+systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+Addressing+the+polymerase+chain+reaction+issue.">Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Addressing the polymerase chain reaction issue.</a> Anal. Chim. Acta. 564 (1), 91-96 (2006).</li><li>Wiebe, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+metabolites+in+breast+cancer.">Progesterone metabolites in breast cancer.</a> Endocr.-Relat. Cancer. 13 (3), 717-738 (2006).</li></ol>

הצהרת הפצה: מאושר לשחרור ציבורי; ההפצה היא בלתי מוגבלת (88 ABW-2,014-4,103). המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

העובדה שמולקולות קטנות הן עניין ביולוגי, אלא רק מהוות 19% מכלל aptamers דיווחה הופכת שיטות שנועדו לבחירת aptamers החלימה על מולקולות קטנות של משמעות רבה. SELEX של מולקולות קטנות הוא מאתגר במיוחד כקבוצות פחות פונקציונליות, מוטיבים מבניים, ופני שטח זמינים לאינטראקציה עם רצפים בהשוואה לחלבוני 1, וזה כבר העריך כי פחות מ -30% מבחירות לכל המטרות ניסו הביאו aptamer 38. לכן, אחד חייב להיות מודע במיוחד של תכנון וביצוע ניסויי על מנת לבחור aptamer ליעד מולקולה קטן בהצלחה. שיטת בחירת aptamer המתוארת בעבודה זו היא יתרון משום שהוא חל על מולקולות קטנות ללא צורך בשינוי כימי שעשויים לשנות את מאפייני מחייבם. זה גם elution מבוססת, מה שאומר שמאז tהוא DNA, ולא היעד, תחילה מחויב אז eluted מן חרוזים המגנטיים על ידי היעד, DNA אינטראקציה עם מטריצת חרוז לא להיות מוגבר לסיבוב הבחירה הבא בגלל קלסרים למולקולה של העניין משתחררים לחיץ supernatant וקלסרים מטריצה ​​ספציפיים יישארו כבול. לעומת זאת, שיטה שלילית בחירה נגד מטריקס נדרש לשיטות שלשתק את היעד לתמיכה המוצקה בכל סיבוב, כי ה- DNA שאינטראקציה עם המטריצה ​​יהיה מוגבר בנוסף לקלסרים היעד 1. השיטה הנוכחית תוכננה כאסטרטגיה מבחר המצומצם T מ &#39;. משמעות דבר היא כי מ &#39;T של הכלאה / בריכת cDNA נשמר קרוב לRT. מורס משמש אסטרטגיה דומה, אבל מיושם בדיקה cDNA 6-mer עם T מ &#39;&lt;10 ° C עם תנאי בחירה על 4 מעלות צלזיוס 17. היישום שלנו היה לassay biosensing בוצע ב RT, כך אורכו של cDNA הותאם לפיly. דבר זה שומר את ההחמרה של מבחר הנמוך מספיק כדי שקלסרים פוטנציאל לא הולכים לאיבוד בגלל האינטראקציה מחייבת היעד מתרחשת במיקום מרוחק שלא לגרום לשינוי קונפורמציה מסוגל לשבש cDNA מחייב. עם זאת, יעילות חלוקת השיטה המוצעת היא נמוכה בגלל כמה רצפים יהיו dehybridize מבוסס אך ורק על תרמודינמיקה. בניגוד לכך, Nutiu מיושם et al. CDNA 15 mer-, והיו רק מסוגל לזהות aptamers לשניים מארבע המטרות, אולי בגלל T מ &#39;של 15 mer-היה גבוה מכדי לאפשר שחרור על ידי יעד מולקולה קטן 18. לכן, בעוד שאסטרטגית הבחירה הנוכחית תדרוש סיבובים רבים כדי להסיר רצפי רקע, על ידי שליטה על החומרה של הבחירה ומזעור אובדן קלסרים פוטנציאל סיכויי הצלחה של יוגדלו. חוקרים רבים חדשים לבחירת aptamer אינם מודעים להיבטים חשובים הקשורים לPCR שלקלסרים פוטנציאליים. אופטימיזציה מחזור (סעיף 4.5) נחוצה משום-הגברה מעל ספריות DNA מייצרת לא רצויה על ידי-מוצרים (בדרך כלל גדולים יותר בגודל) במספרי מחזור גבוהים, ואת המוצר הרצוי עלול להיעלם לחלוטין עם עודף של רק 5 מחזורים 39. במקרה של הגברה מעל, מוצרי PCR כבר לא מייצגים אותם רצפי eluted על ידי היעד, ואת סיכויי הצלחת בחירה הם פחתו באופן משמעותי. איור 4 ממחיש דוגמא של מחזור אופטימיזציה מסיבוב 5 בעבודה זו. המחזור הנמוך ביותר מייצר להקת מוצר מינימאלית, עולה להקה בסכום עד 8 מחזורים; בשעה 10 במחזורים הלהקה מתחילה מעבר למוצר על-הגברה גודל גבוה יותר, והוא כמעט שכולו המוצר-מוגבר מעל תוך 12 מחזורים. פרט נוסף שחוקרים רבים חסרי הניסיון בSELEX יכולים להתעלם הוא שכל הבריכה צריכה להיות מוגברת בהגברת PCR בקנה מידה הגדולה (סעיף 4.6) באשוחרח &#39;סיבוב כדי להקטין אובדן קלסרים. מספר הרצפים אפשריים ייחודיים מoligonucleotides הוא 4 N, שבו 4 מייצג את ארבעת בסיסי חומצות גרעין, וN הוא מספר הבסיסים באזור של הספרייה האקראי. עבור עבודה זו, N = 40, וכתוצאה מכך חלל רצפים של 1.2 x 10 24 רצפים ייחודיים אפשריים. 2.5 nmol של ספרייה משמשת בסיבוב הראשון של בחירה מתאימה ל~ 10 15 מולקולות, כלומר כל עותק של ה- DNA סביר מיוצג בבריכה הראשונית כרצף ייחודי. לכן, כל הנפח של DNA eluted מן החרוזים על ידי היעד חייב להיות מוגבר כדי לשמור עותק של כל קלסר פוטנציאלי לסיבוב הבחירה הבא. ברגע שהגברה ראשונית זה התרחשה, מספר עותקים זמינים לבחירה בסיבובים הבאים שבו פתרון הומוגני הנחה לדגימה. גם הריכוז של היעד יש לשקול בזהירות בכל סיבוב. Nutiu et al. שימושריכוז da של 1 מ&quot;מ יעד לאורך כל תהליך הבחירה, ונבחר aptamer ATP עם ד K = 600 מיקרומטר 18. שניהם העבודה הנוכחית והמחקר של מורס 17 התחילו עם 100 מיקרומטר יעד, ירידה לאורך הקורס של הבחירה, והביאו aptamers עם זיקה מייקרו נמוכה. בדיוק איזה סיבוב ההחמרה צריך להיות מוגבר (ריכוז היעד נמוך יותר) תלוי מתי העשרה הוא ציין. עוד צעד קריטי הוא ליישם צעדי סלקציה שליליים נכונים כל כך aptamers להפגין ספציפי למולקולת היעד. השולט משמשים מותנה ביישום המיועד של aptamer נבחר. לדוגמא, aptamer 15-1 נועד לתפקד כאלמנט הכרה בassay biosensing לקורטיזול, כך פרוגסטרון שימש כמולקולת סלקציה שלילית משום שהוא מבשר חילוף חומרים לקורטיזול, כי הוא נמצא בנוזלים פיסיולוגיים 40. Aptamer ATP שנבחר על ידי et al Nutiu. &lt;/ Em&gt; לא כלל שלב סלקציה שלילי, ואינטראקציה עם מולקולות דומות מבני כוללים ADP, AMP, אדנוזין, וdATP 18. הערה אחרונה בתמורה היא שassay AuNP לעתים קרובות דורש אופטימיזציה רבה לכל זוג aptamer / יעד. מחפש את עוצמת הקול של מלח שגורם לשינוי בקושי חזותי בולט לכיוון גוון כחול לאחר תוספת מלח הוא נקודת התחלה טובה, אבל התאמה של נקודת ההתחלה ייתכן שתהיה צורך לבחון את התגובה. יש לנו גם מצאתי כי assay מייצר תגובות שונות באופן דרסטי בהתאם לריכוז חיץ (חיץ הבחירה עשוי לדרוש דילול בגלל ריכוז מלח הגבוה של מאגרים לעתים קרובות גורם לצבירה) והרכבו, מידת כיסוי DNA (איור 3), הכנת מדגם (חלק אורגני ממסים המשמשים להמסת היעד עלולים לגרום רקע גבוה שמסכות למקד תגובה), טמפרטורה, סוג מלח וריכוז, ואינקובטוריםזמן tion (של שני DNA עם AuNP וDNA / AuNP עם יעד). בתנאים מותאמים באופן מלא, תוצאות נצפו בדרך כלל עם &lt;דקות זמן דגירה יעד 5, הממחישות את התועלת של תגובה מהירה יעד של פלטפורמת biosensing AuNP. לדוגמא, באיור 5 זמן הדגירה של aptamer / צעד AuNP הופחת מ O / N (איור 3) עד 30 דקות, ומלח התווסף מייד (&lt;10 שניות) לאחר תוספת היעד ולא 20 דקות מאוחר יותר (איור 3 ) בצפיפות טעינה של 73 D / NP. זה הגדיל את תגובת הקורטיזול ל~ 82% גבוהים יותר מאשר (איור 5 א) הריקים בריכוז 10 מיקרומטר יעד לעומת ~ 40% באמצעות התנאים הקודמים (איור 3). תגובה זו יכולה להיות מכובדת בעין בלתי מזוינת (איור 5). שים לב שהטווח ליניארי של זיהוי קורטיזול הוא שונה מאשר שימוש בתנאים הקודמים, מצביע על כך שתנאים אלה יכולים להיות מותאמים לרצוייםטווח גילוי. חומצת כולית ובקרות 2-methoxynaphthalene (2MNP) לא הניבו תגובה משמעותית (איורים 5 א-ב). חוקרים חייבים להיות מודעים לכך שצמצום זמני דגירה אלה עשויים להקל על תגובה מוגברת של analytes עם משטח AuNP, אשר יכול לתרום לאות כוללת משופרת (יעד) או רקע (מולקולות שאינם יעד). לכן, אפיון עיצוב assay וביצועים זהיר AuNP הוא הכרחי עבור כל זוג aptamer / יעד. הליך זה מתאר את פרוטוקול לבחירת aptamers קטנה מולקולה-מיתוג מבנה שפועלות בפלטפורמת biosensing כגון assay AuNP המתואר, הדורש שינוי קונפורמציה של DNA כדי לזהות הנוכחות של היעד. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות biosensor אחרות כגון אלקטרוכימיים או הקרינה המתפקדות באותה הנחת היסוד עבור כמעט כל יעד בגודל. כוחו של הפרוטוקול ניתן לפתח בניסוי נוסף על ידיכמה גישות. ראשית, הבחירה עצמה עשויה להיות שיפור פוטנציאלי על ידי חקירת שיטות של אופטימיזציה כגון קביעת T מ &#39;האידיאלי של הכלאה / ספריית cDNA המספקת אינטראקציה שהיא חלש מספיק כדי אינטראקציה עם יעד מולקולה קטן, אך חזק מספיק כדי להפחית את הכמות רקע רצפים dehybridized אך ורק מתרמודינאמיקה. זה לדחוס מספר המחזורים הנדרשים לבחירה, תוך חיסכון בזמן בעבודה והפחתת הצריכה מגיב. חקירות נוספות לשינויים בבחירה תהיה לקבוע את הריכוזים החיוביים ביותר של חרוזים ו- DNA, כך שאוכלוסייה מגוונת של רצפים חשופה ליעד, במיוחד בסיבוב הראשון. ההצלחה של ניסויי הוכחה של עיקרון אלה מספקת תשתית להשקיע משאבים נוספים לקראת אופטימיזציה והתאמת assay חיץ AuNP לנוזלים פיסיולוגיים. יש צורך לגיטימי לפלטפורמת biosensing מהירה, חזקה שיכול פוnction ככלי אבחון של המצב הפיזיולוגי של אדם, ופיתוח נוסף של assay AuNP בסרום אנושי, זיעה, או רוק יפגוש פער הנוכחי.

מולקולות קטנות כבר מזמן מוכרות כממלא תפקידים חיוניים בתהליכים ביולוגיים מגוונים כגון רעילות פיזיולוגית או תזונה, איתות תא, וטיפולי תרופות למחלות כמו 1. מולקולות קטנות שונות יש גם הציעו כסמנים ביולוגיים מעידים על תנאים פיסיולוגיים כוללים לחץ 2,3, עייפות 4, ומחלה 5. לדוגמא, רמות הקורטיזול גבוהות לתאם עם לחץ אשר עלול לגרום לביצועים פיסיולוגיים ירדו ומצבים בריאותיים אחרים 6-8. כמו כן, שינויים ביחסים של פפטידים מסוימים ברוק הם ניבוי של עייפות, שבו תופעות פיסיולוגיות כוללות חוסר הריכוז, זמן תגובה לקוי, ותפקוד הקוגניטיבי מופחת 4. לכן, הפיתוח של חיישנים ביולוגיים יעד ספציפי כדי לפקח על הרמות של מולקולות קטנות עשוי לספק מדד לא יסולא בפז להערכת יכולות בריאות וביצועים של individual. מבחינה הסטורית, גילוי מולקולה קטן שבוצע על ידי טכניקות הפרדה עתירת עבודה או על ידי הכרה מבוססת נוגדן 6,7. לאחרונה, aptamers חומצות גרעין 9,10 צמחה כאלמנטים הכרה בכך שיש יתרונות ברורים על פני נוגדנים ביישומים ספציפיים. עם היכולת שלהם להיקשר יעד שונה בגודל מיוני מתכת 11 לרקמות 12, aptamers כבר מיושמת באופן נרחב כאלמנטים הכרה בפלטפורמות biosensing 13,14. בהשוואה לנוגדנים, aptamers כימית מסונתזת, ולכן פשוט להציג שינויים כימיים לשחזור לקיבוע משטח או דיווח. ניתן לבחור Aptamers עם סגוליות גבוהות יעד בתנאים הרצויים על ידי שינוי תנאי הבחירה בשימוש, ואילו נוגדנים מוגבלים לתנאים פיסיולוגיים 15,16. בנוסף, aptamers מסוגלות צפיפות יגנד גבוהה יותר בשל הEIR גודל קטן יותר, וכתוצאה מכך היעד גבוה איתות יעילות על פלטפורמת biosensor, והיציבות המשופרת של aptamers מאפשרת שימוש חוזר ואחסון חיישן לטווח ארוך 16. Aptamers נוצרים באמצעות הליך המכונה SELEX, שבו ספרייה ראשונית של רצפים הוא התפתחה 10 13 -10 15 מולקולות ייחודיות לברכה סופית מועשרת המכילה מספר (10 1 -10 2) רצפים עם פוטנציאל לקשור מולקולת היעד. הבריכה מועשרת הסופית לאחר מכן רצף, וקבועי דיסוציאציה (ד K) מתקבלים ממחייבים מבחני של רצפי עותק המספר הגבוהים ביותר עם ​​מולקולת היעד. אבולוציה של הבריכה לאוכלוסייה מועשרת סופית במעקב על ידי ניטור אחוז הבריכה מחייבת היעד בכל סיבוב, עד העשרה המרבית מתקבלת. זה מתרחש על פני מספר סיבובי אבולוציוני, שבו רצפים מחייבים הינן מחיצות מnonbinders וamplified באמצעות תגובת השרשרת של פולימראז (PCR). היכולת לחלק בצורה יעילה ולשמר קלסרים היא אחד מהגורמים העיקריים ליעילות של השפעות בחירה ובאופן ישיר את המאפיינים של aptamers נבחר 15. שלב מחיצות SELEX הוא מאתגר יותר עבור מולקולות קטנות כיוון שהם לא מחזיקים את הגודל או מגוון של קבוצות פונקציונליות המסייעות בתהליך חלוקת מטרות חלבון 1,15. לדוגמא, פלטפורמות מחיצות חלבון רבות מסתמכות על גודל או הפרדה מבוססת תשלום, עם זאת את המאפיינים של מתחמי יעד כרוכים DNA-קטן מולקולה הם בדרך כלל לא שונים באופן משמעותי מזה של רצפים בלתי מחייבים, וכתוצאה מכך לא יעילות מחיצות 1. שיטות מחיצות SELEX חלופיות עשויות להיות כרוכה בחוסר תנועה או תיוג של היעד, אשר באופן פוטנציאלי לשנות את המאפיינים המחייבים של מולקולה קטנה. כתוצאה מכך, עיצוב של הליך בחירה כדי ליצור aptamers למולקולה קטנה מטרות requires התייחסות מיוחדת. מגוון של שינויים הוחלו על המתודולוגיה SELEX המקורית כדי לשפר את יעילות החלוקה של ההליך, לשפר את הזיקה או סגוליות של הרצפים בבריכה הסופית, או להפוך אותו נוח יותר ליישומים שונים 15,16. שינוי SELEX אחד מסוגל בחירה למולקולות קטנות נועד ליצור aptamers-מיתוג מבנה, או aptamers שעובר שינוי קונפורמציה על אינטראקציה עם מולקולת יעד 17,18. בדוגמא אחת של שיטה זו, ספריית הכלאה לקטע קצר של DNA משלים לא מחייב (cDNA) משותק על חרוזים מגנטיים 17. על היעד מחייב, השינוי קונפורמציה של רצפי מחייב מאפשר להם dehybridize מcDNA, משחרר אותם לפתרון supernatant, בעוד nonbinders נותר הכלאה לcDNA / חרוזים מגנטיים למחיצות וזנוח. שיטה זו היא advantageous למולקולות קטנות, כי היא אינה דורשת קיבוע או תיוג של מולקולת היעד כדי להשיג הפרדה. Aptamers המסוגלים מבנה מיתוג יש תכונה רבת ערך עבור כל פלטפורמת biosensor פוטנציאלית שמחייבת שינוי במבנה aptamer כדי לזהות הנוכחות של מולקולת יעד. באופן ספציפי, ניתן לשלב aptamers עם חלקיקי זהב (AuNPs) כדי ליצור מבחני שפועלים על בסיס העיקרון-מיתוג המבנה לייצר תגובת colorimetric בנוכחות מולקולת היעד לאחר אתגר מלח 19,20. בassay AuNP, aptamer דנ&quot;א חד-גדילים (ssDNA) תחילה adsorbs אל פני השטח AuNP ומגן עליו מאתגר מלח. הנוכחות של היעד גורמת לשינוי קונפורמציה בaptamer שחושף את פני השטח AuNP, וכתוצאה מכך שינוי צבע אדום-כחול-לבא בנוסף מלח. AuNP מבחני גם הוכחו כדי להגביר אות, שבו aptamer זיקת מייקרוים יכול לזהות יעד בהזמנות רמות גודל נמוך מקבוע דיסוציאציה (ד K) 21. תכונה זו היא אטרקטיבית במיוחד למטרות מולקולה קטנות, שבו זיקות בדרך כלל נעות בין מייקרו הנמוך לריכוזי millimolar 1,15. בדרך כלל, assay הוא גם מהיר ופשוט יחסית לביצוע, עידוד מחקר נוסף של מבחני aptamer-AuNP כפלטפורמות גילוי biosensor. מטרת עבודה זו היא לספק פרוטוקול אוניברסלי לבחירת aptamers-מיתוג מבנה למולקולות קטנות עבור יישומי biosensing באמצעות קורטיזול סמן מתח כמולקולת נציג. ערכת זיהוי biosensor AuNP היא עניין בשל פשטותו של מבצע וקריאת colorimetric, אבל aptamers-מיתוג מבנה חלות על תפוקות פלטפורמת חישה חלופיות, כגון 22 אלקטרוכימיים או הקרינה 23 שגם מספקים זיהוי באמצעות שינוי בconformatio aptamern על היעד מחייב. בהשוואה לשיטות קודמות, צעדי סלקציה שליליים מרובים שולבו בעיצוב 17,18, וערכת זיהוי העשרה מבוססת UV פשוט יושמה (איור 1). פרוטוקול זה הוא בניגוד לתכנית איתור העשרת radioligand שימוש בשיטות מורשה 17. השיטה המוצעת גם שולבה עלייה באורך של בדיקות לכידת cDNA משמשות בבחירה כדי להגביר את יעילות מחיצות וביעילות מנגינה ההחמרה של מבחר לאחר העשרה מקסימלי נצפתה 24. העופרת מכוונת ההחמרה לשיעור כולל נמוך יותר של ה- DNA eluted על ידי היעד בבריכה הסופית, אבל הביאה למספרים גבוהים יותר של עותק רצף שקשרו עם זיקה משופרת בהשוואה לרצף מספר העותק הגבוה ביותר מסיבוב קודם. רצף מספר העותק הגבוה ביותר מהברכה האחרונה היה מוחל על assay AuNP כדי להמחיש כי הרצף היה נוח לפלטפורמהשדורש שינוי מבני כדי לציין יעד מחייב. assay החיץ מבוסס זה מראה כי התגובה של assay AuNP ניתן לשנות על ידי שינוי הצפיפות של DNA מוחל על פני השטח, ומשמש כהוכחה של עיקרון עבודה להקדיש מאמצי מחקר עתידיים לפיתוח חיישנים הביולוגיים AuNP מבוסס aptamer מולקולה קטנה ב נוזלים פיסיולוגיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="639">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:203px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dynabeads M280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>112.06D</td>
			<td style="width:203px;">Compatible with DynaMag-2 Magnet</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td style="width:203px;">Compatible with Dynabeads M280 Streptavidin</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Streptavidin Sepharose High Performance</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5113-01</td>
			<td style="width:203px;">This is a high density streptavidin product for ssDNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H4001</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Progesterone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td>P0130</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cholic Acid</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1129</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NanoDrop ND-1000</td>
			<td style="width:103px;">NanoDrop</td>
			<td style="width:119px;">ND-1000</td>
			<td style="width:203px;">Replaced by ND-2000 model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris Base</td>
			<td style="width:103px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">H5135</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9888</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td style="width:103px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">63068</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">500 mL Filter System</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430769</td>
			<td style="width:203px;">0.22 &#181;m cellulose acetate membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNA Library</td>
			<td style="width:103px;">Operon</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td style="width:203px;">HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">All other DNA</td>
			<td style="width:103px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td style="width:203px;">Capture probes and primers- desalted; Aptamers- HPLC</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">R</td>
			<td style="width:203px;">Any model with&#160; temperature and mixing speed control will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn</td>
			<td style="width:103px;">Agilent</td>
			<td>600674</td>
			<td style="width:203px;">Taq polymerase can be used as well</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Agilent</td>
			<td>200415</td>
			<td style="width:203px;">Other brands will work here</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x Cloned Pfu DNA Polymerase Buffer</td>
			<td style="width:103px;">Agilent</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:119px;">200532</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">This buffer was optimized for PfuUltra II polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">GeneAmp PCR System</td>
			<td style="width:103px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">9700</td>
			<td style="width:203px;">Any model that allows researcher to open lid for cycle optimization will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose-LE</td>
			<td style="width:103px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9040</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E-1510</td>
			<td style="width:203px;">Acute toxicity, inhalation; suspected carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Empty Synthesis Columns, 1 &#181;m Expedite Style</td>
			<td style="width:103px;">Glen Research</td>
			<td style="width:119px;">20-0021-01</td>
			<td style="width:203px;">This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replacement Filters Expedite</td>
			<td style="width:103px;">Glen Research</td>
			<td style="width:119px;">20-0021-0F</td>
			<td style="width:203px;">1 &#181;m size</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Illustra NAP-25 Columns</td>
			<td style="width:103px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0852-01</td>
			<td style="width:203px;">Any brand with DNA grade resin gel filtration column will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">66205</td>
			<td style="width:203px;">2k MWCO used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gold(III) chloride hydrate</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">254169</td>
			<td style="width:203px;">99.999% purity is important</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td style="width:103px;">SAFC</td>
			<td style="width:119px;">W302600</td>
			<td style="width:203px;">We have found that the compound produced from different manufacturers greatly affects AuNP assays</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SpectraMax&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">M5</td>
			<td style="width:203px;">Results were similar to Bio-TEK system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Synergy</td>
			<td style="width:103px;">Bio-TEK</td>
			<td style="width:119px;">HT</td>
			<td style="width:203px;">Results were similar to Molecular Devices system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES Buffer</td>
			<td style="width:103px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">J848</td>
			<td style="width:203px;">Any brand that makes a sterilized product will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">250 mL Filter System</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430767</td>
			<td style="width:203px;">0.22 &#181;m cellulose acetate membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV Spectrophophotometer</td>
			<td style="width:103px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;">Cary 300&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Other brands will work here</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">5 mL Syringe</td>
			<td style="width:103px;">Becton-Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309646</td>
			<td style="width:203px;">This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with Expedite column</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ThermoEC Minicell Primo</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EC320</td>
			<td style="width:203px;">Compatible with Power Supply</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Power Supply</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB300</td>
			<td style="width:203px;">Compatible with ThermoEC Minicell Primo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td style="width:203px;">Flammable liquid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 Methoxynaphthalene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">148245</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Assay Plate</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3370</td>
			<td>96-well Flat Bottom, Sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for selecting structure-switching aptamers applied to a colorimetric gold nanoparticle assay

מולקולות קטנות לספק מטרות עשירות עבור יישומי biosensing בשל ההשלכות הפיזיולוגיות שלהם כסמנים ביולוגיים של היבטים שונים של בריאות וביצועים אנושיים. aptamers חומצות גרעין יושמה יותר ויותר כאלמנטים הכרה בפלטפורמות biosensor, אבל בחירת aptamers למטרות מולקולה קטנות דורשת שיקולי עיצוב מיוחדים. עבודה זו מתארת ​​שינוי ושלבים קריטיים של שיטה שנועדה לבחור aptamers-מיתוג מבנה למטרות מולקולה קטנות. רצפים מחייבים מספריית ה- DNA הכלאה לבדיקות DNA לכידה משלימות בחרוזים מגנטיים מופרדים מnonbinders באמצעות שינוי מושרה יעד בקונפורמציה. שיטה זו יש יתרון משום שרצפים מחייבים מטריצת התמיכה (חרוזים) לא יהיו מוגברים יותר, והיא אינה דורשת קיבוע של מולקולת היעד. עם זאת, טמפרטורת ההתכה של חללית הלכידה והספרייה נשמר באו מעט מעל RT, כזה שלא רצפיםdehybridize הכובע מבוסס על תרמודינמיקה גם יהיה נוכח בפתרון supernatant. זה למעשה מגביל את יעילות המחיצות (יכולת היעד נפרד מחייבת רצפים מnonbinders), וסיבובי בחירה לכן רבים יידרשו כדי להסיר רצפי רקע. שיטת הדיווח שונה מבחירות aptamer-מיתוג מבנה קודם בגין יישום צעדי סלקציה שליליים, ניטור העשרה פשוטה, והארכת משך הבדיקה הלכידה הבאה העשרת מבחר לספק חומרה משופרת. Aptamers-מיתוג המבנה שנבחרה היא יתרון בפלטפורמת assay ננו-חלקיקי זהב שמדווחת על הנוכחות של מולקולת מטרה על ידי השינוי קונפורמציה של aptamer. Assay ננו-חלקיקי הזהב יושם משום שהוא מספק קריאה פשוטה, מהירה colorimetric כי הוא מועיל בסביבה קלינית או לפרוס. שיקולי עיצוב ואופטימיזציה מוצגים עבור assay כהוכחה של principlעבודת דואר במאגר לספק בסיס להרחבה נוספת של העבודה לקראת biosensing מולקולה הקטן בנוזלים פיסיולוגיים.

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay at JoVE.com

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

שיטה לבחירת Aptamers מיתוג מבנה יישומית לColorimetric זהב Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

a-method-for-selecting-structure-switching-aptamers-applied-to

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K Views.  Wright-Patterson Air Force Base. A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Video: A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

המרת ELISA ללכוד Assay Luminex Xmap באמצעות נוגדן Multiplex שיטת הקרנה

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Whole-Body Nanoparticle Aerosol Inhalation Exposures

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle inhalation toxicology studies, the aerosols in a chamber housing the experimental animals must have: 1) a steady concentration maintained at a desired level for the entire exposure period; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable size distribution with a geometric mean diameter &lt; 200 nm and a geometric standard deviation &sigma;g &lt; 2.5 5. The generation of aerosols containing nanoparticles is quite challenging because nanoparticles easily agglomerate. This is largely due to very strong inter-particle forces and the formation of large fractal structures in tens or hundreds of microns in size 6, which are difficult to be broken up. Several common aerosol generators, including nebulizers, fluidized beds, Venturi aspirators and the Wright dust feed, were tested; however, none were able to produce nanoparticle aerosols which satisfy all criteria 5.
A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure system was fabricated, validated and utilized for nano-TiO2 inhalation toxicology studies. Critical components: 1) novel nano-TiO2 aerosol generator; 2) 0.5 m3 whole-body inhalation exposure chamber; and 3) monitor and control system. Nano-TiO2 aerosols generated from bulk dry nano-TiO2 powders (primary diameter of 21 nm, bulk density of 3.8 g/cm3) were delivered into the exposure chamber at a flow rate of 90 LPM (10.8 air changes/hr). Particle size distribution and mass concentration profiles were measured continuously with a scanning mobility particle sizer (SMPS), and an electric low pressure impactor (ELPI). The aerosol mass concentration (C) was verified gravimetrically (mg/m3). The mass (M) of the collected particles was determined as M = (Mpost-Mpre), where Mpre and Mpost are masses of the filter before and after sampling (mg). The mass concentration was calculated as C = M/(Q*t), where Q is sampling flowrate (m3/min), and t is the sampling time (minute). The chamber pressure, temperature, relative humidity (RH), O2 and CO2 concentrations were monitored and controlled continuously. Nano-TiO2 aerosols collected on Nuclepore filters were analyzed with a scanning electron microscope (SEM) and energy dispersive X-ray (EDX) analysis.
In summary, we report that the nano-particle aerosols generated and delivered to our exposure chamber have: 1) steady mass concentration; 2) homogenous composition free of contaminants; 3) stable particle size distributions with a count-median aerodynamic diameter of 157 nm during aerosol generation. This system reliably and repeatedly creates test atmospheres that simulate occupational, environmental or domestic ENM aerosol exposures.

A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure facility was constructed for nano-sized titanium dioxide (TiO2) inhalation toxicology studies. This system provides nano-TiO2 aerosol test atmospheres that have: 1) a steady mass concentration; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable particle size distribution during aerosol generation.

כיווני שאיפת תרסיס Nanoparticle כל הגוף

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without breaching the collagenous basement membrane. While DCIS is a non-obligate precursor to invasive breast cancers, the molecular mechanisms and cell populations that permit progression to invasive cancer are not fully known. To determine if progenitor cells capable of invasion existed within the DCIS cell population, we developed a methodology for collecting and culturing sterile human breast tissue at the time of surgery, without enzymatic disruption of tissue.
Sterile breast tissue containing ductal segments is harvested from surgically excised breast tissue following routine pathological examination. Tissue containing DCIS is placed in nutrient rich, antibiotic-containing, serum free medium, and transported to the tissue culture laboratory. The breast tissue is further dissected to isolate the calcified areas. Multiple breast tissue pieces (organoids) are placed in a minimal volume of serum free medium in a flask with a removable lid and cultured in a humidified CO2 incubator. Epithelial and fibroblast cell populations emerge from the organoid after 10 - 14 days. Mammospheres spontaneously form on and around the epithelial cell monolayer. Specific cell populations can be harvested directly from the flask without disrupting neighboring cells. Our non-enzymatic tissue culture system reliably reveals cytogenetically abnormal, invasive progenitor cells from fresh human DCIS lesions.

Primary cell culture using intact tissue organoids provides a model system that mimics the multi-cellular in vivo microenvironment. We developed a serum-free primary breast epithelium tissue culture model that perpetuates mixed cell culture lineages and exhibits differentiated morphology, without enzymatic tissue disruption. Breast organoids remain viable for &#62;6 months.

אינו אנזימטית, תרבות רקמות סרום ללא נגעי שד טרום פולשני לדור ספונטני של Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

עיצוב ופיתוח של מבוסס Nanoparticle Aptamer-זהב מדד-צבע מבחנים עבור יישומי in-the-השדה

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &amp;#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

ממברנות שומנים דו-שכבתיות קשורות לניטור העברת חום בין חלקיקי זהב וממברנות שומנים

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

ניתוח מעקב חלקיקים לכימות וקביעת גודל של שלל חוץ-תאי

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...